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方法文章

持续静脉输注是研究小鼠卒中诱发脑水肿时使用精氨酸加压素受体拮抗剂考尼伐坦的首选给药途径

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DOI：

10.3791/54170

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2016年9月1日

 ,  , 
1Neurotrauma Research, Swedish Medical Center, 2Neurosurgery, Colorado Brain and Spine Institute

本文内容

摘要

我们的研究揭示了康尼伐坦的有益作用依赖于在小鼠实验性卒中后给药方式。我们已建立了一项研究方案，通过静脉导管给予受体阻滞剂，以研究其对小鼠卒中诱发脑水肿形成的影响。

摘要

脑卒中是全球范围内导致发病和死亡的主要原因之一。脑卒中常伴随脑水肿及其他病理生理事件。在脑卒中引发的脑水肿发生与发展过程中，精氨酸加压素及其受体V1a和V2发挥着关键作用。近年来，V1a和V2受体阻断剂考尼伐坦作为一种潜在的减轻脑卒中后脑水肿的药物，正受到越来越多关注。然而，涉及考尼伐坦应用的脑卒中动物模型需要根据可行的给药途径进行优化。本文比较了在小鼠实验性脑卒中后，持续48小时静脉（IV）输注与腹腔（IP）注射考尼伐坦的治疗效果。我们建立了一种实验方案，将大脑中动脉闭塞与颈静脉导管植入相结合，用于静脉输注考尼伐坦（0.2 mg）或溶剂对照。另设不同动物组，每日给予0.2 mg考尼伐坦或溶剂对照腹腔注射。在持续静脉和腹腔给药后，评估实验性脑卒中引起的小鼠脑水肿情况。结果比较显示，持续静脉输注考尼伐坦可减轻小鼠缺血后脑水肿，而腹腔注射则无此效果。我们得出结论：本研究建立的模型可用于未来在脑卒中及脑水肿背景下考尼伐坦应用的相关研究。

引言

脑卒中对患者和临床医生而言仍然是巨大的负担。动物脑卒中模型已在实验室环境中使用了近二十年。1 然而，在动物实验中有效的治疗方法常常在人体中失败。2 治疗效果的这种差异可能由多种因素导致，例如动物研究中所用药物的给药途径、药物代谢和消除速率，以及其他诸多方面。脑卒中的一种主要并发症——脑水肿，是当前神经科学研究的重点。脑水肿形成的机制涉及由精氨酸加压素（AVP）对缺血性脑损伤的反应所引发的水和电解质平衡紊乱。3 因此，AVP及其受体（V1a和V2）是研究缺血后脑水肿形成的主要关注点。3

我们已建立一种方法，用于研究混合型精氨酸加压素（V1a 和 V2）受体阻滞剂考尼伐坦对小鼠缺血后脑水肿的影响。4 考尼伐坦的分子靶点5使其成为探索其在缓解脑水肿方面特性的合适候选药物。此外，考尼伐坦还需在卒中病理生理过程的背景下进行研究。6 在设计本研究时，我们考虑比较两种不同给药途径下考尼伐坦的治疗效果：静脉注射（IV）4和腹腔注射（IP）。7 评估了这些治疗对卒中诱导脑水肿的影响。本文详细描述了通过大脑中动脉闭塞（MCAO）手术诱导实验性卒中，随后通过颈静脉置入静脉导管进行持续考尼伐坦治疗的操作方案。卒中诱导后，动物被随机分配至以下各组：溶剂对照组或考尼伐坦（0.2 mg/天）静脉注射或腹腔注射治疗组。

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方案

实验严格按照美国国立卫生研究院关于实验动物护理和使用的指南进行，并经瑞典医学中心动物护理和使用委员会批准。所有操作均采用适当的无菌技术。本研究所用的实验动物为雄性、3月龄、野生型C57小鼠，体重为25至27 g。

