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方法文章

通过冷冻断裂叶片组织的低温扫描电子显微镜研究光合膜的超分子结构 关键词：光合膜，超分子结构，冷冻断裂，叶片组织，低温扫描电子显微镜

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⸱

DOI：

10.3791/54066

⸱

2016年6月23日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Chemistry, Weizmann Institute of Science, 2Department of Chemical Research Support, Weizmann Institute of Science, 3Institute of Plant Sciences, Agricultural Research Organization, Volcani Center

本文内容

摘要

本文介绍了一种研究冷冻断裂植物组织的方法。将高压冷冻的叶片样品进行冷冻断裂并双层镀膜，获得保存良好的冷冻水合样品，随后使用冷冻扫描电子显微镜在高倍率下成像，且电子束损伤最小。

摘要

对冷冻断裂样品进行冷冻扫描电子显微镜（SEM）观察，可使生物结构在接近天然状态下得到研究。本文介绍一种用于研究叶片样品中光合作用（类囊体）膜超分子结构的方法。该方法包括对叶片组织进行高压冷冻、冷冻断裂、双层镀膜，最后进行冷冻SEM成像。采用双层镀膜技术，可在对冷冻水合样品造成最小电子束损伤和最小电荷效应的前提下，获得高倍率（>100,000X）图像。利用所述方法，我们原位研究了复苏植物Craterostigma pumilum在脱水过程中光系统及捕光天线蛋白复合物超分子分布的变化。

引言

产氧光合作用起源于古老的蓝细菌，随后通过内共生事件被藻类和陆生植物继承，从而形成了叶绿体这一细胞器。在所有现代产氧光合生物中，光合电子传递以及质子动力势和还原力的生成均发生在被称为“类囊体”膜的扁平囊状膜结构内。这些膜含有执行光合作用光反应的蛋白复合物，并为能量转换提供了介质。植物和（某些）藻类的类囊体膜分化为两个形态上不同的区域：紧密贴合的膜区称为“基粒”（grana），以及连接基粒的非堆叠膜区，称为“基质片层”（stroma lamellae）1。自20世纪70年代初以来，已开展了多项针对植物和藻类类囊体膜的冰冻断裂研究。在冰冻断裂过程中，膜沿其疏水核心裂开2，形成外裂面（exoplasmic face, EF）和原生质裂面（protoplasmic face, PF），具体命名取决于半膜所邻接的细胞区室，该术语最初由Branton et al. 于1975年提出3。植物和藻类的类囊体膜具有四种不同的断裂面：EFs、EFu、PFs 和 PFu，其中“s”和“u”分别代表“堆叠”和“非堆叠”膜区域。膜蛋白复合物在断裂过程中通常保持完整，倾向于保留在膜的E侧或P侧。早期观察发现，类囊体的不同断裂面上存在大小和密度各异的颗粒4，随后大量研究进一步揭示并建立了这些观察到的颗粒与执行光反应的膜蛋白复合物之间的对应关系5–13（亦见综述14,15）。

类囊体膜的冷冻断裂实验通常在叶绿体或分离的类囊体膜制备物上进行（但参见16,17），然而在分离过程中可能导致结构和/或超分子结构的改变。断裂后，通过蒸发铂/碳（Pt/C）形成复型，随后覆盖一层较厚的碳（C），最后消化掉生物材料18。复型样品通过透射电子显微镜（TEM）进行观察。传统的冷冻断裂-复型技术仍然是研究光合作用膜的超分子结构及其对不同条件（例如，光照）适应性的重要工具19-23。

在我们最近对同质叶绿素复苏植物的研究中 短小旋花24我们旨在研究脱水和复水过程中类囊体膜的超分子结构以及整体细胞结构的变化。同质叶绿素复苏植物的独特之处在于，其营养组织（叶片）能够在干燥条件下存活，同时保留光合作用系统。一旦获得水分，这些植物可在数小时至数天内恢复并重新启动光合作用活性。25本研究结合了冷冻扫描电镜（SEM）对冻断的叶片样品进行成像，并采用高压冷冻技术实现样品的冷冻固定。这些方法能够以接近其天然状态的形式观察冷冻水合的生物样品。26一个主要优点是，样品在冷冻断裂并镀膜后可直接进行观察，无需后续处理步骤。这对于在不同相对含水量（RWC）条件下研究植物尤为关键，因为样品的水合状态在制备过程中得以保持。然而，一个关键的缺点是，冷冻水合状态的样品在成像过程中可能受到电子束损伤，尤其是在需要高倍率扫描以准确测量光合复合体尺寸时更为明显。为克服这一问题，采用了一种称为“双层镀膜”（DLC）的方法。27,28 结合特定的冷冻扫描电镜成像条件进行利用。这些条件使得样品对电子束的敏感性显著降低，从而能够揭示复苏植物中光合作用蛋白超分子结构及其他细胞组分的有价值信息 C. pumilum 在高倍镜下 原位.

