需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

一种适用于药物发现的无酶无血清神经干细胞培养模型用于EMT研究

9K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/54018

⸱

2016年8月23日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Dept. of Biomedicine, Pharmacenter, University of Basel, 2Molecular Signalling and Gene Therapy, Narayana Nethralaya Foundation, Narayana Health City, 3Brain Ischemia and Regeneration, Department of Biomedicine, University Hospital Basel, 4Department of Neurosurgery, Klinikum Idar-Oberstein, 5Department of Neurosurgery and Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University, 6Department of Neurology, Laboratory of Molecular Neuro Oncology, University Hospital of Zurich

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

上皮-间质转化（EMT）使癌症细胞获得侵袭能力。为研究EMT，可采用基于神经干细胞（NSC）的方法 体外 一种无血清且不含酶的模型被描述。该标准化系统可用于细胞迁移、基因和蛋白表达的定性与定量评估。该模型适用于药物发现。

摘要

上皮-间质转化（EMT）是指上皮细胞转分化为间质细胞的过程。EMT 是胚胎发育过程中的基本事件，也常见于胶质母细胞瘤——最常见的一种恶性脑肿瘤。此外，EMT 还见于多种颅外癌瘤，包括乳腺癌、肺癌、结肠癌和胃癌。EMT 通过促进细胞迁移、侵袭及转移形成，在恶性肿瘤的发生发展中起核心作用。然而，EMT 诱导机制尚未完全阐明。本文描述了一种 体外 标准化分离皮层神经干细胞（NSCs）及后续EMT诱导的系统。该系统具有灵活性，可选择使用单细胞或组织块培养。在此系统中，大鼠或小鼠胚胎前脑NSCs在无血清、无酶的限定培养基中培养。NSCs表达Olig2和Sox10，这两种转录因子在少突胶质细胞前体细胞（OPCs）中可见。利用该系统，可研究FGF、BMP与TGFβ信号通路之间的相互作用 Zeb1, Zeb2，以及 Twist2 在TGFβ激活显著增强细胞迁移的区域观察到上述现象，提示BMP与TGFβ之间存在协同相互作用。结果表明，FGF、BMP和TGFβ信号通路网络参与了EMT的诱导与维持。该模型系统适用于研究EMT 体外成本低廉且具有高度可重复性。该模型还允许对不同化合物的迁移反应进行比较（定量距离测量），以及对抑制或增强EMT的化合物进行高通量筛选（定性测量）。因此，该模型非常适合用于药物库中影响EMT物质的检测。

引言

在胚胎发育的多个阶段，上皮细胞会失去彼此之间的强黏附性（例如，紧密连接），并获得迁移表型，这一过程称为上皮-间充质转化（epithelial to mesenchymal transition, EMT）1。EMT 对于生成多种新细胞类型至关重要，例如间充质来源的神经嵴细胞，这类细胞从神经上皮中分离出来2。EMT 不仅在胚胎发育过程中必不可少，也在成体生命后期维持机体生理过程（如伤口愈合3以及脱髓鞘病变中中枢神经系统（CNS）的再生4）中发挥重要作用。

上皮性肿瘤已知会重新激活上皮-间质转化（EMT），作为迁移、侵袭和转移的起始步骤，最终导致癌症进展1,3。事实上，EMT 与强烈的迁移能力密切相关1,3。然而，细胞在准备、启动、经历和维持 EMT 过程中的具体步骤尚未完全阐明，仍需进一步研究。

此处，一种标准化的 体外 基于神经干细胞（NSCs）的EMT模型系统，采用明确的生长因子和培养基（无血清、无需酶）构建。该模型系统对从事EMT研究的科研人员具有重要意义。Snail、Zeb和Twist蛋白家族已被证实无论在发育过程还是疾病状态下均对EMT起关键作用1蜗牛（Snail）、Zeb 和 Twist 家族也参与了该系统。该系统基于前脑的一个特定区域，该区域通常不发生上皮-间质转化（EMT），从而为研究 EMT 诱导初期事件提供了独特优势。

