方法文章

体细胞重编程的动力学测量和实时可视化

DOI：

10.3791/54190

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2016年7月30日

 ,  ,  , 
1Life Sciences Solutions, Thermo Fisher Scientific

本文内容

摘要

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在本研究中提出的协议描述用于通过使用流式细胞仪分析阳性和阴性的多能干细胞标志物的动力学测定的重编程级数的实时监测的方法。该协议还包括的iPSC产生过程中的形态和标志物或报告表达的基于成像的评估。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

体细胞重编程使成体细胞能够转化为来自不同遗传背景和疾病表型的诱导多能干细胞 （iPSC）。最近的进展确定了引入重编程因子的更有效、更安全的方法。然而，很少有工具可以监控和跟踪重编程的进展。目前监测重编程的方法依赖于形态的定性检查或用干细胞特异性染料和抗体染色。剖析 iPSC 生成过程的工具有助于更好地了解来自不同细胞来源的不同条件下的过程。

本研究提出了使用流式细胞术对重编程进程进行动力学测量以及通过成像进行实时监测的关键方法。为了测量重编程的动力学，使用针对阳性和阴性多能干细胞标志物的抗体在离散时间点进行流式分析。实时可视化和流程分析的结合能够对不同阶段的重编程进行定量研究，并提供更准确的不同系统和方法的比较。基于图像的实时分析用于连续监测成纤维细胞，因为它们在无饲养层培养基系统中被重编程。用活碱性磷酸酶染料或抗 SSEA4 或 TRA-1-60 抗体染色后，根据相差或荧光通道的汇合度测量集落形成的动力学。结果表明，汇合度的测量提供了半定量指标来监测重编程的进展。

引言

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源自患者的诱导多能干细胞（iPS细胞）是用于细胞治疗和药物筛选有希望的工具。它们提供了细胞治疗自体来源。此外，它们包括非常广泛的一套遗传背景，使得遗传疾病超出当前的胚胎干细胞（ESC）的线路将允许进行详细的体外分析。最近的进展已经导致几种方法的发展，用于产生iPSCs的，包括与仙台病毒，附加型质粒或mRNA的1,2-重新编程。值得注意的是，不同的重编程方法具有不同的效率和安全性的水平相关，并有可能在影响其是否适宜用于各种用途的其他方法不同。随着各种重编程技术的可用性，它已开发用于评估重编程过程的方法变得很重要。大多数现有的方法依赖于形态和染色质检查用干细胞特异性的染料和抗体。一个最近开发的方法使用的慢病毒荧光记者，是对特定的PSC-miRNA的或分化的细胞特异性的mRNA 3敏感。这种监测方法便于选择和重新编程的技术对不同的情况下的优化。例如，CDy1已经用作早期的iPSC的荧光探针以筛选重新编程调制器4。观察和比较不同的重编程实验的能力也更好地了解这个过程本身的关键。例如，现在已知的是一些体细胞类型更容易比其它5重新编程，并且使细胞重新编程6-8中经过中间状态。不幸的是，重编程过程所依据的机制仍然不完全了解，因此，重编程方法之间的确切的差别也仍然为defined。因此，对于监测方法，评估和比较重编程事件仍然是干细胞领域的关键。

在这个协议中所描述的....

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方案

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1.Solution和介质制备工艺

  1. 基底膜基质（从Engelbreth -霍尔姆-群肿瘤和纯化）
    1. 在4℃缓慢融化冰基底膜基质（5毫升）过夜。
    2. 稀释原液1:1在无菌，预先冷却的15毫升锥形管5 1ml冰冷，无菌的DMEM / F-12培养基中。分配等分入预冷的1.5毫升无菌微离心管，并立即在-20℃下储存。
    3. 过夜1基底膜基质等分试样在4℃:前使用，解冻冷冻的1。在使用时，进一步稀释1:1等份另外50倍用冰冷的，无菌的DMEM / F-12培养基以1:1的最终稀释度:100。
    4. 1适量添加:100稀释的基底膜基质溶液到适当的组织培养（TC）的容器和在37℃下孵育1小时。通常情况下，用3毫升稀释基底膜基质溶液的大衣一TC菜ØF 20厘米2表面面积，涂层的所有其他类型的TC菜/以0.15毫升，每表面积厘米2稀释基质的比板。吸除任何培养基和细胞的前向剩余溶液。
  2. 成纤维细胞中
    1. 在4℃解冻100毫升瓶装ES合格胎牛血清（ES-FBS）的过夜。
    2. 加50毫升解冻ES-FBS和5毫升的MEM非必需氨基酸溶液（1倍）的445的10ml DMEM培养基。通过0.22微米的过滤器消毒组合的组分，并在4℃下在介质储存最多至4周。
  3. ....