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方案

1. 通过高压冷冻对叶片组织进行冷冻固定

注意：本节介绍如何对叶片组织进行高压冷冻，以用于冷冻断裂实验。有关植物样品的相关注意事项，请参见29。本方法经适当修改后，也可适用于其他类型的组织或样品。

  1. 使用剃刀刀片的角部，在 0.1/0.2 mm 铝质载片的 0.1 mm 凹面底部进行刮擦（图 1）。至少准备十几个载片（6 个样品）。注意不要在圆盘边缘留下刀痕。
    1. 刮擦后，用无水乙醇清洗载片，使其自然干燥，并保存在洁净的培养皿中。
  2. 根据制造商的说明准备高压冷冻仪。向高压冷冻仪的酒精室中加入异丙醇。
  3. 自制一个真空辅助渗透装置，用于将叶片组织中的气体置换为液体。
    1. 将一个 200 µl 移液器吸头紧密连接到 10 ml 注射器的末端。剪去吸头约 1 cm 的尖端。在 1.5 ml 微离心管的盖子上打一个孔，使剪短后的吸头能够紧密插入。通过拉动注射器活塞可在管内产生真空。
  4. 使用剃刀刀片从植物上切下一小片叶片，用镊子将叶片放入装有一半 1-十六碳烯的微离心管中。通过轻轻拉动活塞产生真空，维持约 30 秒，然后缓慢释放活塞，使液体渗透进入叶片的细胞间隙。
  5. 用镊子将叶片从管中取出。若叶片厚度超过 0.2 mm，需用剃刀刀片修整，并切割成适合放入载片的小片。
  6. 将一个干净的载片（刮擦面朝上）放入冷冻仪的样品架中，然后将切好的叶片放入载片凹面内。用 1-十六碳烯填充叶片周围的剩余空间。再取另一片载片盖在上面组成“三明治”结构，确保其刮擦面朝向叶片。
  7. 关闭并拧紧样品架，将其插入仪器腔室。按下“Jet”按钮进行冷冻（约 2,100 巴，持续 300–500 毫秒），然后迅速将样品架转移至液氮中。使用预冷的镊子小心地从样品架中取出冷冻的“三明治”结构，注意避免使其破裂。
    注意：封闭的冷冻“三明治”可立即进行冷冻断裂，或保存在液氮中以备后续使用。操作液氮时应穿戴防护服和护目镜。

