病毒侵染细胞后细菌与真菌生物膜形成起始的测定

摘要

本文描述了一种用于测定细菌与真菌等跨域微生物在黏附于病毒感染的HeLa细胞单层时的相互关联及竞争关系的方法。该方案可拓展至多种原核生物、真核生物与病毒的组合研究。

摘要

跨分类界域的多微生物相互作用研究，迄今尚未探讨微生物组中的病毒成分如何影响其他微生物与病毒感染宿主细胞之间的后续相互作用。病毒与细菌及真菌的共存主要存在于口腔和生殖道的黏膜表面。黏膜细胞，特别是那些存在持续性慢性或潜伏性病毒感染的细胞，可能通过病毒介导的受体表达数量和类型改变，显著影响微生物组成员。宿主细胞膜结构的改变将导致正常菌群及机会性病原体在生物膜形成初始阶段的附着能力发生变化。 即，黏附。本研究描述了一种定量检测和直观观察HSV对生物膜形成初期（黏附）影响的方法 S. aureus 和 C. albicans.

引言

人类微生物组包含来自多个分类界别的多种生物，它们在人体内共享特定的地理区域。附着于细胞表面是生物膜形成的关键第一步，而生物膜形成是微生物组定植过程的一部分。微生物组中可能还包括引起慢性和持续性感染的病毒。这些病毒对细胞的慢性感染可能导致假定受体可用性的改变^1,2。此外，胞内病原体进入细胞也可能影响宿主细胞膜的流动性/疏水性，从而进一步改变其他微生物组成员（包括细菌和真菌）的附着能力。为了理解这些共定位于人体相同区域的多种病原体之间可能发生的相互作用，我们必须能够研究代表黏膜表面存在的各个分类界病原体之间的相互作用。

疱疹病毒科是一类微生物，作为微生物组的永久成员存在于100%的人类体内^3,4此外，这些病毒在有症状和无症状的情况下均可持续脱落。具体而言，单纯疱疹病毒1型和单纯疱疹病毒2型（HSV-1 和 HSV-2）是口鼻咽部及生殖道微生物组中的长期定植成员。在免疫功能正常的个体中，HSV-1 和 HSV-2 均可引起齿龈口炎以及生殖器疱疹。^5-8在这些部位，HSV 引起潜伏性感染，其特征是长期持续的无症状病毒脱落。⁹HSV进入细胞会导致细胞表面nectins、硫酸乙酰肝素、脂筏以及疱疹病毒进入受体/肿瘤坏死因子受体（HVEM/TNFr）表达的改变^10-25这些可能代表某些细菌和真菌共有的受体。 例如，S. aureus 和 白色念珠菌，尽管是机会性病原体，但仍可作为口鼻咽部黏膜微生物组的成员定植存在 ^26,27在口咽部内 S. aureus 和 C. albicans 占据两个不同的定植位点。在有天然牙齿的宿主中，口腔黏膜由HSV-1和 白色念珠菌， 而前鼻孔被占据 S. aureus²⁸。然而，尽管 体外 研究结果表明 S. aureus黏附于口腔上皮细胞， ^29,30 S. aureus 当正常组织存在时，口腔标本中很少分离到该微生物^29,30关于生殖道共定植生态位的研究尚少，仅有一些临床发现表明 S. aureus 与需氧性阴道炎相关，其特征为生殖道炎症、分泌物增多及性交疼痛，而 C. albicans 产生的黏膜病变与口腔内观察到的病变相似^31-35因此，尽管口腔和生殖道微生物组中的这些成员跨越不同的分类学界，但关于它们之间的相互作用如何影响其通过黏附宿主细胞表面启动生物膜形成能力的研究仍十分有限。⁵该方案已有效应用于确定共定植/感染的功能性后果。

方案

1. 单纯疱疹病毒（HSV）毒株及其处理

注意：所使用的带有β-半乳糖苷酶报告基因活性的重组非扩散型HSV-1(KOS) gL86和HSV-2(KOS) 333gJ^-由V. Twiari提供^36,37。

1. 使用同一批次的病毒，以1:1的比例与含20%胎牛血清（FBS）和脱脂奶粉的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）混合，于-80 °C保存备用。在病毒批次储存前，通过以下方法测定病毒浓度： o邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷（ONPG）和5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷（X-Gal）检测
2. 通过报告病毒进入实验，使用X-Gal染色法测定每次实验中病毒的感染活力及感染复数（MOI），具体步骤如前所述（图1)¹⁴.
3. 将病毒用Opt-MEM稀释至所需MOI。染色前用多聚甲醛（0.5 ml/孔）固定单层细胞。将病毒活性对照与多微生物检测板平行设置于另一块微量培养板中。

2. HeLa 299 细胞操作

1. 在含4.5 g/L葡萄糖、10%灭活胎牛血清（FBS）、庆大霉素（50 µg/ml）和L-谷氨酰胺的DMEM培养基中，于37 °C、5% CO₂条件下培养。当细胞融合度达到80%时，使用胰蛋白酶溶液（乙二胺四乙酸，0.53 M EDTA；0.05%胰蛋白酶；5 ml/瓶）进行传代。