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结果

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监测重新编程动力学采用流式细胞仪

CD44是一种纤维原细胞标记，而SSEA4是PSC标记6,10。从该表达模式预期，流式细胞仪BJ成纤维细胞显示了一个SSEA4 - CD44 +群体便于与未染色的样品组合象限门的创作。在DF1成纤维细胞的仙台病毒的重新编程，CD44逐渐丧失，而SSEA4缓慢表示。在与仙台病毒转导后第3天，有SSEA4的人口众多- CD44 +细胞和SSEA4 + CD44 +细胞中的一小人口变成7天（ 图1）更明显。状态-在13日，双阳性人群对SSEA4 + CD44过渡。 17日，行政长官有很大比例在文化LLS已经SSEA4 + CD44 - 。

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讨论

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本研究提供了使用流式细胞术和基于实时成像的分析来监测和跟踪重编程过程的策略。该协议中的关键步骤是启动重编程、根据标记表达测量重编程进度以及实时监测重编程。可以使用任何选择的重编程方法，但在这里我们专注于基于仙台的人类成纤维细胞重编程。这种方法的优点是易于使用和始终如一的高效率的重编程。

为了评估重编程进展，在重编程的离散阶段收获细胞并进行终点流式细胞术分析。使用阴性PSC标记CD44和阳性PSC标记SSEA4对重编程培养物进行双染色，可以评估重编程进展6。更具体地说，在重编程的离散阶段表达其中一种、两者都不表达或两种标记物的细胞分布能够定量比较不同条件下的重编程动力学。这种方法可以证明不同重编程方法与重编程过程中使用的介质和矩阵之间的动力学和效率差异。使用不同的起始体细胞样品获得的结果证实了这些因素在重编程效率和进展中的重要性。他们还演示了如何使用这种方法来优化重编程方法。使用多能和非多能标记物（如EPCAM，CD24，CD73和B2M）的其他组合通过流式细胞术监测重编程的可行性可以与上述方法14结合使用。有趣的是，这些标记组合显示了通.......

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披露

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所有作者[地区总部，JSTA，KS，和UL]是的Thermo Fisher Scientific，这产生了一些在这篇文章中所使用的试剂和仪器的员工。