2. 冷冻断裂与双层镀膜27,28

  1. 根据制造商的说明，准备冷冻断裂仪的使用，包括铂/碳（Pt/C）和碳的蒸发枪。将 Pt/C 枪置于 45 度角，碳枪置于 90 度角。
    1. 预设镀膜程序：2 nm 厚的 Pt/C 层（镀膜速率为 0.02 - 0.04 nm/秒）和 6 nm 厚的碳层（约 0.1 nm/秒）。
      1. 在冷冻断裂仪的屏幕上输入设置。选择一个用户编号以保存该镀膜程序。
      2. 选择“Layer 1”为 Pt/C。选择一个时间段 例如，5 分钟（以超过完成镀膜所需的实际时间）。使用上下箭头设定厚度为 2 nm。
      3. 按下“Layer”按钮进入第二层。重复步骤 2.1.1.2，但选择碳并设定厚度为 6 nm。
    2. 测试并调整蒸发枪的操作。
      1. 选择“Layer 1”。通过按下“GUN1”按钮选择 Pt/C 枪，然后按下冷冻断裂仪蒸发控制单元上的“ON”按钮。监测蒸发速率，并通过电压和发射旋钮进行调节，直至达到 0.02 - 0.04 nm/秒的速率。按下“OFF”关闭 Pt/C 枪。
      2. 选择“Layer 2”。重复步骤 2.1.2.1，但选择“GUN2”并调节至蒸发速率约为 0.1 nm/秒。
  2. 将冷冻断裂系统的样品台冷却至 -140 ˚C（适用于含水叶片）或 -160 ˚C（适用于脱水叶片）。将真空低温转移 shuttle 连接到仪器上，并将其腔室充满液氮。冷却后的冷冻断裂室内的压力通常在 1 - 8 × 10-7 mbar 之间。
  3. 将一个适用于 3 mm 片状样品的冷冻断裂样品 holder 插入装载站。向装载站腔室内充入液氮。
  4. 使用高精度等级镊子将两个冷冻的“三明治”样品依次装载到 holder 上。先将第一个“三明治”紧固在 holder 中，然后翻转 holder 检查其是否牢固就位。对第二个“三明治”重复相同操作。
  5. 将冷却的 shuttle 从冷冻断裂仪上拆下，并连接至装载站。打开 shuttle 阀门，将缩回臂插入 holder 并锁定到位。将带有 holder 的缩回臂重新引入 shuttle 中，并使用装载站旋钮关闭 shuttle 阀门。将 shuttle 重新连接至冷冻断裂仪，并用缩回臂将 holder 引入腔室。随后将 shuttle 从仪器上拆下。
  6. 调整冷冻断裂超薄切片机刀片的高度，使其能够敲掉“三明治”样品的顶层片状结构。
  7. 使用超薄切片机刀片迅速断裂“三明治”样品，然后立即抬起刀片，防止刀片上附着的碎片污染样品，并转动位于新暴露表面之上的冷却快门，以屏蔽样品免受腔室内水分子可能造成的污染。
  8. 对样品进行铂和碳镀膜。
    1. 在屏幕上选择“Layer 1”。按下“GUN1”按钮，然后按下“ON”按钮以启动 Pt/C 枪。观察蒸发速率，当其达到 0.02 - 0.04 nm/秒时，同时暴露样品并按下“Measure”按钮以监测沉积层的厚度。
      注意：当厚度达到预设值时，蒸发枪将自动关闭。
    2. Pt/C 蒸发完成后，用快门遮盖样品。
    3. 按下“Layer”按钮进入“Layer 2”。重复步骤 2.8.1 和 2.8.2，但选择“GUN2”（用于碳蒸发），并调节蒸发速率为约 0.1 nm/秒。
  9. 将冷冻断裂系统的样品台升温至 -120 ˚C。

