透过表象：利用延时显微镜与单细胞纵向追踪研究抗癌治疗药物

摘要

本文介绍了一种长期延时显微镜方法，用于纵向追踪单个细胞对抗癌治疗药物的反应。

摘要

单个细胞对抗癌药物的反应在决定群体反应中起着重要作用，因此是最终治疗效果的主要影响因素之一。免疫印迹、流式细胞术和固定细胞实验常被用于研究细胞对抗癌药物的反应。这些方法虽然重要，但仍存在若干局限性。由于癌细胞与正常细胞之间、不同来源的癌细胞之间在药物反应上存在差异，且部分反应具有短暂性或稀有性，若依赖群体平均化检测方法，且无法对细胞进行长期直接追踪与分析，则难以全面理解这些现象。显微镜特别适用于活细胞成像。技术的进步使我们能够常规地以高分辨率对细胞进行成像，不仅可实现细胞追踪，还能观察多种细胞反应。本文详细描述了一种可在药物处理期间对细胞进行持续延时成像的方法，成像时间可根据需要尽可能延长，通常可达96小时；通过该方法的变体，甚至可将细胞监测数周。结合使用基因编码的荧光生物传感器，可同时追踪多种细胞过程、信号通路及生物学反应。我们展示了若干应用实例，包括细胞生长与细胞周期进程的追踪与定量、染色体动态变化、DNA损伤以及细胞死亡的监测。此外，我们还讨论了该技术的多种变体及其灵活性，并指出了某些常见的技术误区。

引言

活细胞显微镜观察与单细胞的长期追踪并非新技术。自最早的显微镜问世以来，科学爱好者和研究人员便已开始观察和研究单个细胞及生物体，以及它们的行为与发育过程^1-3。20世纪50年代范德比尔特大学已故的大卫·罗杰斯（David Rogers）曾拍摄到一个著名实例：在血涂片中，一个人类中性粒细胞追逐金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），并最终完成吞噬过程⁴。这段活细胞影像极好地展示了如何在单次实验中同时观察并关联多个生物学过程：化学梯度的感知、细胞运动的力学机制与速度、细胞形态的动态变化、黏附作用以及对病原体的吞噬作用。

全自动显微镜和高灵敏度数字相机的出现，使得越来越多的研究人员开始利用显微技术探讨细胞生物学中的基本问题，例如细胞如何运动^5,6 并分装^7,8 细胞器动力学和膜运输^9-11非荧光的明场显微镜技术，包括1953年因弗里茨·泽尼克（Frits Zernike）的贡献而获得诺贝尔奖的相衬显微技术（PC），以及微分干涉差显微技术（DIC），可用于观察细胞和细胞核，也可用于观察微管束、染色体、核仁、细胞器动态以及较粗的肌动蛋白纤维等亚细胞结构。¹²基因编码的荧光蛋白以及针对细胞器的荧光染料的开发极大地推动了活细胞延时显微成像技术的发展^13-15虽然不是本文的重点，但在细胞球状体中的成像以....

方案

 以下方案采用由实验所定义的参数 图4 和 6 关于采集设置和实验条件。许多参数可根据其他实验的需求进行调整（即， 曝光时间、像素合并、荧光通道 等等）。所有操作必须遵守机构指南和规定，并经机构生物安全委员会批准。显微镜制造商的网站提供了活细胞成像的优质信息。

1. 显微镜和成像软件

1. 在多种倒置显微镜上进行活细胞成像。最常见的显微镜类型包括宽场落射荧光显微镜和转盘共聚焦显微镜。此处使用配备200瓦金属卤化物光源的自动化电动宽场落射荧光显微镜。
2. 配备载物台顶部或显微镜内置的环境培养室。此处使用载物台顶部环境培养室。
3. 使用商业软件操作显微镜，并利用其功能执行延时显微成像。
4. 使用 commercially available software 或 ImageJ 进行图像分析。市面上还有多种其他分析工具，同时存在许多定制化程序，其中不少已被发表^8,18。

2. 观察细胞过程与表型响应

1. 使用明场显微镜观察细胞。微分干涉差和相差显微镜单独使用时，即可为研究抗癌药物反应提供重要信息。这些过程可包括有丝分裂、细胞运动性和细胞凋亡。
2. 利用荧光生物传感器观察细胞结构、....

