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方法文章

体细胞重编程的动力学测量与实时可视化

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DOI：

10.3791/54190

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2016年7月30日

 ,  ,  , 
1Life Sciences Solutions, Thermo Fisher Scientific

本文内容

摘要

本研究中所述方案介绍了通过流式细胞术分析，对多能干细胞阳性与阴性标志物进行动力学检测，从而实时监测重编程进程的方法。该方案还包括基于成像技术对诱导性多能干细胞（iPSC）生成过程中的细胞形态、标志物或报告基因表达进行评估。

摘要

体细胞重编程技术已实现将来自不同遗传背景和疾病表型的成体细胞转化为诱导性多能干细胞（iPSC）。近期进展已鉴定出更高效且安全的重编程因子导入方法。然而，目前仍缺乏用于监测和追踪重编程进程的有效工具。现有的重编程监测方法主要依赖于对细胞形态的定性观察，或使用干细胞特异性染料和抗体进行染色检测。开发能够解析iPSC生成过程动态变化的工具，有助于更深入理解在不同条件下、源自多种细胞来源的重编程过程。

本研究介绍了利用流式细胞术进行重编程进程动力学检测以及通过成像进行实时监测的关键方法。为了测量重编程的动力学过程，在不同时间点使用针对多能干细胞阳性与阴性标志物的抗体进行流式分析。实时可视化与流式分析相结合，能够对重编程在不同阶段的过程进行定量研究，并实现对不同系统和方法之间更为准确的比较。采用基于图像的实时分析方法，对成纤维细胞在无饲养层培养体系中重编程过程进行连续监测。通过活细胞碱性磷酸酶染料或针对SSEA4及TRA-1-60抗体染色后，在相差或荧光通道中根据融合度来测定克隆形成动力学。结果表明，融合度的测量可提供用于监测重编程进程的半定量指标。

引言

患者来源的诱导性多能干细胞（iPSCs）是细胞治疗和药物筛选的有力工具。它们为治疗提供了自体细胞来源。此外，这类细胞涵盖了极为广泛的遗传背景，有助于深入研究 体外 分析目前胚胎干细胞（ESC）系所允许范围之外的遗传性疾病。近期的技术进步已催生出多种诱导多能干细胞（iPSCs）的生成方法，包括利用仙台病毒、附加体型质粒或mRNA进行重编程 1,2值得注意的是，不同的重编程方法在效率和安全性方面存在差异，并且在其他方面也可能有所不同，从而影响其在各种应用中的适用性。随着多种重编程技术的出现，开发评估重编程过程的方法变得尤为重要。目前大多数现有方法依赖于对细胞形态的定性观察，或使用干细胞特异性染料和抗体进行染色检测。一种近期开发的方法利用了慢病毒荧光报告系统，该系统对多能干细胞（PSC）特异性的miRNA或分化细胞特异性的mRNA具有敏感性。 3此类监测方法有助于针对不同情况选择和优化重编程技术。例如，CDy1 已被用作早期诱导多能干细胞（iPSCs）的荧光探针，以筛选重编程调节剂 4观察和比较不同重编程实验的能力对于深入理解重编程过程本身也至关重要。例如，目前已知某些体细胞类型的重编程难度低于其他类型。 5，并且细胞在重编程过程中会经历中间状态 6-8遗憾的是，重编程过程的潜在机制尚未被完全阐明，因此不同重编程方法之间的确切差异仍有待明确。因此，用于监测、评估和比较重编程事件的方法在干细胞领域仍然至关重要。

本方案中描述的方法可用于监测和评估重编程过程，并说明了如何利用这些技术来比较不同的重编程试剂组合。第一种方法涉及使用针对多能干细胞（PSC）阳性与阴性标志物的抗体组合进行流式细胞术分析。第二种方法结合了实时成像技术，通过测量总汇合度（细胞覆盖的表面区域百分比）以及标志物信号的汇合度（荧光信号覆盖的表面区域百分比）来进行分析。