3. 冷冻扫描电子显微镜

  1. 准备扫描电子显微镜以进行冷冻工作。
    1. 从主菜单中选择“Stage/Stage Initialise”（载物台/载物台初始化），并确认。
    2. 选择“Tools/Goto Panel”（工具/转到面板），然后从列表中选择打开“Airlock”（气闸）面板。点击“Close Column Chamber Valve”（关闭镜筒室阀门）按钮。在“Vacuum”（真空）选项卡下点击“Vent”（放气）按钮，对显微镜腔室进行放气。
    3. 选择“Tools/Goto Panel”（工具/转到面板），然后打开“Stage Points List”（载物台位置列表）面板。选择冷冻交换位置，使载物台移动至可接收样品杆的正确坐标。注意：“冷冻交换位置”已预设为与真空转移装置的位置对齐。
    4. 戴上干净的手套打开样品室，将冷冻载物台插入显微镜主载物台上。关闭腔室，并在“Vacuum”（真空）选项卡下点击“Pump”（抽气）按钮。
    5. 将显微镜冷却至 -120 ˚C。向显微镜杜瓦瓶中加入液氮。当载物台温度降至 -120 ˚C 以下时，启动冷冻转移控制单元的加热功能至 -120 ˚C。
  2. 将冷冻转移 Shuttle 连接到显微镜上，并通过伸缩臂将样品杆转移至显微镜的冷冻载物台上（如步骤 2.5 所示）。将 Shuttle 从显微镜上拆下。
  3. 在气闸面板中点击“Open Column Chamber Valve”（打开镜筒室阀门）按钮。
  4. 使用操纵杆小心地将样品杆移近物镜（工作距离为 1 - 2 mm）。在“Apertures”（光阑）选项卡中选择 10-µm 的光阑。在“Gun”（电子枪）选项卡中双击 EHT 字段，输入 10 (kV) 作为 EHT 目标值，然后点击“OK”。点击底部的 EHT 选项卡并选择“EHT On”（开启 EHT）。
  5. 在“Detectors”（探测器）选项卡的探测器下拉列表中选择“InLens”（镜内探测器）。根据需要优化成像条件（聚焦、亮度和对比度、电子束对中、像散）。
  6. 点击“Scanning”（扫描）选项卡。选择快速扫描（“Scan Speed = 1”，对应每个像素的停留时间为 100 nsec），以最小化电子束损伤，并将“Store resolution”（存储分辨率）设为 1,024 × 768 像素。在“Noise Reduction”（降噪）下拉列表中选择“Line Avg”（行平均）。将 N 值调整为 20 - 30 行用于搜索。使用“Centre Point”（中心点）功能（按键盘上的 control-tab）移动样品，以寻找含有断裂细胞和叶绿体的区域（图 2A 和 2B）。
  7. 在低倍率下（50 - 70 kX）获取断裂叶绿体的图像（图 2C 和 2D）。使用“Centre Feature”（中心特征）功能（按键盘上的 control-shift-tab）放大至感兴趣的叶绿体断裂面，并在高倍率下（100 - 200 kX，图 3 和 4）获取图像。图像采集参数与步骤 3.6 相同，但将 Line Avg 值改为 N >100 以降低噪声30。
    1. 按下主显微镜控制单元上的“Freeze”（冻结）按钮或在“Scanning”（扫描）选项卡中点击“Freeze”，停止扫描，并通过点击“Save TIFF”（保存 TIFF）按钮保存图像。

4. 图像分析

注意：本节介绍使用 Fiji31 开源软件包对冷冻断裂扫描电镜图像中的膜颗粒进行分割的简要操作流程。使用其他图像分析软件也可获得类似结果。

  1. 通过将图像文件拖拽到主程序窗口，在 Fiji 中打开图像。选择 Image/Type/8-bit，将图像转换为 8 位。选择 Image/Adjust/Brightness/Contrast，并根据需要进行调整（图 5A）。
  2. 使用直线工具，绘制一条与图像中嵌入的比例尺长度相同的线段。选择 Analyze/Set Scale，输入正确的比例信息（已知距离和长度单位），然后点击 OK。保存此已校准比例的图像。
  3. 选择 Process/Filters/Gaussian blur（半径 1.5 nm），然后点击 OK（图 5B）。
  4. 选择 Image/Adjust/Auto Local Threshold（使用 Niblack 方法），然后点击 OK（图 5C）。
  5. 选择 Edit/Invert，然后选择 Process/Binary/Watershed（图 5D）。
  6. 使用自由手选工具，在感兴趣区域（ROI）周围绘制边界。通过选择 Edit/Selection/Add to Manager 或按下“T”键，将该选区添加至 ROI 管理器。
  7. 选择 Edit/Clear Outside（图 5E）。
  8. 选择 Analyze/Set Measurements，选择适当的参数（例如，面积、拟合椭圆）。
  9. 选择 Analyze/Analyze Particles。输入粒子大小的合适范围，并勾选“Display results”、“Add to Manager”，如有需要，同时勾选“Exclude on edges”选项，然后点击 OK。结果如 图 5F 所示。
  10. 打开之前保存的已校准比例的图像文件（步骤 4.2）。在 ROI 管理器中选择“Show All”并取消勾选“Labels”。检查叠加在原始图像上的粒子选区，并使用 ROI 管理器中的“Add”或“Delete”按钮手动添加或删除选区。如有必要，使用自由手选工具和 ROI 管理器中的“Update”按钮对选区进行修正（图 5G 和 5H）。
  11. 使用获得的测量数据进行分析。在 Results 窗口中，点击 Results/Summarize，以获取 ROI 管理器中列出的粒子的平均面积、平均长轴和短轴等统计值。点击 Results/Distribution，选择一个参数（如面积），然后点击 OK，以查看该参数的直方图。

