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全自动离心式微流控装置用于全血中超灵敏蛋白质检测

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DOI：

10.3791/54143

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2016年4月16日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, School of Life Sciences, Ulsan National Institute of Science and Technology (UNIST), UNIST-gil 50, Ulsan, Republic of Korea, 2Agency for Defense Development (ADD), Daejeon, Republic of Korea, 3KOGAS (Korea Gas Corporation) Research Institute, 4Center for Soft and Living Matter, Institute for Basic Science (IBS)

本文内容

摘要

本方案展示了如何在30分钟内，利用集成于芯片实验室圆盘中的电纺纳米纤维膜，实现10 µL全血中蛋白质的飞摩尔级检测灵敏度。该方法通过提供高比表面积以及高效的混合与洗涤，显著提高了信噪比。

摘要

酶联免疫吸附测定（ELISA）是一种用于检测生物样本中微量蛋白质的有前景的方法。为了在即时诊断中具有潜在应用价值，需要开发能够减少样本用量、缩短检测时间并实现全自动化的装置。最近，我们已证明利用由二氧化钛（TiO2）纳米纤维（NF）膜构成的“芯片实验室-光盘”（lab-on-a-disc）平台，可实现对血清蛋白C反应蛋白（CRP）和心肌肌钙蛋白I（cTnI）的超灵敏检测。该方法可在30分钟内从小体积全血样本中实现飞摩尔（fM）级的检测灵敏度，并具有宽广的动态检测范围。该装置包含多个组件，可自动完成血液分离、定量、混合和洗涤等步骤，从而在低样本量条件下提高检测灵敏度。在本视频演示中，我们将依次展示NF材料及光盘的制备实验方案与关键技术，包括：TiO2纳米纤维膜的制备工艺；将TiO2纳米纤维膜转移印刷至光盘表面；用于免疫反应的表面修饰、光盘组装与操作；光盘上的检测过程及免疫分析的代表性结果。该装置的使用可实现多重分析，同时最大限度地减少样本和试剂的消耗。鉴于其诸多优势，该装置有望广泛应用于多种场景，并有助于推动低丰度蛋白质的分析研究。

引言

已开发出多种基于纳米材料1,2的疾病诊断平台，例如纳米线3、纳米颗粒4、纳米管5和纳米纤维（NFs）6-8。由于这些纳米材料具有独特的理化性质，因此在设计高灵敏度生物检测新技术方面展现出广阔前景。例如，介孔氧化锌纳米纤维已被用于飞摩尔级灵敏度检测乳腺癌生物标志物9。近年来，鉴于二氧化钛（TiO2）具有化学稳定性好11、几乎不引起蛋白质变性12以及良好的生物相容性13等优点，其在生物分析领域的应用也受到关注10。此外，TiO2表面的羟基有利于化学修饰及生物分子的共价固定14,15。已有研究利用图案化的TiO2薄膜16或TiO2纳米管17来增加表面积，从而提高目标蛋白的检测灵敏度；然而，这类结构的制备工艺较为复杂，且需要昂贵的设备。相比之下，静电纺丝纳米纤维因其高比表面积以及简单、低成本的制备过程而受到关注18,19；但静电纺丝制得的TiO2纳米纤维膜通常质地脆弱或结构疏松，难以操作，且不易与微流控装置集成6,20。因此，TiO2纳米纤维膜在生物分析中的应用十分有限，尤其是在需要剧烈清洗条件的检测中极少被使用。