1. 体内 脑卒中诱导

  1. 手术前用牙科树脂预涂覆尼龙丝。
    1. 从7-0尼龙缝合线中截取一段12 mm长的尼龙丝。将2份树脂与1份硬化剂混合，立即把尼龙丝末端浸入混合液中，使约三分之一长度被覆盖。迅速取出，并确认其表面被一层光滑的牙科树脂涂层包裹。
    2. 将尼龙丝在空气中干燥2小时后使用。
  2. 将小鼠放入麻醉诱导室（体积2 L），设置气流为2 L/min，其中含1.5%异氟烷和25%富氧空气，通入诱导室。
  3. 让小鼠留在诱导室内直至完全麻醉8，以尾部夹捏无反应为判断标准。
  4. 将小鼠置于带有加热垫的手术台上，通过鼻罩维持麻醉，将异氟烷浓度设为1%，由小鼠自主呼吸吸入。
  5. 剪除颈部前后方的毛发，并用医用酒精喷洒颈部。在双眼涂抹兽用眼膏。
  6. 手术期间使用连接至数字显示器的直肠温度探头持续监测体温。
  7. 将小鼠置于仰卧位，用10%聚维酮碘擦洗液进行消毒，覆盖无菌手术巾，然后使用10号手术刀片沿颈部正中线做切口。
  8. 用6-0丝线暂时结扎左侧颈总动脉（CCA）。
  9. 在左侧颈外动脉（ECA）上放置另一根结扎线。
  10. 在颈内动脉（ICA）上放置一个微血管夹。
  11. 用微血管剪在颈外动脉上剪开一个小孔。将由7-0尼龙缝合线涂覆牙科树脂制成的线栓从ECA开口插入，并向头端推进，同时移除微血管夹，直至遇到阻力（距CCA分叉点约5–7 mm）。
  12. 在颈内动脉上放置临时结扎线以固定线栓位置。参见示意图图1A。用丝线缝合皮肤，并在颈部前方切口处浸润0.2 ml的0.5%布比卡因，操作同步骤2.6。
  13. 让小鼠在恢复室中从麻醉状态苏醒并恢复意识，持续60分钟。在小鼠恢复足够意识、能够维持胸卧位之前，不得无人看管。
  14. 对小鼠进行神经功能缺损评分（NDS）测试，标准如下：0 = 运动功能正常；1 = 提尾时躯干和对侧前肢屈曲；2 = 静息时正常，但向对侧转圈；3 = 静息时向对侧倾斜；4 = 无自发运动活动。4,9
    1. 进行NDS测试时，提起小鼠尾巴，将其置于平坦表面观察2–3分钟。也可在恢复室中观察小鼠行为。若小鼠NDS低于2分，表明大脑中动脉（MCA）闭塞不充分，应排除出实验。
      ​注意：可采用激光多普勒血流测定技术确认MCA闭塞情况。9-11
  15. 在恢复60分钟后，按上述方法再次将动物放入诱导室进行再麻醉，用10%聚维酮碘擦洗液重新消毒原皮肤切口，并剪开移除丝线，重新打开颈部前方的手术切口。
  16. 从ECA中取出线栓的操作步骤如下：
    1. 在ICA上放置一个微血管夹。松开ICA上的结扎线，在保持夹子开放状态下将线栓拉出。
    2. 关闭微血管夹，并在切口近端的ECA上结扎。
    3. 移除微血管夹，同时解除CCA上的结扎，以恢复脑部血流。参见示意图图1B。

2. 颈静脉插管以实现持续48小时给药

注意：在完成步骤 1.16.3 后，立即进行导管植入手术，无需唤醒小鼠。

  1. 使用两种不同尺寸的软管：将内层软管（外径 0.94 mm；用于输送输注药物）插入外层软管（外径 3.18 mm；用于保护内层软管）中。
  2. 将小鼠置于俯卧位，用 10% 聚维酮碘擦洗液进行消毒，使用 10 号外科手术刀片在颈部背部做 1 cm 切口。将小鼠转为仰卧位，用 10% 聚维酮碘擦洗液再次消毒颈部正面，并重新打开颈部正面的手术切口。将软管从背部切口皮下穿行至颈部正面，并从前方开放伤口处引出约 1 cm。
  3. 在颈部正面左侧距中线约 1 cm 处去除皮下脂肪组织。定位左侧颈静脉，在静脉上放置两条结扎线，间距 5 mm，并轻度拉伸静脉。用显微血管剪在两条结扎线之间的颈静脉上剪一小孔，将内层软管尖端向尾侧（朝向心脏方向）插入 5 mm。
  4. 用两条结扎线将软管固定于颈静脉。使用 3-0 丝线缝合颈部正面的皮肤。参见示意图 图 1C。
  5. 用缝线将软管固定在颈部背面的皮肤上，并通过旋转接头连接至微输注静脉泵。该旋转接头可使小鼠在笼内自由活动，同时能够正常接触食物和饮水。
  6. 在颈部正面和背面的皮肤切口处分别浸润 0.2 ml 的 0.5% 布比卡因，以预防术后疼痛。
    注意：根据各机构特定的动物实验方案，动物可在术前和术后接受阿片类药物、非甾体抗炎药（NSAIDs）或抗生素治疗。然而，上述治疗可能影响缺血性脑卒中结局的结果 （见 讨论部分）11-14。
  7. 让动物在恢复室中苏醒，随后将其单独饲养至实验终点。在动物恢复足够意识、能够维持胸卧位之前，不得无人看护。
  8. 设定持续 48 小时静脉输注考尼伐坦（0.14 mg/ml 溶于 5% 葡萄糖）或对照溶剂的输注速率为 1.5 ml/kg/hr4，并开始输注。
    注意：每只小鼠每日静脉输注的考尼伐坦总量应约为 0.2 mg，总体积为 1.44 ml。
    ​注意：每日两次腹腔注射考尼伐坦，每次总剂量为 0.2 mg，溶于 1.44 ml 的 5% 葡萄糖溶液中。腹腔注射操作方法如前所述15。通过抓握小鼠身体后部皮肤及尾巴固定小鼠。使用 26 G/1/2 英寸针头将考尼伐坦或对照溶剂注射至小鼠左下腹象限15。
  9. 在整个实验期间（48 小时），每天观察动物两次。确保动物可自由获取食物和饮水。若动物出现痛苦或呼吸困难的迹象，应咨询兽医。若动物处于严重痛苦状态需实施安乐死，请参照下文步骤 3.1，并将该动物从研究中剔除。