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结果

图1展示了含有高压冷冻、冷冻断裂的Craterostigma pumilum叶片片段的载片的冷冻扫描电镜图像。在某些样品中，可获得大面积的断裂细胞区域（图1A）。而在其他样品中，叶片片段仍紧密附着于上部圆盘，并随其一同被撞落（图1B）。然而，即使在第二种情况下，部分叶片组织可能仍附着在载片的刀片沟槽上（图1B，箭头所示），只要这些组织经过断裂，仍可通过成像这些叶片“残留物”获取大量数据。在找到成功断裂的区域后，首先采集细胞的低倍图像，以确定感兴趣区域，本实验中为叶绿体（图2）。

C. pumilum 叶片类囊体膜的高倍图像如图3和图4所示。可以区分出四种不同的断裂面：EFs、EFu、PFs 和 PFu（

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讨论

本文所述技术可通过低温扫描电子显微镜，在高压冷冻保存良好的植物组织背景下，对冷冻断裂的膜结构进行观察。该方法的主要优势在于样品制备过程完全为物理性操作，无需使用化学试剂或脱水步骤，因而能够以接近天然状态研究生物结构。 关键词：低温扫描电子显微镜，高压冷冻，冷冻断裂，植物组织，近天然状态26,32使用叶片组织的优点在于，可以在其天然生理环境中获得有关整体细胞结构的信息，并研究特定膜结构（如类囊体膜）。 即，位于叶绿体内部。另一个优势，对于研究而言至关重要 C. pumilum 在不同相对含水量（RWC）下取材的植物样品，其优势在于制备过程中水合状态不会发生改变，而若以分离的叶绿体或类囊体膜作为冰冻断裂实验的起始材料则不具备这一特点。此外，后者在细胞器或膜的分离过程中，很可能已发生某些结构和/或超分子水平上的改变，这一点也需予以考虑。

处理相对厚实的植物组织样本，>50 - 100 µm，且根据组织类型和物种的不同可显著更厚]，决定了必须采用高压冷冻（HPF）对样品进行玻璃化。施加高压[2,100 bar]，在此压力下...

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披露

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

致谢

我们感谢苏黎世大学的Andres Kaech在扫描电子显微镜成像方面提供的宝贵建议。本研究由美国-以色列双边农业研究与发展基金（资助号：US-4334-10，Z.R.）、以色列科学基金会（资助号：1034/12，Z.R.）以及人类前沿科学计划（RGP0005/2013，Z.R.）提供资助。电子显微镜研究在魏茨曼科学研究所的欧文和切尔纳·莫斯科维茨纳米与生物纳米成像中心完成。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
无水乙醇Bio-Lab052505
异丙醇Bio-Lab162605
1-十六碳烯Sigma-AldrichH7009
0.1/0.2 型载片Engineering Office M. Wohlwend GmbH, 瑞士241载片直径为 3 mm，厚度为 0.5 mm（A 型），带有深度为 0.1/0.2 mm、直径为 2 mm 的凹腔。类似载片可从 Leica Microsystems 获取。
高精度镊子Electron Microscopy Sciences72706-01Dumont（瑞士）Durostar #5 型镊子；可用其他高精度镊子替代。
高压冷冻仪Bal-TecHPM 010高压冷冻替代设备：1. HPF Compact 02，Wohlwend GmbH；2. HPM 010，RMC Boeckeler；3. EM PACT2，Leica Microsystems；4. EM HPM 100，Leica Microsystems；5. EM ICE，Leica Microsystems。
冷冻断裂系统Leica MicrosystemsEM BAF 060
冷冻制样装载台Leica Microsystems16770228
通用冷冻断裂样品 holderLeica Microsystems16LZ04746VN用于直径为 3 mm 的样品载体的夹持 holder
真空冷冻转移 shuttleLeica MicrosystemsEM VCT 100
扫描电子显微镜ZeissUltra 055
冷冻 SEM 样品台Leica Microsystems16770299905
图像采集软件SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH
图像分析软件Fiji/Image J, 美国国立卫生研究院http://fiji.sc/Fiji

参考文献

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冷冻断裂技术类囊体膜结构高压冷冻双层镀膜叶绿体断裂面光系统II分布脱水效应复苏植物
通过冷冻断裂叶片组织的低温扫描电子显微镜研究光合膜的超分子结构 关键词：光合膜，超分子结构，冷冻断裂，叶片组织，低温扫描电子显微镜
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