该模型系统有可能被用于研究中枢神经系统以外上皮组织中的上皮-间质转化（EMT），因为关键的EMT诱导因子（如Snail、Zeb和Twist蛋白）在中枢神经系统外组织系统的EMT过程中同样存在。该模型系统可实现从发育中的大脑皮层中标准化地分离神经干细胞（NSCs），从而用于研究干细胞的一般特性以及上皮-间质转化的具体机制。利用该系统，我们分离了神经干细胞，诱导其发生上皮-间质转化，并研究了在FGF2和BMP4作用下细胞的后续迁移行为。我们观察到，FGF信号通路和BMP信号通路与TGFβ信号通路相互作用，促进细胞迁移，从而验证了该模型系统的有效性。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有动物实验均遵循《实验动物护理与使用指南》（NIH 出版物，第8th版，2011年），并经巴塞尔动物福利委员会（瑞士实验动物护理与使用指南）批准。根据这些指南，该动物实验方案被归类为"最低动物伤害等级"。

1. 扩增培养基的制备

注意：应在无菌条件下操作，这是组织培养的标准要求。

  1. 取两个15 ml离心管，从500 ml培养基瓶中分别向这两个15 ml离心管中各加入5 ml无L-谷氨酰胺的DMEM/F12（1:1）培养基。向第一个15 ml离心管中加入50 mg人无转铁蛋白（apo-transferrin）、50 μl 1 M亚精胺储备液（终浓度0.1 mM）和30 μl 500 µM硒酸钠储备液（终浓度30 nM）。
    1. 使用0.2 µm针头滤器过滤，收集至原始的DMEM/F12培养基瓶中。
  2. 向第二个15 ml离心管中加入12.5 mg胰岛素。加入6–9滴1 M NaOH。涡旋振荡使胰岛素完全溶解。使用0.2 µm针头滤器过滤，收集至原始的DMEM/F12培养基瓶中。
    注意：NaOH具有毒性和腐蚀性。操作时需佩戴防护手套、防护服和安全护目镜。
  3. 向DMEM/F12培养基瓶中加入5 ml青霉素（10,000单位/ml）/链霉素（10,000 µg/ml）/两性霉素B（25 µg/ml）混合液。
  4. 向DMEM/F12培养基瓶中加入5 ml新鲜解冻的200 mM L-谷氨酰胺储备液，或含谷氨酰胺的寡肽（200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽）。
  5. 充分摇匀。分装成每份50 ml。
    注意：扩增培养基可在4 °C下保存至少2周。分装后的管装培养基相比保存在500 ml瓶中的培养基，pH变化更小。

2. 传代培养基的制备

  1. 向 1 L 无 Ca2+ 和 Mg2+ 的 HBSS 培养基中加入 990.85 mg 葡萄糖（终浓度为 5 mM）和 840.10 mg NaHCO3（终浓度为 10 mM）。用 HCl（1 M 储液）调节 pH 至 7.3。使用 0.2 µm 滤器过滤除菌，并分装为每份 50 ml。
    注意：传代培养基可在 4 °C 下保存至少 4 周。

3. 生长因子的制备

  1. 制备无菌的含1% BSA的1× PBS（PBS-BSA），或含4 mM盐酸（HCl）的PBS-BSA（PBS-BSA-HCl）。
    注意：HCl具有腐蚀性和毒性，需采取特殊安全措施（穿实验服、戴护目镜、手套、在通风橱中操作）。
  2. 将10 µg/ml重组人成纤维细胞生长因子2（rhFGF2）溶于PBS-BSA中（终浓度为10 ng/ml），将10 µg/ml重组人骨形态发生蛋白4（rhBMP4）溶于PBS-BSA中（终浓度为10 ng/ml），将20 µg/ml重组人转化生长因子β1（rhTGFβ1）溶于PBS-BSA-HCl中（终浓度为40 ng/ml）。
    1. 不要进行过滤除菌。分装保存。
      备注：生长因子分装样品可在-20 °C保存至少2年。