在本研究中，为了克服这些局限性，我们开发了一种新技术，利用一层薄的聚二甲基硅氧烷（PDMS）粘合层，将静电纺丝纳米纤维膜转移至任意目标基底表面。此外，我们成功展示了静电纺丝二氧化钛（TiO2 将NF膜集成到由聚碳酸酯（PC）制成的离心式微流控装置上。利用该装置，仅需10 μL全血，即可在30分钟内实现对C反应蛋白（CRP）和心肌肌钙蛋白I（cTnI）的高灵敏度、全自动、一体化检测。21 由于纳米纤维（NFs）与离心平台特性的协同优势，该检测方法对C反应蛋白（CRP）的动态范围宽达六个数量级，检测范围从1 pg/ml（约8 fM）至100 ng/ml（约0.8 pM），最低检测限为0.8 pg/ml（约6 fM）；对心肌肌钙蛋白I（cTnI）的动态范围为10 pg/ml（约0.4 pM）至100 ng/ml（约4 nM），检测限为37 pg/ml（约1.5 pM）。上述检测限分别比相应的传统ELISA结果低约300倍和20倍。该技术可适用于任何目标蛋白的检测，只需使用相应的抗体即可。总体而言，该装置有望在 体外 由于其高灵敏度，即使从极少量生物样本中也能检测到微量的目标蛋白，因此广泛应用于诊断和生化检测。 例如，10 μl 全血。尽管本研究仅通过ELISA展示了血清蛋白检测的应用，但静电纺丝纳米纤维与微流控装置的转移和集成技术还可更广泛地应用于其他需要大比表面积以实现高检测灵敏度的生化反应。

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方案

注意：血液取自健康个体，并收集于采血管中。所有志愿者均签署了书面知情同意书。

1. TiO2 纳米纤维膜的制备

  1. 前驱体溶液的制备22
    1. 将1.5 g四异丙醇钛（TTIP）溶解于乙醇（99.9%，3 ml）和冰醋酸（3 ml）的混合液中，并在磁力搅拌器上于室温（25 °C）搅拌30分钟。
    2. 将11 wt%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶解于3.64 g乙醇（99.9%）中，并使用加热磁力搅拌器在65 °C下搅拌1小时。
    3. 将上述两种溶液混合，并在加热磁力搅拌器上于65 °C持续搅拌4小时。
  2. 静电纺丝
    1. 将制备好的溶液装入连接内径为200 μm不锈钢针头的注射器中。移除活塞后，直接将溶液倒入注射器内。
    2. 以0.3 ml/hr的恒定流速，将溶液持续注入置于接地基底上的硅片（2 cm × 2 cm）上，施加15 kV的高直流电压，时间为10分钟。静电纺丝过程中，针头与接地基底之间的距离设为10 cm。
  3. 纳米纤维膜的煅烧
    1. 将纳米纤维膜放入炉中，在高真空条件（5 × 10-5 torr）下以3 °C/min的升温速率将温度升至500 °C。
    2. 在500 °C下保温3小时，随后在炉内将样品温度自然冷却至室温（25 °C）。

