持续静脉输注是研究小鼠卒中诱发脑水肿时使用精氨酸加压素受体拮抗剂考尼伐坦的首选给药途径

摘要

我们的研究揭示了康尼伐坦的有益作用依赖于在小鼠实验性卒中后给药方式。我们已建立了一项研究方案，通过静脉导管给予受体阻滞剂，以研究其对小鼠卒中诱发脑水肿形成的影响。

摘要

脑卒中是全球范围内导致发病和死亡的主要原因之一。脑卒中常伴随脑水肿及其他病理生理事件。在脑卒中引发的脑水肿发生与发展过程中，精氨酸加压素及其受体V1a和V2发挥着关键作用。近年来，V1a和V2受体阻断剂考尼伐坦作为一种潜在的减轻脑卒中后脑水肿的药物，正受到越来越多关注。然而，涉及考尼伐坦应用的脑卒中动物模型需要根据可行的给药途径进行优化。本文比较了在小鼠实验性脑卒中后，持续48小时静脉（IV）输注与腹腔（IP）注射考尼伐坦的治疗效果。我们建立了一种实验方案，将大脑中动脉闭塞与颈静脉导管植入相结合，用于静脉输注考尼伐坦（0.2 mg）或溶剂对照。另设不同动物组，每日给予0.2 mg考尼伐坦或溶剂对照腹腔注射。在持续静脉和腹腔给药后，评估实验性脑卒中引起的小鼠脑水肿情况。结果比较显示，持续静脉输注考尼伐坦可减轻小鼠缺血后脑水肿，而腹腔注射则无此效果。我们得出结论：本研究建立的模型可用于未来在脑卒中及脑水肿背景下考尼伐坦应用的相关研究。

引言

脑卒中对患者和临床医生而言仍然是巨大的负担。动物脑卒中模型已在实验室环境中使用了近二十年。¹ 然而，在动物实验中有效的治疗方法常常在人体中失败。² 治疗效果的这种差异可能由多种因素导致，例如动物研究中所用药物的给药途径、药物代谢和消除速率，以及其他诸多方面。脑卒中的一种主要并发症——脑水肿，是当前神经科学研究的重点。脑水肿形成的机制涉及由精氨酸加压素（AVP）对缺血性脑损伤的反应所引发的水和电解质平衡紊乱。³ 因此，AVP及其受体（V1a和V2）是研究缺血后脑水肿形成的主要关注点。³

我们已建立一种方法，用于研究混合型精氨酸加压素（V1a 和 V2）受体阻滞剂考尼伐坦对小鼠缺血后脑水肿的影响。⁴ 考尼伐坦的分子靶点⁵使其成为探索其在缓解脑水肿方面特性的合适候选药物。此外，考尼伐坦还需在卒中病理生理过程的背景下进行研究。⁶ 在设计本研究时，我们考虑比较两种不同给药途径下考尼伐坦的治疗效果：静脉注射（IV）⁴和腹腔注射（IP）。⁷ 评估了这些治疗对卒中诱导脑水肿的影响。本文详细描述了通过大脑中动脉闭塞（MCAO）手术诱导实验性卒中，随后通过颈静脉置入静脉导管进行持续考尼伐坦治疗的操作方案。卒中诱导后，动物被随机分配至以下各组：溶剂对照组或考尼伐坦（0.2 mg/天）静脉注射或腹腔注射治....

方案

实验严格按照美国国立卫生研究院关于实验动物护理和使用的指南进行，并经瑞典医学中心动物护理和使用委员会批准。所有操作均采用适当的无菌技术。本研究所用的实验动物为雄性、3月龄、野生型C57小鼠，体重为25至27 g。