3. C. albicans 操作处理

注意：C. albicans 来自临床实验室来源，保存于-80 °C的Remmel脱脂牛奶2x培养基中。

1. 将冻存菌种接种于沙氏葡萄糖培养基中（37 °C）培养。24 小时后，将白色念珠菌（C. albicans）转接至Fungisel培养基（37 °C，48 小时），用于后续实验。
2. 诱导生成芽管（GT）形态（挑取典型菌落，加入3 ml胎牛血清，37 °C孵育3小时，OD₆₀₀值为0.3）。孵育结束后，用HBSS缓冲液洗涤芽管细胞两次（4,000 × g离心）。将洗涤后的芽管重悬于预热的HBSS缓冲液中（37 °C，OD₆₀₀值为0.32）。经血细胞计数板镜检确认，芽管形态应占观察细胞总数的99%。
3. 制备酵母形态（YF）菌悬液：挑取典型Fungisel培养基上的菌落，重悬于HBSS缓冲液中（3 ml，OD₆₀₀值为0.32）。使用血细胞计数板在显微镜下计数每毫升中的酵母形态细胞数量。经血细胞计数板镜检确认，酵母形态应占观察细胞总数的99%。
4. 制备工作用真菌菌液（取250 µl芽管或酵母形态菌液加入25 ml HBSS缓冲液中，37 °C孵育，终浓度为10⁵ CFU/ml）。

4. S. aureus 操作处理

1. 将 S. aureus ATCC 25923 储存于-80 °C（脱脂牛奶保护剂，2倍浓度）。在绵羊血琼脂培养基（5%；37 °C；24 小时）上进行培养。挑选典型菌落，并于2天内转移至甘露醇盐培养基中制备菌种（37 °C；18 小时）。
2. 制备 S. aureus 菌液储备液（3 ml HBSS；光密度Abs₆₀₀为1.32，浓度为10⁸ CFU/ml）
   1. 制备工作用 S. aureus 储备菌液（取100 µl 储备菌液加入25 ml HBSS中，终浓度为10⁵ CFU/ml）。

5. Candida 和 S. aureus 悬液

1. 制备混合的 C. albicans 和 S. aureus 悬液（将250 µl YF或GT储备液与100 µl S. aureus 储备液加入25 ml HBSS中）。

6. 多微生物生物膜检测

1. 在96孔板中接种200 µl浓度为2 × 10⁵ 个HeLa细胞/ml的细胞悬液（汇合度达85%）。轻轻摇动培养板（30–45分钟；37 °C），然后置于培养箱中孵育（37 °C；5% CO₂，18小时）。用Opt-MEM洗涤单层细胞一次，随后在每孔中加入100 µl Opt-MEM稀释的HSV病毒（HSV-1 (KOS) gL86 或 HSV-2 (KOS) 33 gJ^-），感染复数（MOI）分别为50和10。将培养板置于37 °C、5% CO₂条件下孵育3小时。每天仅使用一种病毒株。
2. 用含Mg⁺²和Ca⁺²的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤感染后的单层细胞一次（100 µl），弃去PBS后每孔保留25 µl，再加入预温的HBSS。
   1. 根据表1所示，加入YF、GT和/或S. aureus的工作悬液（100 µl；靶细胞与细胞的比例为5:1；n=16）。将培养板静置孵育（30分钟；37 °C；5% CO₂）。
3. 孵育结束后，逐列吸去液体，并立即用300 µl含Mg⁺²和Ca⁺²的PBS重新填充。重复此洗涤步骤两次，然后每孔加入200 µl经滤膜除菌的放射性免疫沉淀分析裂解缓冲液（RIPA；1:50稀释）。
4. 迅速吹打裂解液以充分混匀，取50 µl滴加至甘露醇盐琼脂（MS）和/或沙氏葡萄糖琼脂（Fungisel，F）培养基上（参见图2）。使用90°弯角的玻璃涂布棒将裂解液均匀涂布。将培养基置于37 °C孵育18小时后，人工计数每块平板上的菌落数。对照组包括S. aureus和/或C. albicans在未感染HSV的HeLa细胞上的黏附情况。