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方案

1. 溶液与培养基的配制

  1. 基底膜基质（源自Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤的纯化产物）
    1. 将基底膜基质（5 ml）置于冰上，在4 °C下过夜缓慢解冻。
    2. 在无菌、预冷的15 ml锥形管中，用5 ml冰上预冷的无菌DMEM/F-12培养基将原液按1:1比例稀释。分装至预冷的1.5 ml无菌微量离心管中，并立即于-20 °C保存。
    3. 使用前，将1:1稀释的基底膜基质分装物在4 °C下过夜解冻。使用时，再用冰上预冷的无菌DMEM/F-12培养基进一步稀释50倍，最终稀释比例为1:100。
    4. 将适量1:100稀释的基底膜基质溶液加入相应的组织培养（TC）容器中，在37 °C孵育1小时。通常，使用3 ml稀释后的基底膜基质溶液包被表面积为20 cm2的TC培养皿；其他类型TC培养皿/板按每cm2表面积使用0.15 ml稀释基质的比例进行包被。在加入任何培养基和细胞前，吸除残留溶液。
  2. 成纤维细胞培养基
    1. 将100 ml ES级胎牛血清（ES-FBS）瓶置于4 °C下过夜解冻。
    2. 将50 ml解冻后的ES-FBS和5 ml MEM非必需氨基酸溶液（1x）加入445 ml DMEM培养基中。通过0.22 µm滤器过滤灭菌，4 °C保存，最长可保存4周。
  3. iMEF培养基
    1. 将100 ml ES-FBS瓶置于4 °C下过夜解冻。
    2. 将50 ml解冻后的FBS、5 ml MEM非必需氨基酸溶液（1x）和500 µl 2-巯基乙醇加入445 ml DMEM培养基中。
    3. 通过0.22 µm滤器过滤灭菌，4 °C保存，最长可保存4周。
  4. 碱性成纤维细胞生长因子溶液（b-FGF）
    1. 将10 µl血清替代物加入990 µl D-PBS中，通过反复吹打充分混匀。
    2. 将1 ml 1%（v/v）血清替代物溶液加入一支含10 µg冻干b-FGF的小瓶中，轻轻反复吹打彻底混匀。
    3. 将10 µg/ml b-FGF溶液分装至微量离心管中，每管200 µl，-20 °C保存，最多可使用4周。
  5. 人多能干细胞（hPSC）培养基
    1. 将100 ml血清替代物瓶置于4 °C下过夜解冻。
    2. 将100 ml解冻后的血清替代物、5 ml MEM非必需氨基酸溶液（1x）和500 µl 2-巯基乙醇加入395 ml DMEM/F-12培养基中。
    3. 通过0.22 µm滤器过滤灭菌，4 °C保存，最长可保存4周。
    4. 使用时，将hPSC培养基预热至37 °C，并补充4 ng/ml bFGF。
  6. iMEF条件培养基（CM）
    1. 向T-175培养瓶中加入18 ml 0.1%明胶，37 °C孵育1小时。
    2. 孵育1小时后移除0.1%明胶溶液，加入含45 ml iMEF培养基的有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞（iMEF）9.1 × 106个，37 °C培养箱中过夜孵育。
    3. 过夜孵育后，移除旧iMEF培养基，室温下用25 ml D-PBS洗涤一次，持续5分钟。
    4. 吸除D-PBS洗涤液，加入90 ml预热的hPSC培养基（含4 ng/ml bFGF），在37 °C培养箱中精确孵育24小时。
    5. 孵育24小时后，无菌条件下从iMEF培养瓶中收集hPSC培养基，经0.22 µm滤器过滤灭菌，分装至50 ml锥形管中，-20 °C冷冻保存备用。iMEF CM可在-20 °C保存最长6个月。
    6. 向iMEF培养瓶中再次加入90 ml预热的含4 ng/ml bFGF的hPSC培养基，37 °C培养箱中精确孵育24小时。可重复收集条件培养基，最长持续7天。
    7. 使用时，将iMEF-CM预热至37 °C，并补充4 ng/ml bFGF。
  7. E8培养基
    1. 将10 ml E8添加剂在4 °C下过夜解冻。
    2. 从E8基础培养基中移除10 ml，将解冻后的E8添加剂无菌加入剩余的基础培养基中，充分混匀后经0.22 µm滤器过滤灭菌。完全培养基4 °C保存，最长可保存2周。
    3. 使用时，将所需分装的培养基预温至室温。不建议将E8培养基预热至37 °C。
  8. 细胞分选缓冲液
    1. 在细胞分选前新鲜配制分选缓冲液：将EDTA溶液（终浓度1 mM）、HEPES缓冲液（终浓度25 mM）、青霉素/链霉素溶液（终浓度100单位/ml）和牛血清白蛋白（终浓度1%）加入无钙镁的杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's Phosphate Buffered Saline）中。
    2. 使用前经0.22 µm滤器过滤灭菌。
  9. 细胞分选后恢复培养基
    1. 在50 ml成纤维细胞培养基中加入青霉素/链霉素（终浓度100单位/ml）和ROCK抑制剂Y-27632（终浓度10 µM），配制成细胞分选后恢复培养基。接种分选细胞前，将该培养基预热至37 °C。