1. 体内 脑卒中诱导

1. 手术前用牙科树脂预涂覆尼龙丝。
   1. 从7-0尼龙缝合线中截取一段12 mm长的尼龙丝。将2份树脂与1份硬化剂混合，立即把尼龙丝末端浸入混合液中，使约三分之一长度被覆盖。迅速取出，并确认其表面被一层光滑的牙科树脂涂层包裹。
   2. 将尼龙丝在空气中干燥2小时后使用。
2. 将小鼠放入麻醉诱导室（体积2 L），设置气流为2 L/min，其中含1.5%异氟烷和25%富氧空气，通入诱导室。
3. 让小鼠留在诱导室内直至完全麻醉⁸，以尾部夹捏无反应为判断标准。
4. 将小鼠置于带有加热垫的手术台上，通过鼻罩维持麻醉，将异氟烷浓度设为1%，由小鼠自主呼吸吸入。
5. 剪除颈部前后方的毛发，并用医用酒精喷洒颈部。在双眼涂抹兽用眼膏。
6. 手术期间使用连接至数字显示器的直肠温度探头持续监测体温。
7. 将小鼠置于仰卧位，用10%聚维酮碘擦洗液进行消毒，覆盖无菌手术巾，然后使用10号手术刀片沿颈部正中线做切口。
8. 用6-0丝线暂时结扎....

结果

动物的体温在整个脑卒中诱导手术过程中均保持在生理范围内且稳定。有两只小鼠在大脑中动脉闭塞（MCAO）后立即出现神经功能缺损评分（NDS）低于2的情况，因此被排除在研究之外。

小鼠MCAO模型在术后48小时可于同侧半球形成脑梗死体积。TTC染色切片结果显示，MCAO后约50%的半球受到梗死影响（图1D），该结果与Zeynalov, E. 和 Dore, S., 2009年发表的研究一致¹⁰。脑缺血性卒中的发生导致脑组织严重缺乏氧气和营养物质。由于局部脑组织缺氧，神经元和胶质细胞死亡，从而形成脑梗死区域。图1D展示了MCAO诱导梗死的典型小鼠脑切片，并对损伤范围进行了估算¹⁰

在大脑中动脉阻塞（MCAO）诱导60分钟后的48小.......

讨论

本研究对缺血性卒中的临床前研究具有重要意义。研究显示，在小鼠实验性卒中后持续静脉输注考尼伐坦（0.2 mg/天），治疗48小时后可有效减轻脑水肿。同时，本研究也探讨了腹腔注射相同剂量考尼伐坦对脑水肿的影响。无论是静脉还是腹腔给药途径，考尼伐坦治疗均可在小鼠中引起水利尿作用，表现为：1）血浆渗透压轻度升高至生理水平以上；2）由于肾脏中水重吸收受阻，尿液渗透压降低。因此，基于治疗效果，我们报告指出，静脉给药途径在抑制卒中诱发的脑水肿形成方面具有额外的重要益处。

我们的主要发现是，对于考尼伐坦而言，静脉给药途径在减轻脑水肿方面比腹腔给药途径效果更佳。考尼伐坦是一种V1a和V2受体联合拮抗剂，临床上可用于纠正低钠血症、血容量及渗透压异常¹⁶。已有研究表明，考尼伐坦可在多种疾病状态下改善患者的低钠血症¹⁷。考尼伐坦的临床可及性表明，将其应用于脑水肿的探索有望实现快速的从实验室到临床的转化。既往研究证实，通过脑室内注射方式给予实验性选择性V1a受体阻断剂，可减少缺血后脑水肿的形成^3,18。然而，这些研究中所使用的药物及其给药途径.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
加热垫	K&H Manufacturing Inc	1060
带直肠探头的温度监测仪	Physitemp	7029
6-0 丝线缝合线卷	Surgical Specialties Corporation	SP114
带针3-0 丝线缝合线	Ethicon	1684G
7-0 尼龙缝合线	Ethicon	1696G
含硬化剂的牙科树脂聚硅氧烷	Heraeus Kulzer	65817930
微输液静脉泵	Kent Scietific	GT0897
22GA旋转接头	Instech	375/22PS
实验室导管，0.94 mm × 0.51 mm	Dow Corning	508-002
实验室导管，3.18 mm × 1.98 mm	Dow Corning	508-009