7. 影像学研究

1. 用50 ml丙酮（置于100 ml烧杯中）清洗每片圆形玻璃盖玻片（12 mm）。用Kimwipes纸擦干并灭菌盖玻片（置于玻璃培养皿中）。用经酒精火焰灭菌的镊子将干燥且无菌的盖玻片放入无菌24孔板的各孔中。
2. 将HeLa细胞（1 ml；96孔板所用体积的5倍）加入含有经洗涤的无菌圆形玻璃盖玻片的24孔板各孔中。根据模板加入病毒、细菌和真菌。 （表2） 使用96孔板所需体积的5倍量，然后按照上述步骤6.2.1至6.4所述进行孵育和处理。
3. 最后一次洗涤后，用甲醇浸没载玻片以固定细胞，并让甲醇自然挥发。将载玻片于室温保存，直至染色。
4. 对于明场显微镜观察（最终放大倍数1,000倍），向含有甲醇固定的盖玻片的孔中加入去离子水。立即吸去水分。每张盖玻片上滴加革兰氏结晶紫染液。用去离子水洗涤盖玻片，去除未结合的染料。干燥盖玻片 原位 然后使用硬封固介质将它们粘附到已标记的载玻片上 （图3）.
5. 对于荧光显微镜观察（100倍物镜；最终原始放大倍数1,000倍），按照步骤7.4所述基本方法用缓冲液洗涤盖玻片以去除甲醇。将盖玻片在孔板中干燥。
   1. 干燥后，取下盖玻片并将其置于标记好的载玻片上。然后加入足量的1:20稀释的异硫氰酸荧光素（FITC）标记的单纯疱疹病毒1型和2型gD抗体溶液，以覆盖盖玻片（1–5 µl）。
   2. 在湿盒中于 37 °C 孵育载玻片 30 分钟。孵育结束后，用 PBS 洗涤盖玻片，更换 4 次。
   3. 最后一次洗涤后，将盖玻片放回已标记的载玻片上。用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI；湿盒中，37 °C孵育30分钟）染色。孵育结束后，用PBS更换4次洗涤盖玻片，然后用硬封固封片剂将其固定于已标记的载玻片上。
   4. 让封片剂在室温避光条件下固化24小时。使用亮场显微镜或配备FITC和DAPI截止滤光片的荧光显微镜，通过油镜观察盖玻片。至少观察50个视野（每种生物不少于100个细胞）的图像，进行共定位分析。图4).

结果

本报告所述系统所获得数据的稳健性水平见图2 a-f ³⁸。利用该系统，可阐明葡萄球菌与真菌同病毒感染细胞之间的相互作用及其对彼此黏附能力的影响。此类研究需要进行显微镜检查，如图3和图4³⁸所示，以确定多微生物相互作用是否发生在同一细胞上。本研究中观察到的差异性细胞相互作用，是HSV对葡萄球菌和真菌黏附能力进行调节的结果，且该调节具有病毒种类特异性。

S. aureus 和 C. albicans（GT 和 YF）均黏附于相同的未感染 HSV 的 HeLa 对照细胞。这种在细胞上的共定位表明，两者在黏附 HeLa 细胞时彼此之间无物理干扰，且所测得的差异性黏附水平很可能是由 HSV 介导的（图 3A, A1）³⁸。然而，...

讨论

目前尚无关于跨越多个分类学领域的宿主微生物组中永久性至半永久性成员之间复杂相互作用的信息。 即、原核生物、真核生物及病毒。因此，我们开发了一种新型 体外 研究生物膜启动的模型系统 S. aureus 和 C. albicans 在HSV-1或HSV-2感染的HeLa 229（HeLa）细胞上 ³⁸HeLa细胞模型系统具有独特的优势，这是因为它们不表达表面纤连蛋白，而纤连蛋白是以下两种物质的受体 S. aureus 和 C. albicans^39-41. 由于顶端 ⁴²黏膜上皮表面通常缺乏纤连蛋白，因此该系统更接近于自然感染与定植过程中所观察到的情况^43-47因此，我们能够更直接地研究特定病毒进入受体的转换在微生物组其他成员后续黏附过程中所起的作用。

利用具有进入能力但不能扩散的HSV-1和HSV-2，这些研究结果表明HSV-1或HSV-2的细胞进入使细胞对再次感染产生抗性 S. a...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
白色念珠菌
BBL 沙氏葡萄糖	BD	211584
Fungisel 琼脂	Dot Scientific	7205A
S.aureus
甘露醇盐琼脂	Troy Biologicals	7143B
羊血琼脂	Troy Biologicals	221239
Hela 细胞
1x DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基，含4.5 g/L葡萄糖和L-谷氨酰胺，不含丙酮酸钠）	康宁	10-017-CM
庆大霉素 50 mg/ml	Sigma	1397	50 µg/ml 终浓度于完全 DMEM 中
胰蛋白酶EDTA溶液（0.05%胰蛋白酶，0.53 M EDTA）1×	康宁	25-052-CI
胎牛血清	Atlanta Biologicals	S11150	完全DMEM中10%的终浓度
其他培养基与试剂
ONPG	赛默飞世尔科技	34055
超纯X-gal	Invitrogen	15520-018
1× HBSS（Hanks 平衡盐溶液）	康宁	20-021-CV
1× PBS	Dot Scientific	30042-500
RIPA 裂解	Life Technologies	89901
染色
甲醇	Fisher Scientific	A433P-4
HSV 1&2，特异性针对gD	ViroStat	196
DAPI	SIGMA	D8417-5MG
革兰氏结晶紫	Troy Biologicals	212527
材料与试剂
培养皿 100 × 15	Dot Scientific	229693
培养皿 150 x 15	Kord Valmark	2902
96孔板	Evergreen Scientific	222-8030-01F
24孔板	Evergreen Scientific	222-8044-01F
培养管 100 x 13	Thomas Scientific	9187L61
盖玻片圆片，12 mm	Deckglaser	CB00120RA1