4. 细胞培养皿的包被

  1. 将1,875 mg多聚-L-鸟氨酸（PLO）溶于500 ml蒸馏H2O中，配制250倍PLO储备液。使用0.2 µm注射器滤器过滤除菌，并分装为2 ml每份。
    注意：这些分装液可在-20 °C保存至少2年。
  2. 将1 mg牛纤维连接蛋白溶于1 ml无菌蒸馏H2O中，配制1,000倍纤维连接蛋白储备液。切勿涡旋，以免导致黏性蛋白凝结。手动轻轻摇晃10分钟。
    1. 室温孵育1小时，期间偶尔摇动。检查是否完全溶解。若需完全溶解纤维连接蛋白，可将溶液加热至低于37 °C。切勿过滤除菌。
      注意：该溶液可在4 °C保存最多6个月。
  3. 使用经等离子预处理的塑料细胞培养皿（100 mm或其他实验所需尺寸）。如需评估细胞迁移，使用带有500 µm网格的35 mm培养皿。在5% CO2细胞培养箱中，于37 °C条件下，用2 ml 1倍PLO孵育培养皿过夜（12小时）。随后用2 ml 1倍PBS洗涤两次。
  4. 加入2 ml 1倍纤维连接蛋白（终浓度为1 μg/ml），在5% CO2培养箱中37 °C孵育至少12小时。在接种细胞前去除纤维连接蛋白溶液。
    注意：包被纤维连接蛋白的培养皿可在37 °C保存至少2周。

5. 大脑皮层下室带（SVZ）的标准解剖与制备

  1. 通过定时交配获取大鼠胚胎第14.5天（E14.5，Sprague-Dawley）和小鼠胚胎第13.5天（E13.5，C57BL/6）的胚胎。将动物在18:00至次日08:00期间进行交配。交配当天中午定为E0.5。
  2. 使用5%异氟烷和0.8 L/min的氧气流对怀孕动物进行麻醉。用锐利的解剖镊子压迫足掌以检查反应。随后将动物断头处死。避免使用CO2窒息法，因为CO2会影响干细胞的回收。
  3. 通过剖宫产取出胚胎。
    1. 将动物置于仰卧位，并用70%乙醇对毛发进行消毒。使用手术镊和剪刀在子宫上方的下腹部做约8 cm的V形皮肤切口。仅切开带毛的皮肤，保持肌层完整。
    2. 使用新的镊子和剪刀切开肌肉及腹壁肌肉层，进入腹膜腔。
    3. 在下后部腹膜中识别子宫，并通过锐性分离将其从周围组织中完整取出。
    4. 用无菌1×PBS清洗带有胚胎的子宫，并将其置于冰上预冷的1×PBS中。
    5. 在解剖显微镜下（3倍放大，图1B），使用尖头剪刀逐个打开子宫壁以释放胚胎。用一对镊子去除胚胎外壳（图1B）。将胚胎保持在冰上的扩增培养基中。
    6. 通过《发育中大鼠神经系统图谱》5确认正确的发育阶段。正确大小的胚胎如图1B所示。
    7. 进一步通过大鼠前肢（FL）开始出现指状结构来确认胚胎年龄，如图1A所示。
      注：后肢（HL）尚未出现趾的分离（图1B）。
  4. 进行解剖时，将胚胎转移至盛有冰上预冷1×PBS的未包被培养皿中。在体视解剖显微镜下（3至20倍放大）使用经高压灭菌的精细镊子进行操作。
    注：使用培养皿可防止组织附着于器皿表面，而血浆包被的细胞培养皿则可能发生此类附着。在某些解剖步骤中，使用磨尖的钨丝针或其他类似工具也有帮助。
  5. 从端脑（TEL）与间脑（DI）交界处开始（图1B），用两把镊子同时向头侧和尾侧牵拉，去除头部皮肤和颅骨，以暴露发育中的神经管（图1C）。
  6. 识别中脑-后脑边界（MHB，图1B-D中的黑箭头），该边界将中脑（MES）与菱脑分隔开来。在MHB处或稍下方切断菱脑（图1D，三角箭头）。
    ​注：MHB处额外的皮下空间有助于在不损伤神经管的情况下去除皮肤。
  7. 在颅底处切断端脑/间脑与面部骨骼之间的连接（图1E），从而获得包含端脑、间脑和中脑（TEL-DI-MES）的组织块（图1F-H）。
  8. 将TEL-DI-MES组织块转移至冰上的扩增培养基中，确保其完全浸没在未包被的培养皿中的扩增培养基内。用一对镊子夹住中脑部分，避免触碰含有神经干细胞（NSCs）的端脑室下区（SVZ）。
  9. 对所有胚胎重复步骤5.5至5.8（图1F-H）。
  10. 将一个TEL-DI-MES组织块转移至新鲜的冰上预冷1×PBS中。沿前部中脑的虚线（图1F-H）切割，将中脑与间脑分离，如图1I所示。
  11. 沿图1F中的虚线切割，将DI与TEL分离。分离后的端脑见图1J。
  12. 沿图1J中的虚线将两个端脑半球分开，得到如图1K所示的两个独立半球。
    注：左半球在图1L中被放大显示。
  13. 通过未来的室间孔可观察到内侧神经节隆起（MGE，图2A；*）和外侧神经节隆起（LGE，图2A；+）。
    1. 使用镊子或针具，沿MGE与LGE和前皮层（ant-ctx，图2B）交界处做直线切开，穿过皮层、海马（hip）和脉络丛（CP），从而将包括嗅球（ob）在内的前皮层与神经节隆起（GE，图2B、C）分离。
  14. 在尾侧神经节隆起（CGE，图2C、D）与后皮层（图2C）交界处做第二条直线切口，同样穿过皮层、海马和脉络丛。
  15. 将端脑展平，完全去除后极和嗅球（图2D）。识别包含海马和脉络丛的皮层半区（图2C），其定义如前文所述6,7。
    ​注：海马的神经上皮比皮层更薄。脉络丛含有红色血管。
    1. 将皮层半区从皮层上分离，使剩余皮层的大小与神经节隆起的大小一致（图2D），最终得到一块皮层组织（目标组织）和神经节隆起（GE，图2D）。
  16. 将皮层-GE组织块翻转，使脑室面（内侧）朝下贴附于培养皿表面。
    注：半球的外表面将面向操作者（图2E），其上附有含血管的脑膜（图2E）。
    1. 用左手将GE固定在培养皿表面，右手（优势手）持镊子剥离脑膜（图2F）。
      注：这是技术上最具挑战性的步骤，因为脑膜与皮层粘连紧密。在步骤5.13.1和5.14中保持完全平直（非锯齿状）的切口有助于脑膜与皮层的分离。
  17. 对另一侧半球及所有胚胎重复步骤5.12至5.16。沿LGE边缘，在距离LGE主直径一半的位置进行切割（图2G, 2H）。分离后的皮层面积约为1.2 mm × 2.4 mm（图2H），包含具有神经干细胞（NSCs）的室下区/生发层。