2. 将TiO2 NF膜集成到离心式微流控圆盘中

  1. 圆盘的制备
    1. 使用3D设计软件（例如，SolidWorks 或类似软件）来绘制圆盘各层的腔室、通道或阀门。使用代码生成软件将设计文件转换为计算机数控（CNC）代码例如，Edgecam 或类似软件）。根据说明书操作使用相关软件。23,24 注：该装置中常用的通道尺寸为 1.0 mm × 0.3 mm（宽度 × 深度）。
    2. 打开数控铣床的操作软件（例如., DeskCNC 或类似软件）并将数控代码载入操作软件，然后依次点击以下内容： "自动" -> "G 代码 开启" -> 选择生成的CNC代码。
    3. 将聚碳酸酯（PC）板固定到数控铣床：顶部层使用1 mm的PC板，圆盘层使用5 mm的PC板。通过点击启动数控铣床，铣削切割圆盘的每一层 "开始" 按钮
  2. TiO的转移2 将NF膜转移至圆盘上
    1. 将硅基底和一个含有40 µL三氯硅烷基十三氟-1,1,2,2-四氢辛烷的小培养皿置于真空腔中，在真空条件下放置30 min。氟硅烷会挥发并沉积在基底表面形成涂层。
    2. 将聚二甲基硅氧烷（PDMS）预聚物与固化剂按10:1的比例混合，并在真空腔中脱气。以650 rpm的转速将PDMS旋涂在硅基底上，持续60秒。
    3. 在65 °C的烘箱中将涂覆在硅基底上的PDMS固化10分钟，以达到粘附状态。
      注意：固化时间可根据环境条件进行调整，粘附力可通过使用流变仪进行粘性测试来评估。
    4. 将 TiO2 使用镊子将通过静电纺丝和煅烧制备的纳米纤维膜转移至聚二甲基硅氧烷（PDMS）包覆的硅片上。随后，手动对转移后的TiO₂施加均匀压力。2 NF膜与平面物体例如，载玻片）并取下物体。将该样品置于65 °C烘箱中4小时，或80 °C烘箱中1小时，以完全固化PDMS层。
    5. 用 20 µl 将反应室包被在圆盘上 PDMS/固化剂混合物（10:1），用作粘附层以固定TiO2 将NF膜贴到圆盘上。
    6. 在 TiO 表面滴加 50 µl 乙醇（99.9%）2 将NF膜置于PDMS层上，用直径为6 mm的打孔器切割NF膜，并转移切割好的TiO2 将NF膜置于上一步中用20 µl PDMS包被的结合反应腔室中。
      注意：此步骤中，乙醇有助于使切割的 TiO 脱落2 从Si衬底上剥离NF膜。
    7. 孵育 TiO₂ 纳米管上的细胞，时间不少于 24 小时2 将NF膜集成圆片置于烘箱中，在65 °C下加热4小时，或在80 °C下加热1小时，以完全固化PDMS。
  3. TiO₂表面改性2 NF膜置于圆盘上
    1. 在乙醇（99.9%）中配制1% v/v的(3-环氧丙氧基丙基)甲基二乙氧基硅烷（GPDES）溶液。
    2. 用 TiO 处理2 将NF膜在140 W、50 sccm氧气流的氧气等离子体中处理180秒。在每片纳米纤维膜上加入100 μl GPDES溶液，在室温（25 °C）孵育2小时。
    3. 用洗瓶加入乙醇（99.9%）对基底进行短暂冲洗，然后将圆片倒置并用洁净的擦拭纸吸干，彻底去除乙醇。在80 °C下固化1小时。按照上述相同方法，用乙醇（99.9%）清洗两次，以去除物理吸附和未结合的GPDES分子。
    4. 用氮气流吹干，然后在真空下干燥。
      注意：该培养皿可在密封容器中于室温（25 °C）保存至使用前。
  4. 抗体在表面的固定化
    1. 用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）稀释单克隆小鼠抗人hsCRP或单克隆小鼠抗cTnI捕获抗体，配制浓度为200 μg/ml的抗体溶液。使用微量移液器将5 μl该溶液分别加入圆盘中的每一片纳米纤维膜（NF mat）上。有关抗体的更多信息，请参见材料列表。
    2. 将圆片置于湿盒中，在37 °C下孵育4小时。洗涤抗体 用0.1% BSA-PBS缓冲液包被NF膜。用移液器向腔室中加入100 μl洗涤缓冲液，通过抽吸或倾倒去除缓冲液。最后，将膜片倒置并在干净的擦拭纸上轻压吸干，然后组装膜片。
  5. 盘状结构组装
    1. 使用 CAD 程序在双面胶带上绘制圆盘的设计图例如，AutoCAD 或类似软件）。将 CAD 设计文件载入切割绘图仪。
    2. 使用切割绘图仪裁剪双面胶带。撕去双面胶带的一层保护膜，将其粘贴在圆盘层的上方。再撕去另一层保护膜，将顶层粘贴到圆盘层上。
    3. 将初步组装好的圆盘放入压片机中，利用各层的对齐标记精确对准顶层/粘合层/圆盘层，以确保各个阀门、通道和腔室准确连接。使用压片机施加均匀压力。

