一种获取去分化脂肪细胞的高效方法

摘要

我们已改进了DFAT细胞的生成条件，并在此提供有关使用优化培养基生产这些细胞的信息。

摘要

组织工程与细胞治疗在临床上具有广阔的应用前景。在这方面，多能细胞（如间充质干细胞，MSCs）有望在不久的将来被用于恢复受损器官的功能。然而，目前这些治疗方法的临床应用仍受到若干技术问题的限制，包括分离MSCs过程的高度侵入性以及其扩增效率低下等。本文介绍了一种高效生成去分化脂肪细胞（DFAT细胞，即类似MSC的细胞）的方法。有趣的是，DFAT细胞可被诱导分化为多种细胞类型，包括脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞。尽管此前已有其他研究团队提出了多种从成熟脂肪组织中生成DFAT细胞的方法，但我们的方法在效率上更具优势。在此，我们证明，添加20%胎牛血清（FBS）的DFAT细胞培养基（DCM）在生成DFAT细胞方面优于添加20% FBS的DMEM培养基。此外，采用本细胞培养方法获得的DFAT细胞还可被再分化为多种组织类型。因此，本研究提供了一个非常有趣且实用的组织去分化研究模型。

引言

细胞治疗与组织工程是再生医学领域的研究热点^1-5。尽管这些治疗手段具有广阔的应用前景，但目前仍存在若干技术难题，限制了其临床应用。在这方面，与诱导多能干细胞（iPS细胞）的制备类似，所有组织工程技术都必须产生不含外源基因转导的细胞，以确保患者安全。因此，我们研究团队首次成功制备了人源DFAT细胞⁶。此后，多个研究小组已采用我们的方法生成了哺乳动物来源的DFAT细胞^7-9，进一步凸显了该模型的实用价值。

在多项研究过程中，我们发现通过调整细胞培养基的成分，可以改变细胞培养环境的质量。这一发现提高了DFAT细胞制备的成功率，并改善了细胞质量；这两者都是高效生成用于未来临床试验细胞的关键因素。为此，我们开发了一种改良的DFAT细胞培养基（DCM，一种类似于间充质干细胞培养基的培养基，含有重组人胰岛素、血清白蛋白、L-谷氨酸以及多种脂肪酸和胆固醇）及一种DFAT细胞生成与扩增的方法（有关DCM成分的更多信息可应要求提供）。利用该方法，成功获得了高质量的DFAT细胞，这些细胞具有向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞等多种细胞类型分化的能力。总体而言，该经过验证的细胞培养方案提升了DFAT细胞的质量，在细胞治疗和组织工程的临床应用中具有重要价值。

方案

人皮下脂肪样本取自在日本东京日本大学板桥医院整形外科、泌尿科、小儿外科和骨科接受手术的患者。患者均签署书面知情同意书，研究方案经日本大学医学院伦理委员会批准。

1. 组织制备

1. 将手术室的组织样本运送至实验室。
2. 在50 ml离心管中，用5 ml不含磷酸盐的缓冲液（PBS(-)）于室温（RT）洗涤1-2 g脂肪组织一次，然后将样本置于10 cm塑料培养皿中。

2. 胶原酶消化

1. 从 PBS(-) 中取出样本，然后向含有组织样本的培养皿中加入 10 ml 无菌的 0.1% (w/v) 胶原酶溶液（胶原酶 II 型）。
2. 用手术剪将组织剪碎约 15 分钟，直至呈糊状。
3. 随后将剪碎的组织在 37 °C 条件下，于 50 ml 离心管中用 0.1% (w/v) 胶原酶溶液消化 30 分钟（60 rpm），并在摇床上轻轻振荡。
4. 将消化后的样本通过 100 µm 滤膜过滤至 50 ml 离心管中。接着，将 10 ml 添加了 2% FBS 的 DCM（见材料表）通过滤膜冲洗。

3. 细胞分离

1. 将过滤后的细胞在室温下以 100 × g 离心 1 分钟。
2. 此时，在 50 ml 离心管中准备 5 ml 含 2% FBS 的 DCM。
3. 接着，使用 1,000 µl 移液器吸取漂浮的脂肪细胞，并将细胞加入含有培养基的 50 ml 离心管中。
4. 随后，轻轻振荡 50 ml 离心管，使 DCM 培养基与细胞充分混匀。
5. 然后，将离心管在室温下以 100 × g 离心 1 分钟。
6. 使用 18 G 针头和 20 ml 注射器弃去管底的培养基。
7. 接着，向收集的细胞中加入 10 ml 含 2% FBS 的 DCM。
8. 通过轻轻振荡 50 ml 离心管，使 DCM 与细胞混匀。
9. 将离心管在室温下以 100 × g 离心 1 分钟。