6. 外植体培养物的制备

  1. 将皮层切成直径小于 400 µm 的组织块（图 2I）。将 400 µm 网格（补充图 1）置于解剖用培养皿下方作为参考（图 2H 和 图 2I）。将所有组织块转移至盛有冰冻扩增培养基的新培养皿中。
  2. 从组织培养皿中去除纤连蛋白（步骤 4.4）。使其自然干燥。向直径为 35 mm、网格尺寸为 10 mm × 10 mm 的培养皿中央加入 1 ml 冷扩增培养基（图 3）。让培养基形成球形液滴（图 3）。
  3. 将最多 8 个组织块插入液滴中心。为便于迁移分析（见第 8 节），组织块应理想地位于网格上，且彼此之间至少相距 3 mm。
  4. 将培养皿置于细胞培养箱中孵育约 1 小时（37 °C，21% O2，5% CO2），以使组织块贴附。让组织块自然沉降并贴附于纤连蛋白包被的表面。切勿振荡培养皿，以免组织块脱落并偏离最佳网格中心位置。
  5. 孵育 1 小时后（37 °C，21% O2，5% CO2），向培养皿中补充培养基至总体积为 2 ml 扩增培养基，并加入待测试的生长因子或目标物质，继续孵育。
    注意：组织块制备过程中无需酶消化、血清处理或离心步骤。此方法有利于维持细胞完整性。

