全自动离心式微流控装置用于全血中超灵敏蛋白质检测

摘要

本方案展示了如何在30分钟内，利用集成于芯片实验室圆盘中的电纺纳米纤维膜，实现10 µL全血中蛋白质的飞摩尔级检测灵敏度。该方法通过提供高比表面积以及高效的混合与洗涤，显著提高了信噪比。

摘要

酶联免疫吸附测定（ELISA）是一种用于检测生物样本中微量蛋白质的有前景的方法。为了在即时诊断中具有潜在应用价值，需要开发能够减少样本用量、缩短检测时间并实现全自动化的装置。最近，我们已证明利用由二氧化钛（TiO₂）纳米纤维（NF）膜构成的“芯片实验室-光盘”（lab-on-a-disc）平台，可实现对血清蛋白C反应蛋白（CRP）和心肌肌钙蛋白I（cTnI）的超灵敏检测。该方法可在30分钟内从小体积全血样本中实现飞摩尔（fM）级的检测灵敏度，并具有宽广的动态检测范围。该装置包含多个组件，可自动完成血液分离、定量、混合和洗涤等步骤，从而在低样本量条件下提高检测灵敏度。在本视频演示中，我们将依次展示NF材料及光盘的制备实验方案与关键技术，包括：TiO₂纳米纤维膜的制备工艺；将TiO₂纳米纤维膜转移印刷至光盘表面；用于免疫反应的表面修饰、光盘组装与操作；光盘上的检测过程及免疫分析的代表性结果。该装置的使用可实现多重分析，同时最大限度地减少样本和试剂的消耗。鉴于其诸多优势，该装置有望广泛应用于多种场景，并有助于推动低丰度蛋白质的分析研究。

引言

已开发出多种基于纳米材料^1,2的疾病诊断平台，例如纳米线³、纳米颗粒⁴、纳米管⁵和纳米纤维（NFs）^6-8。由于这些纳米材料具有独特的理化性质，因此在设计高灵敏度生物检测新技术方面展现出广阔前景。例如，介孔氧化锌纳米纤维已被用于飞摩尔级灵敏度检测乳腺癌生物标志物⁹。近年来，鉴于二氧化钛（TiO₂）具有化学稳定性好¹¹、几乎不引起蛋白质变性¹²以及良好的生物相容性¹³等优点，其在生物分析领域的应用也受到关注¹⁰。此外，TiO₂表面的羟基有利于化学修饰及生物分子的共价固定^14,15。已有研究利用图案化的TiO₂薄膜¹⁶或TiO₂纳米管¹⁷来增加表面积，从而提高目标蛋白的检测灵敏度；然而，这类结构的制备工艺较为复杂，且需要昂贵的设备。相比之下，静电纺丝纳米纤维因其高比表面积以及简单、低成本的制备过程而受到关注^18,19；但静电纺丝制得的TiO₂纳米纤维膜通常质地脆弱或结构疏松，难以操作，且不易与微流控装置集成^6,20。因此，TiO₂纳米纤维膜在生物分析中的应用十分有限，尤其是在需要剧....

方案

注意：血液取自健康个体，并收集于采血管中。所有志愿者均签署了书面知情同意书。

1. TiO₂ 纳米纤维膜的制备

1. 前驱体溶液的制备²²
   1. 将1.5 g四异丙醇钛（TTIP）溶解于乙醇（99.9%，3 ml）和冰醋酸（3 ml）的混合液中，并在磁力搅拌器上于室温（25 °C）搅拌30分钟。
   2. 将11 wt%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶解于3.64 g乙醇（99.9%）中，并使用加热磁力搅拌器在65 °C下搅拌1小时。
   3. 将上述两种溶液混合，并在加热磁力搅拌器上于65 °C持续搅拌4小时。
2. 静电纺丝
   1. 将制备好的溶液装入连接内径为200 μm不锈钢针头的注射器中。移除活塞后，直接将溶液倒入注射器内。
   2. 以0.3 ml/hr的恒定流速，将溶液持续注入置于接地基底上的硅片（2 cm × 2 cm）上，施加15 kV的高直流电压，时间为10分钟。静电纺丝过程中，针头与接地基底之间的距离设为10 cm。
3. 纳米纤维膜的煅烧
   1. 将纳米纤维膜放入炉中，在高真....

结果

通过本方案，制备了一种完全自动化的离心式微流控装置，可用于从全血中高灵敏度地检测蛋白质。TiO₂ 纳米纤维膜通过静电纺丝和煅烧工艺制备。为了获得理想直径、形貌和厚度的纳米纤维，优化了静电纺丝条件，包括流速、电压和纺丝时间。当条件未优化时，所形成的纳米纤维质量较差。特别是，在低电压（5 kV）下，聚合物溶液无法拉出纤维；而在高电压（>20 kV）下，纤维容易断裂。同样，纺丝时间对获得适当密度的纳米纤维至关重要，时间过短（1 分钟）会导致纤维过于稀疏，而时间过长（30 分钟）则导致过于致密。此外，为避免高流速引起的液滴成珠现象，需调节流速。因此，根据所得纳米纤维的形貌和厚度，确定15 kV的施加电压、10分钟的静电纺丝时间以及0.3 ml hr^-1的流速为纳米纤维制备的最佳条件（图1）。

采用粘性PDMS层成功将TiO₂ 纳米纤维膜转移至目标基底上，该PDM.......