2. 仙台病毒介导的人成纤维细胞重编程

  1. 使用仙台病毒进行转导前 24 小时，以每孔 2 × 105 个细胞的密度将成纤维细胞接种至 6 孔组织培养板中所需的孔内。
  2. 在第 0 天进行转导，步骤如下：
    1. 将 2 ml 成纤维细胞培养基在 37 °C 水浴中预热。从 -80 °C 保存处取出一组仙台病毒管，逐管解冻：先将管底浸入 37 °C 水浴中 5–10 秒，然后将管子从水浴中取出，在室温下继续解冻。解冻后，短暂离心管子，并立即置于冰上。
    2. 使用商品化的第二代仙台病毒，根据每管的检验证书（COA）推荐体积，向每孔 1 ml 预热的成纤维细胞培养基中加入适量病毒，以达到以下感染复数（MOI）：KOS = 5 × 106 CIU，hc-Myc = 5 × 106 CIU，hKlf4 = 3 × 106 CIU。
    3. 通过轻柔吹打充分混匀病毒溶液。下一步操作需在 5 分钟内完成。
    4. 吸除待重编程成纤维细胞孔中的培养基，每孔加入 1 ml 病毒溶液。将细胞置于 37 °C、5% CO2 培养箱中过夜培养。
  3. 过夜培养后，吸除转导培养基，并将旧培养基按规范处理（使用 10% 漂白液处理 30 分钟）。每孔更换为 2 ml 预热的成纤维细胞培养基，继续培养转导后的细胞。
  4. 继续培养细胞 6 天，每隔一天更换一次新鲜的成纤维细胞培养基。
    注意：重编程细胞在转导后 7 天内不得传代。
  5. 第 6 天：准备用于诱导多能干细胞（iPSC）生成的培养皿
    1. 对于饲养层依赖型 iPSC 生成，向 6 孔组织培养（TC）板的每孔中加入 1.5 ml 0.1% 明胶溶液，在 37 °C 下孵育 1 小时。
    2. 孵育 1 小时后，吸除 0.1% 明胶溶液。每孔加入含 3 × 105 个有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞（iMEF）的 2 ml iMEF 培养基，于 37 °C 培养箱中过夜孵育。
    3. 对于非饲养层依赖型 iPSC 生成，向 6 孔组织培养（TC）板的每孔中加入 1.5 ml 稀释的基底膜基质（1:100 稀释），在 37 °C 下孵育 1 小时。
  6. 转导后第 7 天，收获转导的成纤维细胞，并将其重新接种至预先准备好的培养皿中，用于 iPSC 克隆的生成。
    1. 吸除成纤维细胞中的常规培养基，用 2 ml D-PBS 洗涤细胞一次。
    2. 吸除 D-PBS 洗涤液，每孔加入 0.5 ml 预热的 0.05% 胰蛋白酶/EDTA。在 37 °C 下孵育 3–5 分钟。
    3. 当细胞变圆后，每孔加入 2 ml 预热的成纤维细胞培养基以终止消化。通过轻柔吹打培养基使细胞从孔底脱落。将细胞悬液收集至 15 ml 圆锥形离心管中。
    4. 以 200 × g 离心 2 分钟。吸除上清液，用 2 ml 新鲜预热的成纤维细胞培养基重悬细胞。
    5. 采用合适的方法（血细胞计数板或自动细胞计数仪）计数细胞，并按每孔 5 × 104 个细胞（饲养层依赖条件）或 1 × 105 个细胞（非饲养层依赖条件）接种至预先准备的 6 孔板中，于 37 °C、5% CO2 培养箱中过夜培养。
    6. 过夜培养后，根据实验需求更换为 hPSC 培养基、E8 培养基或 iMEF 条件培养基。此后每天更换新鲜培养基。