7. 神经干细胞单细胞培养的制备

  1. 将扩增和传代培养基在 37 °C 预热。
  2. 将解剖得到的皮质组织块（来自步骤5.17）转移至含有冷的扩增培养基的15 ml离心管中（管A）。在1,200 × g条件下离心5分钟。吸除上清液。加入200 µl预热的扩增培养基重悬皮质组织块。
  3. 向含有组织沉淀的15 ml离心管（管A）中加入700 µl预热的传代培养基，使用P1,000移液器吸头。轻柔重悬沉淀。将吸头置于15 ml离心管底部，用P1,000吸头缓慢、轻柔地吸取三次，以解离组织块。
    注意：传代培养基可促进细胞分离，避免使用酶。
  4. 让离心管静置30至60秒，使较大（较重）的未解离组织块沉降到管底。单个解离的细胞将保留在上清液中。将约700 µl上清液转移至新的15 ml离心管（管B）中。
  5. 重复步骤 7.3 和 7.4 以解离较大的组织块。
  6. 重复步骤 7.3 和 7.4 一次，以进一步解离较大的组织块。将所有上清液转移至新的 15 ml 管中（管 B）。
  7. 加入扩增培养基至终体积5 ml。使用血细胞计数板对细胞进行计数。通过台盼蓝染色评估死细胞。
    注意：小型神经干细胞（NSCs）比大型细胞更能耐受步骤 7.2 至 7.6。预计每 10 个胚胎可获得约 4 × 106 含10%死细胞的细胞
  8. 为扩增NSCs，接种1.5 × 106 每10 cm纤维连接蛋白包被的组织培养皿中加入8 ml扩增培养基，接种相应数量的细胞。常规扩增时，添加8 µl 1,000倍浓缩的重组人FGF2（rhFGF2）原液。每天添加8 µl rhFGF2，每隔一天更换培养基。
    注意：在此发育阶段，皮层主要含有神经干细胞（NSCs），仅含有少量分化细胞。这些少量的分化细胞对重组人成纤维细胞生长因子2（rhFGF2）处理无反应，并在扩增培养过程中死亡。
  9. 60% 汇合度下扩增的神经干细胞
    1. 传代NSCs时，移除扩增培养基，用5 ml传代培养基快速洗涤细胞3次，静置2–4分钟，无需Ca2+ 和 Mg2+ 细胞会缓慢地从表面脱离并变圆。在相差显微镜下确认细胞是否已脱离。如有需要，继续等待数分钟，直至观察到细胞完全从表面脱离。
      注意：单个细胞将完全脱落，但大多数细胞仍会附着在培养皿表面。细胞脱落所需时间取决于纤连蛋白包被的持续时间。较短时间的纤连蛋白包被（12小时或更短）会导致细胞更快脱落。对于较长时间的实验（> 建议使用超过24小时的纤连蛋白包被（1周）。
  10. 使用10 ml移液管轻轻将细胞从表面脱离。收集含有细胞的5 ml传代培养基，并转移至新的15 ml离心管中。再用额外的5 ml传代培养基重复此步骤。
  11. 用移液器将15 ml离心管中的细胞轻轻吹打3次以解离细胞，移液时将10 ml移液器置于管底。在室温下以1,200 x g离心15分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于2 ml扩增培养基中。使用血细胞计数板进行细胞计数，并用台盼蓝染色评估死细胞比例。
    ​注意：扩增至 60% 融合度后，预计可获得 4 - 5 x 106 细胞死亡率约为10%。
  12. 接种 8 × 105 每10 cm培养皿接种细胞，用于后续传代。

8. 迁移能力评估

  1. 进行迁移评估时，按照第5节所述方法分离外植体。将外植体接种至35 mm带网格的培养皿中。接种后1小时，加入FGF2（rhFGF2）。将培养皿置于37 °C培养箱中培养2天。
    ​注意：为确保外植体最佳贴壁效果，请避免移动培养皿。
  2. 使用1,000 µl枪头吸除培养基。从内圈开始，用1,000 µl枪头分次加入共2 ml扩增培养基（图3），以降低外植体表面张力。
  3. 根据实验需求单独或联合添加生长因子。以FGF2/BMP4/TGFβ1作为阳性对照。注意：本实验中，每个35 mm培养皿分别单独或联合添加2 µl FGF2、2 µl BMP4和4 µl TGFβ1（图5）。
    1. 添加其他因子和/或待测物质。再次将培养皿静置，在37 °C下继续培养2天。
  4. 在倒置显微镜下拍摄外植体图像。
    注意：活体外植体的相差成像效果优于固定后的细胞，但两者均可使用。
  5. 进行迁移评估时，使用支持像素测量的图像分析软件（例如，Fiji8）。
  6. 测量培养皿中500 µm网格间距对应的像素值，并将其作为内部参照标准。
  7. 以外植体中心定义为迁移起始点，测量外植体中心与最外侧10个细胞组成的细胞群之间的距离。
    注意：所有细胞均从外植体向外呈离心方向迁移。在本实验条件下，细胞在周边自发形成片状结构（图5）。