致谢

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作者感谢乍得麦克阿瑟有益的讨论。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEM，高葡萄糖，GlutaMAX 补充，丙酮酸Thermo Fisher Scientific10569-010
胎牛血清，胚胎干细胞合格，美国来源Thermo Fisher Scientific16141-061
MEM 非必需氨基酸溶液 （100x）Thermo Fisher Scientific11140-050
胰蛋白酶-EDTA （0.05%），酚红 Thermo Fisher Scientific25300-054
小鼠 （ICR） 灭活胚胎成纤维细胞Thermo Fisher ScientificA24903
附着因子蛋白 （1x）Thermo Fisher ScientificS-006-100
DMEM/F-12、GlutaMAX 补充剂Thermo Fisher Scientific10565-018
KnockOut 血清替代物Thermo Fisher Scientific
2-巯基乙醇 （55 mM）Thermo Fisher Scientific21985-023
胶原酶，IV 型，粉末Fisher Scientific17104-019
TrypLE Select 酶 （1x），无酚红 Thermo Fisher Scientific12563-011
DPBS，无钙，无镁 Thermo Fisher Scientific14190-144
Geltrex 无 LDEV、经 hESC 验证、低生长因子基底膜基质Thermo Fisher ScientificA1413302
Essential 8 培养基Thermo Fisher ScientificA1517001
FGF-Basic （AA 1-155） 重组人蛋白Thermo Fisher ScientificPHG0264
UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0Thermo Fisher Scientific15575-020
牛白蛋白组分 V（7.5% 溶液）Thermo Fisher Scientific15260-037
HEPES （1 M）Thermo Fisher Scientific15630-080
青霉素-链霉素 （10,000 U/ml）Thermo Fisher Scientific15140-122
InSolution Y-27632EMD Millipore688001
CytoTune-iPS 仙台病毒重编程试剂盒Thermo Fisher ScientificA1378001
CytoTune-iPS 2.0 仙台病毒重编程试剂盒Thermo Fisher ScientificA16517
Countess II 自动细胞计数仪Thermo Fisher ScientificAMQAX1000
Countess 细胞计数室载玻片Thermo Fisher ScientificC10228
BJ ATCC 人包皮成纤维细胞，新生儿ATCCCRL-2522
DF1 成人真皮成纤维细胞Thermo Fisher ScientificN/A
BG01V/hOG 细胞 变体 hESC hOct4-GFP 报告细胞Thermo Fisher ScientificR7799-105
IncuCyte ZOOMEssen BioScience
SSEA-4 抗体，Alexa Fluor 647 偶联物 （MC813-70）Thermo Fisher ScientificSSEA421
SSEA-4 抗体，Alexa Fluor 488 偶联物 （eBioMC-813-70 （MC-813-70））Thermo Fisher ScientificA14810
SSEA-4 抗体 （MC813-70）ThermoFisher Scientific41-4000
TRA-1-60 抗体 （cl.A）Thermo Fisher Scientific 41-1000
CD44 大鼠抗人/小鼠单克隆抗体（克隆 IM7），PE-Cy5 偶联物Thermo Fisher ScientificA27094
用于活细胞成像的 CD44 Alexa Fluor 488 偶联物试剂盒ThermoFisher ScientificA25528
CD44 大鼠抗人/小鼠单克隆抗体（克隆 IM7）Thermo Fisher ScientificRM-5700（已停售）
山羊抗小鼠 IgG （H+L） 二抗，Alexa Fluor 488 偶联物Thermo Fisher Scientific A-11029
山羊抗大鼠 IgG （H+L） 二抗，Alexa Fluor 594 偶联物Thermo Fisher Scientific A-11007
碱性磷酸酶活染色Thermo Fisher ScientificA14353
TRA-1-60 Alexa Fluor 488 偶联物试剂盒，用于活细胞成像Thermo Fisher ScientificA25618
CD24 小鼠抗人单克隆抗体（克隆 SN3），FITC 偶联物Thermo Fisher ScientificMHCD2401
β-2 微球蛋白抗体，FITC 偶联物 （B2M-01）ThermoFisher Scientific科学界A15737
EpCAM / CD326 抗体，FITC 偶联物 （VU-1D9）Thermo Fisher ScientificA15755
CD73 / NT5E 抗体 （7G2）Thermo Fisher Scientific41-0200
VECTOR 红色碱性磷酸酶 （AP） 底物试剂盒Vector LaboratoriesSK-5100
Zeiss Axio Observer.Z1 显微镜 卡尔蔡司491912-0003-000
FlowJo数据分析软件FLOJO，LLCN/A
Attune声学聚焦细胞仪，蓝色/红色激光Thermo Fisher Scientific使用Attune NXT 
S3e\ 细胞分选仪 （488/561 nm）BIO-RAD1451006
Falcon，带细胞过滤器盖的 12 x 75 mm 试管康宁352235
Falcon 15 ml，高透明度，圆顶密封螺帽康宁352097
Falcon T-175 培养瓶康宁353112
Falcon 6 孔培养皿康宁353046
Heracell CO2 滚动培养箱Thermo Fisher Scientific51013669
不粘、无 RNase 微量离心管、1.5 mlAM12450
HulaMixer 样品混合器15920D
10828010Thermo 剂 Falcon T-75 培养瓶 康宁 353136

参考文献

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  1. Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).
  2. Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481, 295-305 (2012).
  3. Kamata, M., ....

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标签

iPSC

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