3. 终点时卒中诱发脑水肿的评估

  1. 使用5%异氟烷过量麻醉处死小鼠。
  2. 用手术刀沿颅骨中线做皮肤切口，向两侧剥离皮肤以暴露脑部上方的整个颅骨。从枕骨大孔开始，沿脑周缘在两侧横向切开颅骨，小心抬起颅骨，避免接触其下方的脑组织。切断脑与脊髓及附着于颅底的神经。
  3. 取出脑组织，分离嗅球和小脑，并沿大脑半球间裂将大脑分为缺血侧和非缺血侧大脑半球，操作方法如前所述9。
  4. 通过比较湿重与干重比值（WDR）评估脑水肿，方法如前所述4,9。将组织在100 °C烘箱中干燥3天前后分别称重。按以下公式计算脑含水量（BWC）：% H2O = (1 - 干重 / 湿重) × 100%。

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结果

动物的体温在整个脑卒中诱导手术过程中均保持在生理范围内且稳定。有两只小鼠在大脑中动脉闭塞（MCAO）后立即出现神经功能缺损评分（NDS）低于2的情况，因此被排除在研究之外。

小鼠MCAO模型在术后48小时可于同侧半球形成脑梗死体积。TTC染色切片结果显示，MCAO后约50%的半球受到梗死影响（图1D），该结果与Zeynalov, E. 和 Dore, S., 2009年发表的研究一致10。脑缺血性卒中的发生导致脑组织严重缺乏氧气和营养物质。由于局部脑组织缺氧，神经元和胶质细胞死亡，从而形成脑梗死区域。图1D展示了MCAO诱导梗死的典型小鼠脑切片，并对损伤范围进行了估算10

在大脑中动脉阻塞（MCAO）诱导60分钟后的48小...

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讨论

本研究对缺血性卒中的临床前研究具有重要意义。研究显示，在小鼠实验性卒中后持续静脉输注考尼伐坦（0.2 mg/天），治疗48小时后可有效减轻脑水肿。同时，本研究也探讨了腹腔注射相同剂量考尼伐坦对脑水肿的影响。无论是静脉还是腹腔给药途径，考尼伐坦治疗均可在小鼠中引起水利尿作用，表现为：1）血浆渗透压轻度升高至生理水平以上；2）由于肾脏中水重吸收受阻，尿液渗透压降低。因此，基于治疗效果，我们报告指出，静脉给药途径在抑制卒中诱发的脑水肿形成方面具有额外的重要益处。

我们的主要发现是，对于考尼伐坦而言，静脉给药途径在减轻脑水肿方面比腹腔给药途径效果更佳。考尼伐坦是一种V1a和V2受体联合拮抗剂，临床上可用于纠正低钠血症、血容量及渗透压异常16。已有研究表明，考尼伐坦可在多种疾病状态下改善患者的低钠血症17。考尼伐坦的临床可及性表明，将其应用于脑水肿的探索有望实现快速的从实验室到临床的转化。既往研究证实，通过脑室内注射方式给予实验性选择性V1a受体阻断剂，可减少缺血后脑水肿的形成3,18。然而，这些研究中所使用的药物及其给药途径...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢瑞典医疗中心提供资金和设施支持。同时感谢克雷格医院慷慨提供实验室空间。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
加热垫K&H Manufacturing Inc1060
带直肠探头的温度监测仪Physitemp7029
6-0 丝线缝合线卷Surgical Specialties CorporationSP114
带针3-0 丝线缝合线Ethicon1684G
7-0 尼龙缝合线Ethicon1696G
含硬化剂的牙科树脂聚硅氧烷Heraeus Kulzer65817930
微输液静脉泵Kent ScietificGT0897
22GA旋转接头Instech375/22PS
实验室导管，0.94 mm × 0.51 mmDow Corning508-002
实验室导管，3.18 mm × 1.98 mmDow Corning508-009

参考文献

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