9. 侵袭能力评估

  1. 根据第4节方案制备纤维连接蛋白包被的组织培养24孔板。
  2. 向细胞侵袭小室的上室中加入300 µl预热的扩增培养基，在37 °C、5% CO2条件下孵育30分钟。
  3. 移除上室中的扩增培养基，并将Boyden小室放入已包被的24孔板中。
  4. 在下室中加入500 µl预热的扩增培养基，并加入0.5 µl rhFGF2和0.5 µl rhBMP4。
  5. 按第7节所述方法传代神经干细胞（NSCs）并进行计数。第1至第4代细胞适用于本实验。
  6. 在Boyden小室的上室中，加入300 µl预热的扩增培养基，其中含有5 × 105个细胞、0.3 µl rhFGF2和0.3 µl rhBMP4。
  7. 将接种的NSCs培养24小时。
  8. 向小室中添加额外因子和/或待测物质，继续培养细胞48小时。
    注意：若细胞具有侵袭性，它们将从上室穿过基底膜层迁移至下室，并附着在Boyden小室底部。
  9. 按照试剂盒制造商提供的方案操作。使用侵袭实验试剂盒中包含的棉签，清洗上室两次，以去除未发生侵袭的细胞。
  10. 移除孔内培养基，每孔加入500 µl扩增培养基，其中含有活细胞质膜染料及核染料DAPI。
  11. 在37 °C、5% CO2条件下孵育10分钟。
    注意：染料将分别整合至侵袭性细胞的质膜和细胞核中，以实现最佳可视化效果8。可选：若计划进行多色免疫细胞化学染色，可省略质膜染料。
  12. 移除含染料的培养基，用扩增培养基洗涤两次。使用倒置荧光显微镜观察并计数侵袭细胞，方法如前所述8。
    注意：部分侵袭细胞可能已从室底脱落并沉降至下方孔板表面，附着于包被表面。为获得完整分析结果，应将孔板表面的细胞一并计入。
  13. 移除培养基，用预冷的新鲜4% PFA固定细胞10分钟，用1× PBS洗涤3次。对侵袭细胞进行免疫细胞化学染色，步骤如前所述8-10。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

该EMT模型系统基于从发育中的神经管特定区域——中央皮质——以单细胞或组织块形式标准化分离神经干细胞（NSCs）（图1和图2）。为进行定量评估，将组织块直接接种于500 µm网格培养皿的中心位置（图3）。来自中央皮质的组织块首先在FGF2中培养两天，随后在不同组合的生长因子中继续培养两天（表1）。我们选择中央皮质作为起始区域，因其体积大于发育中神经管的其他区域。我们观察到，只有在BMP4中培养的组织块表现出迁移反应（表1和补充图2）。