3. 免疫测定

  1. 使用微量移液器将1% BSA-PBS缓冲液加入各腔室，并将圆盘在37 °C孵育1小时。用微量移液器抽吸去除缓冲液。此步骤用于封闭圆盘上未反应的位点，以减少蛋白质的非特异性吸附。
  2. 使用微量移液器向腔室中加入0.1% BSA-PBS缓冲液并抽吸，洗涤两次。
    注意：此时可将圆盘在4 °C保存至使用。
  3. 使用微量移液器向圆盘中加入10 μl含抗原的全血或无CRP血清用于CRP检测。为绘制校准曲线，CRP浓度使用范围为1 pg/ml至100 ng/ml；cTnI浓度使用范围为10 pg/ml至100 ng/ml。
    注意：由于全血中CRP水平通常处于μM范围，较高，因此使用无CRP血清以展示该装置的低检测限。
  4. 以3,600 rpm（391 × g）转速旋转圆盘60秒，以分离红细胞。
  5. 通过激光照射打开阀#1，并以2,400 rpm转速旋转圆盘3秒，将4 μl上清血浆转移至含有8 μl HRP标记检测抗体的腔室。
    注意：阀门驱动及圆盘操作可视化的通用流程已在先前的报告中有详细描述。21
  6. 施加混合模式（15 Hz s-1，15°）持续5秒，以促进蛋白质与检测抗体的结合。
  7. 打开阀#2，将第6步制备的混合物以2,400 rpm转速旋转3秒转移至结合反应腔室。随后施加混合模式（60 Hz s-1，2°）持续20分钟，使混合物与TiO2 NFs上的结合抗体发生免疫反应。反应完成后，打开阀#3，以2,400 rpm转速旋转10秒，将残余混合物转移至废液腔室。
  8. 打开阀#4，以2,400 rpm转速旋转圆盘4秒，将洗涤缓冲液（600 µl）转移至结合反应腔室。随后施加混合模式（30 Hz s-1，30°）持续120秒，以洗涤腔室中的TiO2 NFs。
  9. 按照步骤3.8的相同条件再洗涤TiO2 NFs两次，并以2,400 rpm转速旋转圆盘20秒，彻底去除残余洗涤缓冲液。然后关闭阀#5。
  10. 进行化学发光反应时，先打开阀#6，以2,400 rpm转速旋转圆盘10秒，将化学发光底物溶液转移至结合反应腔室，随后施加混合模式（30 Hz s-1，2°）持续1分钟。
  11. 打开阀#7，以2,400 rpm转速旋转圆盘10秒，将反应后的底物溶液转移至检测腔室 。
  12. 使用配备光电倍增管（PMT）模块的检测系统测量反应后底物溶液的化学发光信号。 
    注意：该检测系统为自行搭建的设备，包含以下部件：步进电机、光机械组件、平移台以及商用PMT。光机械部件与步进电机组装用于固定装置，电机可旋转圆盘。检测由固定在光机械部件上的PMT完成，PMT位于装置检测腔室的正上方。通过操控步进电机，使检测腔室精确对准PMT的检测区域下方。

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结果

通过本方案，制备了一种完全自动化的离心式微流控装置，可用于从全血中高灵敏度地检测蛋白质。TiO2 纳米纤维膜通过静电纺丝和煅烧工艺制备。为了获得理想直径、形貌和厚度的纳米纤维，优化了静电纺丝条件，包括流速、电压和纺丝时间。当条件未优化时，所形成的纳米纤维质量较差。特别是，在低电压（5 kV）下，聚合物溶液无法拉出纤维；而在高电压（>20 kV）下，纤维容易断裂。同样，纺丝时间对获得适当密度的纳米纤维至关重要，时间过短（1 分钟）会导致纤维过于稀疏，而时间过长（30 分钟）则导致过于致密。此外，为避免高流速引起的液滴成珠现象，需调节流速。因此，根据所得纳米纤维的形貌和厚度，确定15 kV的施加电压、10分钟的静电纺丝时间以及0.3 ml hr-1的流速为纳米纤维制备的最佳条件（图1）。

采用粘性PDMS层成功将TiO2 纳米纤维膜转移至目标基底上，该PDM...