3. 利用仙台病毒重编程由BGO1v hOct4-GFP报告基因人胚胎干细胞（hESC）衍生的继代成纤维细胞

  1. 按照先前所述方法9，从BG01v hOct4-GFP报告基因hESC系中衍生次级人成纤维细胞。
  2. 在转导前两天，使用成纤维细胞培养基将BGO1v/hOG来源的成纤维细胞以每孔2 × 105个细胞的密度接种至6孔板中的两个孔。
    1. 转导当天，将2 ml成纤维细胞培养基预热至37 °C。
    2. 从-80 °C冰箱中取出一组仙台病毒管。将小瓶从包装袋中取出，逐个解冻：先将管底浸入37 °C水浴中5–10秒，随后在室温下继续解冻。解冻后，短暂离心病毒管，并立即置于冰上。
    3. 根据说明书（CoA）推荐的体积，取三种仙台病毒液指定体积加入2 ml已预热至37 °C的成纤维细胞培养基中，通过反复吹打充分混匀病毒溶液。下一步操作需在5分钟内完成。
      注意：本实验采用的MOI为5:5:6。
    4. 吸除待转导成纤维细胞孔中的培养基，向每个待转导孔中加入1 ml病毒悬液。将细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中过夜培养。
    5. 过夜培养后，移除转导培养基并按规定进行处理（使用10%次氯酸钠溶液处理30分钟）。每孔更换为2 ml预热的新鲜成纤维细胞培养基，继续培养已转导的细胞。
  3. 继续培养细胞6天，每隔一天更换一次新鲜成纤维细胞培养基。
    1. 转导后第7天，收集已转导的成纤维细胞，并重新接种至预先制备好的培养皿中，用于诱导多能干细胞（iPSC）克隆的生成。
    2. 吸除成纤维细胞的常规培养基，用2 ml D-PBS洗涤细胞一次。
    3. 吸除D-PBS洗涤液，每孔加入0.5 ml预热的0.05%胰蛋白酶/EDTA溶液。在37 °C孵育3–5分钟。
    4. 当细胞变圆后，每孔加入2 ml预热的成纤维细胞培养基以终止消化。通过轻轻吹打培养基使细胞脱离孔底，将细胞悬液收集至15 ml锥形离心管中。
    5. 以200 × g离心2分钟。吸除上清液，用适量新鲜预热的成纤维细胞培养基重悬细胞。
    6. 采用合适的方法（血细胞计数板或自动细胞计数仪）对细胞进行计数。
    7. 以每孔1 × 105个细胞的密度将转导后的细胞接种至基底膜基质包被的6孔板中，置于37 °C、5% CO2培养箱中过夜培养。
  4. 过夜培养后，更换为添加了10 ng/ml b-FGF的iMEF条件培养基（iMEF CM），此后每天更换新鲜的iMEF CM。
  5. 转导后三周，通过机械法分离并转移目标克隆，用于克隆扩增或后续分析。