接下来在特定条件下分析了podoplanin（PDPN）的表达。PDPN是一种跨膜唾液酸黏蛋白样蛋白，已被发现与多种癌症的侵袭性相关11,12 ，也在神经干细胞（NSCs）中具有类似作用8...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本研究描述了一种利用神经干细胞（NSCs）进行上皮-间质转化（EMT）分析的标准化体系（总结见补充图3）。该标准化体系确保了实验的可重复性（表1和表2）。这些神经干细胞来源于发育中的大脑皮层，而该组织在正常情况下不会发生EMT，因此有利于研究EMT的早期阶段。相比之下，肿瘤细胞因累积了多种遗传改变，可能已具备EMT特征，难以用于研究EMT的初始步骤。此外，大多数恶性肿瘤具有异质性，包含侵袭性和非侵袭性细胞，因此原发性肿瘤样本也不适合用于EMT机制的研究。本方案为EMT研究者提供了一种研究EMT诱导早期事件的新模型。本文结果显示，Zeb和Twist家族的关键EMT诱导因子是依次被激活的：在第一阶段，Zeb1和Zeb2表达上调；在第二阶段，Twist2表达上调（图6）。此前我们已证明，Snail1在BMP4处理数小时后即被上调8。我们还发现，在BMP4作用下，中枢皮层来源的神经上皮干细胞可分化为表达平滑肌肌动蛋白（SMA）和钙调蛋白（calponin）的间充质细胞9。上述结果进一步完善了先前的研究...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本研究由巴塞尔大学科学基金会和瑞士国家科学基金会（资助编号：SNF IZLIZ3_157230，授予 MHS 和 AG）提供支持。感谢：Tania Rinaldi Burkat 博士慷慨提供基础设施；Bettler 研究组全体成员在讨论和审阅中提供的意见。感谢 Gerhard Dorne（Leica Microsystems，瑞士）对 Full HD MC170 视频相机（Leica Microsystems，瑞士）进行的专业且熟练的安装。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BMP4, rhBMP4RnD Systems 314-BP-01M
牛胰岛素Sigma I1882
Boyden 小室，CytoSelect 细胞侵袭检测Cell BiolabsCBA-11024 孔板系统
带网格的细胞培养皿Ibidi 500 mm 培养皿，35 mm80156
CellMask OrangeLife TechnologiesC10045细胞膜染料，使用浓度为 1:1,000。
DAPILifeTechnologiesD1306储存浓度为 5 mg/mL，使用浓度为 1:10,000。具有致癌性，需采取适当防护措施（手套、实验服、护目镜）。
DMEM/F12 1:1 培养基瓶装Gibco Invitrogen21331-020
FGF2, rhFGF2RnD Systems233-FB-01M
纤维连接蛋白，牛源Sigma F4759
Glutamax 添加剂 Gibco Invitrogen 35050-061
具备像素测量功能的图像处理软件Fijifiji.sc/Fiji版本 2.0.0-rc-30/1.49s
HBSS 培养基Sigma H9394
人脱铁转铁蛋白SigmaT1147可能引起肺部刺激，避免吸入，需采取适当防护措施。
L-谷氨酰胺Gibco Invitrogen 25030-024
Nestin，小鼠抗 Nestin 抗体GenetexGTX26142使用浓度为 1:100，4% 多聚甲醛固定，Triton X100 浓度为 0.1%
Olig2，兔抗 Olig2 抗体由 Hirohide Takebayash 提供个人库存使用浓度为 1:2,000，4% 多聚甲醛固定，Triton X100 浓度为 0.1%
青霉素/链霉素/制霉菌素Gibco Invitrogen 15240-062
Podoplanin，小鼠抗 Podoplanin 抗体AcrisDM3614P使用浓度为 1:250，4% 多聚甲醛固定，避免使用 Triton X100
多聚-L-鸟氨酸Sigma P3655
腐胺Sigma P5780对皮肤和眼睛有刺激性，需采取适当防护措施。
亚硒酸钠Sigma S5261
Sox10，兔抗 Sox10 抗体Millipore ChemiconAB5774使用浓度为 1:200，4% 多聚甲醛固定，Triton X100 浓度为 0.1%
TGFb1, rhTGFb1RnD Systems240-B-010
未包被的培养皿Falcon Corning351029