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讨论

基于TiO2纳米纤维集成圆盘的检测方法是一种快速、低成本且便捷的技术，可用于在极小体积血液中对低丰度蛋白质进行超灵敏检测。该技术具有使用样品量小（10 μl）的优势，并可同时分析多个样品，因此在多重免疫分析装置方面具有巨大潜力。该装置的另一优势在于无需如传统ELISA中所需的血浆分离等样品预处理步骤。此外，由于预先设计了反应腔室、通道和阀门，该装置可自动完成整个免疫分析流程（例如，混合、洗涤、结合等）。另外，采用商业化圆盘制造方法（例如，注塑成型、紫外/超声/热键合）替代铣削和使用粘合剂的手动组装，可实现从装置制备到分析全过程的自动化。

此外，本文介绍的转移印刷方法通过使用一层薄的粘性PDMS层，实现了静电纺丝纳米纤维从供体基底向目标基底的简单且便捷的转移。通常情况下，经过煅烧工艺获得的TiO2纳米纤维较为脆性，由于附着力较弱，容易从接地基底上剥落25。由于其固有的脆性，将TiO2纳米纤维膜集成到其他器件中存在困难。为解决这一问题，已有多种方法被报道。例如，热...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由韩国国家研究基金会（NRF）资助项目（2013R1A2A2A05004314，2012R1A1A2043747）及韩国卫生技术研究开发项目资助&D 项目，卫生部 & 福利（A121994）以及由韩国政府资助的 IBS-R020-D1 项目。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
硅片LG SILTRON抛光晶圆，测试级直径 (mm) = 150，晶向 = <100>，掺杂剂 = 硼，电阻率 (Ohm-cm) = 1 - 30，厚度 (μm) = 650 - 700
聚碳酸酯 (PC) 大东塑料PCS#6900厚度 (mm) = 1 和 5 
四异丙氧基钛，98%Sigma-Aldrich205273
聚乙烯吡咯烷酮，分子量 = 1,300,000Sigma-Aldrich437190
乙酸Sigma-Aldrich320099
无水乙醇Sigma-Aldrich459836
十三氟-1,1,2,2-四氢辛基-1-三氯硅烷Sigma-Aldrich448931
PDMS 及固化剂道康宁SYLGARD 184
GPDESGelest 公司SIG5832.0 
乙醇J T Baker
场发射扫描电子显微镜 (FE-SEM)FEINova NanoSEM
X 射线光电子能谱赛默飞世尔科技K-alpha
三维建模机M&I CNC 实验室，韩国数控铣床
蜡分配机韩拉精密工程有限公司，韩国定制
双面胶带FLEXcon，美国DFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95
切割绘图仪Graphtec 公司，日本Graphtec CE3000-60 MK2
旋涂仪MIDASSPIN-3000D
炉子（煅烧用）R. D. WEBB 公司WEBB 99
流变仪（粘附力测试）Thermo ScientificHaake MARS III - ORM 套件
氧气等离子体系统FEMTOCUTE
单克隆小鼠抗人高敏 C 反应蛋白 (hsCRP)Hytest 有限公司，芬兰4C28(克隆号 C5)
单克隆小鼠抗心肌肌钙蛋白 I (cTnI)Hytest 有限公司，芬兰4T21(克隆号 19C7)
HRP 标记的山羊多克隆抗高敏 C 反应蛋白 (hsCRP)Abcam plc.，马萨诸塞州ab19175
HRP 标记的小鼠单克隆抗心肌肌钙蛋白 I (cTnI)Abcam plc.，马萨诸塞州ab24460(克隆号 16A11)
高敏 C 反应蛋白 (hsCRP)Abcam plc.，马萨诸塞州ab111647
心肌肌钙蛋白 I (cTnI)Fitzgerald，马萨诸塞州30-AT43
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA7906
磷酸盐缓冲液 (PBS)Amresco 公司E404
血液采集管BD 真空采血管367844K2 EDTA 7.2 mg 加血液
采集管
SuperSignal ELISA femtoInvitrogen37074
模块化多功能酶标仪Perkin ElmerEnvision 2104
圆盘操作机韩拉精密工程有限公司，韩国定制
光电倍增管 (PMT)滨松光子学株式会社H1189-210
AutoCADAutodesk版本 2012设计软件
SolidWorks 3D CAD 软件 SOLIDWORKS 公司版本 2013三维设计软件
EdgecamVero 软件版本 2009.01.06928代码生成软件
DeskCNCCarken 公司版本 2.0.2.18数控铣床软件

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ELISA PDMS

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