4. 成纤维细胞重编程的活细胞成像

  1. 实时监测
    1. 使用仙台病毒重编程试剂盒转导后第7天，将所需数量的细胞以先前所述的培养基和基质系统接种至6孔板中。将接种后的培养板置于加湿培养箱内的成像仪中，培养箱条件设置为37 °C、5% CO2。
    2. 根据制造商的操作说明，设置成像软件以固定时间间隔（每6–8小时）对每个孔进行全孔成像，持续14天。
      注：常规重编程过程中选择相位对比图像设置以评估克隆的发育进程。对于源自BG01v/hOG的成纤维细胞重编程，建议同时采集相位对比图像和绿色荧光通道图像，以便在整个重编程过程中追踪内源性OCT4-GFP报告基因的重新激活情况。
    3. 每天更换培养基，可使用hPSC培养基、E8培养基或iMEF-CM，具体根据实验设计而定，操作方式同转导后第8至21天所述。之后可通过间接免疫荧光法进一步分析各孔中的克隆形成情况。
    4. 在实验第19至21天结束时，移除各孔中的培养基，准备使用所选的成纤维细胞和干细胞标志物抗体进行检测。
    5. 用2 ml预热的DMEM/F-12培养基洗涤每个孔一次。
    6. 在1 ml DMEM/F-12培养基中分别配制各对阳性和阴性一抗混合液，具体如下：抗小鼠SSEA4抗体（1:200）与抗大鼠CD44抗体（1:50）、抗小鼠TRA-1-60抗体（1:200）与抗大鼠CD44抗体（1:50），以及碱性磷酸酶活体染色试剂（1:50）与抗大鼠CD44抗体（1:50）。将1 ml一抗溶液加入对应的孔中，在37 °C下孵育45分钟。
    7. 吸除一抗溶液，并用预热的DMEM/F-12培养基洗涤两次。
    8. 在DMEM/F-12培养基中配制二抗溶液（每孔1 ml），使用山羊抗小鼠Alexa Fluor 488偶联二抗（1:500）检测绿色荧光，山羊抗大鼠Alexa Fluor 594偶联二抗（1:500）检测红色荧光。在最后一次洗涤后加入各孔中，在37 °C下孵育30分钟。
      注：由于碱性磷酸酶活体染色（APLS）信号具有瞬时性，应先单独进行抗CD44一抗孵育，而在与二抗孵育时再加入APLS。
    9. 完成二抗孵育后，吸除溶液并用DMEM/F-12培养基洗涤两次。在最终成像前，向每个孔中加入新鲜预热的DMEM/F-12培养基。
    10. 设置成像软件，使用三种扫描参数（相位对比、绿色荧光和红色荧光）对每个孔进行全孔成像。以不同放大倍数获取图像，并利用软件生成延时视频以监测细胞生长和标志物表达情况。操作遵循制造商的协议。
    11. 利用分析软件，通过相位对比图像和绿色荧光单位随时间的变化，评估BG01v/hOG重编程过程中孔内细胞的汇合度。
  2. 利用细胞表面标志物监测重编程中间阶段
    1. 在不同时间点通过使用不同干细胞阳性/阴性标志物的抗体对重编程培养板进行检测，以监测重编程事件的进展。根据重复样本的可用性，每隔2至3天检测一次培养物。在第19至21天采用双染色策略对重编程培养板进行检测，根据染色模式识别完全重编程的iPSC克隆和部分重编程的克隆。
    2. 在目标时间点，吸除待检测孔中的常规生长培养基，准备使用所选标志物的抗体进行检测。
    3. 用2 ml预热的DMEM/F-12培养基洗涤每个孔一次。
    4. 在1 ml DMEM/F-12培养基中分别配制各对阳性和阴性一抗混合液，具体如下：与绿色荧光染料偶联的SSEA4抗体（1:200）、与绿色荧光染料偶联的TRA-1-60抗体（1:50）、活体碱性磷酸酶染色试剂（1:500）、与绿色荧光染料偶联的CD24抗体（1:50）、与绿色荧光染料偶联的B2M抗体（1:50）、与绿色荧光染料偶联的EpCAM抗体（1:50）、未偶联的小鼠CD73抗体（1:100），后者通过与绿色荧光染料偶联的山羊抗小鼠二抗（1:500）进行检测，以及未偶联的大鼠CD44抗体（1:50），后者通过与红色荧光染料偶联的山羊抗大鼠二抗（1:500）进行检测。将1 ml一抗溶液加入对应的孔中，在37 °C下孵育45分钟。
    5. 吸除一抗溶液，并用预热的DMEM/F12培养基洗涤两次。
    6. 对于未偶联的一抗，采用两步法：配制相应的二抗溶液，在37 °C下孵育30分钟。需确认二抗针对一抗的宿主种属且无交叉反应。按前述方法执行额外的洗涤步骤。
    7. 完成所有必要的洗涤后，在最终成像前向每个孔中加入新鲜预热的DMEM/F-12培养基。
    8. 使用荧光显微镜在适当的滤光片下以100倍放大倍数采集荧光图像，并利用现有的分析软件对图像进行分析。