参考文献

  1. Nieto, M. A. Epithelial-Mesenchymal Transitions in development and disease: old views and new perspectives. Int J Dev Biol. 53, 1541-1547 (2009).
  2. Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 557-568 (2008).
  3. Barriere, G., Fici, P., Gallerani, G., Rigaud, M. Mesenchymal Transition: a double-edged sword. Clin Transl Med. 4, 14(2015).
  4. Zawadzka, M., et al. CNS-resident glial progenitor/stem cells produce Schwann cells as well as oligodendrocytes during repair of CNS demyelination. Cell Stem Cell. 6, 578-590 (2010).
  5. Paxinos, G., Ashwell, K. W. S., Törk, I. Atlas of the developing rat nervous system. , 2nd edn, Academic Press. (1994).
  6. O'Leary, D. D., Chou, S. J., Sahara, S. Area patterning of the mammalian cortex. Neuron. 56, 252-269 (2007).
  7. O'Leary, D. D., Sahara, S. Genetic regulation of arealization of the neocortex. Curr Opin Neurobiol. 18, 90-100 (2008).
  8. Sailer, M. H., et al. Non-invasive neural stem cells become invasive in vitro by combined FGF2 and BMP4 signaling. J Cell Sci. 126, 3533-3540 (2013).
  9. Sailer, M. H., et al. BMP2 and FGF2 cooperate to induce neural-crest-like fates from fetal and adult CNS stem cells. J Cell Sci. 118, 5849-5860 (2005).
  10. Sailer, M., Oppitz, M., Drews, U. Induction of cellular contractions in the human melanoma cell line SK-mel 28 after muscarinic cholinergic stimulation. Anat Embryol (Berl). 201, 27-37 (2000).
  11. Wicki, A., Christofori, G. The potential role of podoplanin in tumour invasion. Br J Cancer. 96, 1-5 (2007).
  12. Wicki, A., et al. Tumor invasion in the absence of epithelial-mesenchymal transition: podoplanin-mediated remodeling of the actin cytoskeleton. Cancer Cell. 9, 261-272 (2006).
  13. Mishima, K., et al. Increased expression of podoplanin in malignant astrocytic tumors as a novel molecular marker of malignant progression. Acta Neuropathol. 111, 483-488 (2006).
  14. Motomura, K., et al. Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas. Cancer Science. 103, 1871-1879 (2012).
  15. Kono, T., et al. Immunohistochemical detection of the lymphatic marker podoplanin in diverse types of human cancer cells using a novel antibody. Int J Oncol. 31, 501-508 (2007).
  16. Raica, M., Cimpean, A. M., Ribatti, D. The role of podoplanin in tumor progression and metastasis. Anticancer Res. 28, 2997-3006 (2008).
  17. Panchision, D. M., McKay, R. D. The control of neural stem cells by morphogenic signals. Curr Opin Genet Dev. 12, 478-487 (2002).
  18. Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 178-196 (2014).
  19. Gonzalez-Perez, O., Alvarez-Buylla, A. Oligodendrogenesis in the subventricular zone and the role of epidermal growth factor. Brain Res Rev. 67, 147-156 (2011).
  20. Hu, J. G., et al. PDGF-AA mediates B104CM-induced oligodendrocyte precursor cell differentiation of embryonic neural stem cells through Erk, PI3K, and p38 signaling. J Mol Neurosci. 46, 644-653 (2012).
  21. Galvao, R. P., et al. Transformation of quiescent adult oligodendrocyte precursor cells into malignant glioma through a multistep reactivation process. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E4214-E4223 (2014).
  22. Liu, C., et al. Mosaic analysis with double markers reveals tumor cell of origin in glioma. Cell. 146, 209-221 (2011).
  23. Das, S., Srikanth, M., Kessler, J. A. Cancer stem cells and glioma. Nat Clin Pract Neurol. 4, 427-435 (2008).
  24. Modrek, A. S., Bayin, N. S., Placantonakis, D. G. Brain stem cells as the cell of origin in glioma. World J Stem Cells. 6, 43-52 (2014).
  25. Sampetrean, O., et al. Invasion precedes tumor mass formation in a malignant brain tumor model of genetically modified neural stem cells. Neoplasia. 13, 784-791 (2011).
  26. McNeill, R. S., et al. Modeling astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo using cortical astrocytes or neural stem cells from conditional, genetically engineered mice. JoVE. , e51763(2014).
  27. Lara-Padilla, E., Caceres-Cortes, J. R. On the nature of the tumor-initiating cell. Curr Stem Cell Res Ther. 7, 26-35 (2012).
  28. Busch, C., et al. BMP-2-dependent integration of adult mouse subventricular stem cells into the neural crest of chick and quail embryos. J Cell Sci. 119, 4467-4474 (2006).
  29. Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139, 871-890 (2009).
  30. McDonald, O. G., Wu, H., Timp, W., Doi, A., Feinberg, A. P. Genome-scale epigenetic reprogramming during epithelial-to-mesenchymal transition. Nat Struct Mol Biol. 18, 867-874 (2011).
  31. Rahimi, R. A., Leof, E. B. TGF-beta signaling: a tale of two responses. J Cell Biochem. 102, 593-608 (2007).
  32. Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. TGF-beta-induced epithelial to mesenchymal transition. Cell Res. 19, 156-172 (2009).
  33. Suva, M. L., Riggi, N., Bernstein, B. E. Epigenetic reprogramming in cancer. Science. 339, 1567-1570 (2013).
  34. Sullivan, R., et al. A possible new focus for stroke treatment - migrating stem cells. Expert Opin Biol Ther. , 1-10 (2015).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

探索更多文章

神经干细胞EMT诱导组织块培养细胞迁移TGFβ信号通路BMP4处理大脑皮层分离纤连蛋白包被高通量筛选
一种适用于药物发现的无酶无血清神经干细胞培养模型用于EMT研究
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。