结果

长期延时显微镜观察与直接纵向追踪可用于研究药物反应过程中多种抗癌效应。根据图1中的总体流程，展示了多个表达经验证荧光报告基因的细胞示例，这些细胞经抗癌药物处理后，通过不同方法进行追踪与分析。

仅使用相差显微镜即可获得大量信息，能够可靠地反映细胞间期与有丝分裂期的区别、有丝分裂持续时间及阻滞、异常细胞分裂以及细胞死亡^21,23,24。靶向细胞分裂过程的药物，通常称为抗有丝分裂药物，目前仍在持续开发中。图2以及视频1和2展示了两株配对的乳腺癌来源MCF7细胞系在p53状态不同情况下的示例，这些细胞经500 nM浓度的抗癌药物处理，该药物靶向并抑制有丝分裂马达蛋白Kinesin-5（KSP1, Kif11, Eg5），导致有丝分裂延长²⁰。野生型MCF7细胞（图2A）是研究p53依.......

讨论

延时显微镜与纵向追踪的优势

显微镜是进行药物反应纵向研究的理想工具，因为它使研究人员能够追踪单个细胞及其命运，同时也能观察整个细胞群体。细胞群体内药物反应的异质性是抗癌治疗设计中的一个主要问题。对单个细胞进行长期追踪，可使研究人员观察到这种异质性，并开始理解其与细胞群体相关的潜在机制和后果。利用多种荧光探针，可以多角度地观察和理解常见及罕见的反应表型。例如，可以了解不同细胞命运对群体反应的时间动态和贡献、特定表型与命运之间的关系，以及不同细胞系之间或处理状态下反应的差异。许多与癌症相关的过程均可通过该方法进行研究。本文未重点提及的一些例子包括：使用凋亡、自噬和坏死报告系统研究细胞死亡^39-42、细胞侵袭^43,44，以及决定细胞命运的p53动态变化²⁷。此外，该方法不仅限于抗癌药物治疗的研究，还可应用于其他多种生物学过程的研究，例如有丝分裂⁴⁵、细胞骨架动态^46,47和细胞内信号传导⁴⁸。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
紫杉醇（Paclitaxel）	Sigma	T7191	微管稳定药物
依托泊苷	Selleckchem	S1225	拓扑异构酶II抑制剂
Selinexor	Karyopharm Therapeutics	na	XPO1/CRM1抑制剂，赠品
驱动蛋白-5抑制剂	Merck Serono	na	赠品，也可从American Custom Chemicals Corporation获得。CAS 858668-07-2
细胞培养基	HyClone (Fisher) 或 Mediatech		多家公司有售
5% CO2/空气平衡气体，经认证	Airgas	Z03NI7222004379
35 mm 培养皿，20 mm 玻璃底	Cellvis	D35-20-1.5-N	多家公司有售
35 mm 4孔培养皿，20 mm 玻璃底	Cellvis	D35C4-20-1.5-N	多家公司有售
35 mm 培养皿，带网格玻璃底	MatTek	P35G-2-14-CGRD	多家公司有售
多孔板，玻璃底	Cellvis	P12-1.5H-N	多家公司有售
Olympus IX81 倒置落射荧光显微镜	Olympus
Olympus IX2-UCB 控制器	Olympus
PRIOR LumenPro200	Prior Scientific	Lumen200PRO
PRIOR Proscan III 电动载物台	Prior Scientific	H117
STEV 培养室	InVivo Scientific	STEV.ECU.HC5 STAGE TOP
环境控制器单元	InVivo Scientific	STEV.ECU.HC5 STAGE TOP
Hamamatsu ORCA R2 CCD 及控制器	Hamamatsu	C10600
Nikon Eclipse Ti	Nikon
Nikon 激光发射装置	Nikon
SOLA 光源引擎	lumencor
iXon Ultra 897 EM-CCD	ANDOR
TOKAI HIT 培养室	TOKAI HIT	TIZSH