讨论

基于TiO₂纳米纤维集成圆盘的检测方法是一种快速、低成本且便捷的技术，可用于在极小体积血液中对低丰度蛋白质进行超灵敏检测。该技术具有使用样品量小（10 μl）的优势，并可同时分析多个样品，因此在多重免疫分析装置方面具有巨大潜力。该装置的另一优势在于无需如传统ELISA中所需的血浆分离等样品预处理步骤。此外，由于预先设计了反应腔室、通道和阀门，该装置可自动完成整个免疫分析流程（例如，混合、洗涤、结合等）。另外，采用商业化圆盘制造方法（例如，注塑成型、紫外/超声/热键合）替代铣削和使用粘合剂的手动组装，可实现从装置制备到分析全过程的自动化。

此外，本文介绍的转移印刷方法通过使用一层薄的粘性PDMS层，实现了静电纺丝纳米纤维从供体基底向目标基底的简单且便捷的转移。通常情况下，经过煅烧工艺获得的TiO₂纳米纤维较为脆性，由于附着力较弱，容易从接地基底上剥落²⁵。由于其固有的脆性，将TiO₂纳米纤维膜集成到其他器件中存在困难。为解决这一问题，已有多种方法被报道。例如，热.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
硅片	LG SILTRON	抛光晶圆，测试级	直径 (mm) = 150，晶向 = <100>，掺杂剂 = 硼，电阻率 (Ohm-cm) = 1 - 30，厚度 (μm) = 650 - 700
聚碳酸酯 (PC)	大东塑料	PCS#6900	厚度 (mm) = 1 和 5
四异丙氧基钛，98%	Sigma-Aldrich	205273
聚乙烯吡咯烷酮，分子量 = 1,300,000	Sigma-Aldrich	437190
乙酸	Sigma-Aldrich	320099
无水乙醇	Sigma-Aldrich	459836
十三氟-1,1,2,2-四氢辛基-1-三氯硅烷	Sigma-Aldrich	448931
PDMS 及固化剂	道康宁	SYLGARD 184
GPDES	Gelest 公司	SIG5832.0
乙醇	J T Baker
场发射扫描电子显微镜 (FE-SEM)	FEI	Nova NanoSEM
X 射线光电子能谱	赛默飞世尔科技	K-alpha
三维建模机	M&I CNC 实验室，韩国		数控铣床
蜡分配机	韩拉精密工程有限公司，韩国		定制
双面胶带	FLEXcon，美国	DFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95
切割绘图仪	Graphtec 公司，日本	Graphtec CE3000-60 MK2
旋涂仪	MIDAS	SPIN-3000D
炉子（煅烧用）	R. D. WEBB 公司	WEBB 99
流变仪（粘附力测试）	Thermo Scientific	Haake MARS III - ORM 套件
氧气等离子体系统	FEMTO	CUTE
单克隆小鼠抗人高敏 C 反应蛋白 (hsCRP)	Hytest 有限公司，芬兰	4C28	(克隆号 C5)
单克隆小鼠抗心肌肌钙蛋白 I (cTnI)	Hytest 有限公司，芬兰	4T21	(克隆号 19C7)
HRP 标记的山羊多克隆抗高敏 C 反应蛋白 (hsCRP)	Abcam plc.，马萨诸塞州	ab19175
HRP 标记的小鼠单克隆抗心肌肌钙蛋白 I (cTnI)	Abcam plc.，马萨诸塞州	ab24460	(克隆号 16A11)
高敏 C 反应蛋白 (hsCRP)	Abcam plc.，马萨诸塞州	ab111647
心肌肌钙蛋白 I (cTnI)	Fitzgerald，马萨诸塞州	30-AT43
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A7906
磷酸盐缓冲液 (PBS)	Amresco 公司	E404
血液采集管	BD 真空采血管	367844	K2 EDTA 7.2 mg 加血液 采集管
SuperSignal ELISA femto	Invitrogen	37074
模块化多功能酶标仪	Perkin Elmer	Envision 2104
圆盘操作机	韩拉精密工程有限公司，韩国		定制
光电倍增管 (PMT)	滨松光子学株式会社	H1189-210
AutoCAD	Autodesk	版本 2012	设计软件
SolidWorks 3D CAD 软件	SOLIDWORKS 公司	版本 2013	三维设计软件
Edgecam	Vero 软件	版本 2009.01.06928	代码生成软件
DeskCNC	Carken 公司	版本 2.0.2.18	数控铣床软件