4. 细胞接种

1. 向一个12.5 cm的培养瓶中加入41 ml添加了20% FBS的DCM或DMEM。
2. 接着，使用200 µl移液器向培养瓶中加入40 µl脂肪细胞。
3. 然后，用添加了20% FBS的DCM或DMEM补足培养瓶。关键步骤：此时应确保细胞在培养基中均匀分散。肉眼检查已脱落的细胞，之后将培养瓶平放在圆形培养皿的盖子上以保持水平。
4. 最后，将培养瓶放入培养箱中，在37 °C、5% CO₂条件下静置培养7天。
5. 培养一周后，倒置培养瓶并观察去分化脂肪细胞（DFAT细胞）。随后按照文献¹⁰所述方法评估DFAT细胞的生成效率，因为此时成纤维样细胞（DFAT细胞）已位于与脂肪细胞不同的区域。
6. 更换培养基时，移除之前的细胞培养液后，向培养瓶中加入5 ml添加了20% FBS的DCM或DMEM。更换培养基后，让DFAT细胞继续生长一周。
7. 使用细胞计数器，统计在不同细胞培养条件（DCM vs. DMEM）下生成的DFAT细胞数量。

结果

本研究改进了DFAT细胞生成的方法和工具包（图1）。我们的方法可使用含20%胎牛血清（FBS）的DCM和DMEM两种培养基生成DFAT细胞（图2A）。因此，我们比较了DCM与DMEM在DFAT细胞生成中的效率。结果显示，无论脂肪细胞数量如何，DCM在促进DFAT细胞增殖方面均比DMEM高出三倍（图2A和图2B）。与使用10% FBS的方案相比，使用20% FBS也能促进细胞生长（数据未显示）。我们进一步证实，利用DCM生成的DFAT细胞具有再分化为脂肪细胞以及分化为成骨细胞的能力（图3）。相关检测方法详见我们之前的研究⁶。

讨论

经历成熟过程的脂肪细胞 体外 去分化，即所谓的顶壁培养法，可使细胞逆转为更原始的表型并获得增殖能力。这类细胞被称为去分化脂肪细胞（DFAT细胞）。研究评估了DFAT细胞的多向分化潜能。流式细胞术分析和基因表达分析显示，与脂肪源性基质细胞（ASCs）相比，DFAT细胞具有更高的同质性。⁶事实上，DFAT细胞的细胞表面抗原谱与ASCs中的非常相似。⁶因此，DFAT细胞的功能可能与MSCs相似。

另一组成功生成 DFAT 细胞的研究团队采用了添加 20% 小牛血清的 DMEM F12 培养基^7-8。尽管我们尝试使用添加 10% FBS 的培养基来制备 DFAT 细胞，但该方案所产生的 DFAT 细胞数量显著低于添加 20% FBS 的条件（数据未显示）。因此，FBS 的浓度和/或其成分对于 DFAT 细胞的去分化和/或增殖均具有重要意义。作为未来研究的一部分，我们将进一步阐明血清成分调控 DFAT 细胞生成与增殖的机制。另一方面，DCM 中的葡萄糖、脂肪酸及其他化学成分含量低于本研究中使用的 DMEM。这...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CSTI303-MSC 培养基	CSTI	87-671	该培养基在文中定义为 DCM
PBS(-)	Wako	166-23555	不含 Mg2+ 和 Ca2+
DMEM 培养基	Gibco	11965-092
胎牛血清	Sigma	172012
II 型胶原酶	Sigma	C-6885
剪刀	高砂医用工业株式会社	TKZ-F2194-1
摇床	TAITEC	Bioshaker V.BR-36
Falcon 细胞筛，100 μm，黄色	CORNING LIFE SCIENCES	DL 352360
Falcon 12.5 cm² 倾斜颈矩形细胞培养瓶，带蓝色透气螺旋盖	CORNING LIFE SCIENCES	353107
18 G 针头	NIPRO	02-002
20 ml 注射器	NIPRO	08-753
Z 系列库尔特计数仪	BECKMAN COULTER	383550