5. 使用流式细胞术测量重编程动力学

  1. 利用细胞表面抗体进行重编程的定量动力学测量
    1. 在进行重编程之前，为每个时间点设置适当数量的重编程实验。若要测量重编程最初7天内的动力学变化，需针对每个期望的时间点分别进行独立的转导实验。对于第7天之后的时间点，应接种足够数量的无需饲养层的实验组，以持续监测重编程事件。一个6孔板中的单个孔即可提供足量细胞用于流式细胞术分析。
    2. 从各个独立孔中测量所有期望的重编程时间点，因为本实验为终点检测。吸除目标孔中的成纤维细胞培养基，用D-PBS洗涤一次。
    3. 吸除D-PBS洗涤液，在待检测的孔中加入1 ml 0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液，室温孵育5分钟。
    4. 孵育结束后，通过将1 ml细胞悬液反复吹打孔壁使细胞充分解离为单细胞，然后将悬液转移至15 ml锥形管中。用3 ml D-PBS冲洗孔内残留细胞并加入同一锥形管中，再加入10 ml D-PBS进一步稀释管中细胞悬液。
    5. 以200 × g离心2分钟，吸除上清液，将沉淀重悬于1 ml DMEM/F-12培养基中。根据需要进行细胞计数，制备浓度低于1 × 106 个细胞/ml的标准细胞悬液。
    6. 在1 ml DMEM/F-12培养基中配制所需量的直接标记的阳性/阴性抗体，用于少于1 × 106 个细胞/ml的样本，使用以下组合：SSEA4偶联绿色荧光荧光素（1:200）与CD44偶联PE-Cy5，或CD44偶联绿色荧光荧光素与SSEA4偶联远红荧光荧光素。将抗体与细胞悬液在室温下孵育45分钟。
    7. 吸除一抗溶液，用预温的DMEM/F-12培养基洗涤两次。
    8. 吸除最后一次洗涤液，将细胞沉淀重悬于1 ml D-PBS中。将每份悬液转移至独立的FACS管中。
    9. 使用适当的阴性对照（未染色对照和同型对照），在流式细胞仪上确认合适的前向散射和侧向散射图谱及电压设置。根据单染参数设定相应荧光素的电压，使蓝色激光激发绿色荧光素并在BL1通道采集信号，红色激光激发远红荧光素和PE-Cy5荧光素并在RL1通道采集信号。采集每个时间点的双染细胞群体数据。
    10. 使用适当的分析软件分析每个时间点的FCS文件，并利用编辑器整理数据，以观察细胞群体随时间的表达变化趋势。
    11. 若需在不同时间点进行细胞分选，请遵循步骤5.1.1至5.1.6。根据所用细胞分选仪的激光配置选择合适的荧光素组合。
    12. 最后一次洗涤后，将细胞沉淀重悬于1 ml细胞分选缓冲液中。使用未染色对照设置细胞分选仪的前向散射和侧向散射参数，再利用单染对照设定每种荧光素的合适检测参数。
    13. 取少量双染细胞悬液，选择待分选的两个细胞群体，并设定相应的电荷，以确保分选后细胞被正确收集。
    14. 在收集管中加入200 µl细胞回收培养基，以确保分选过程中细胞悬液得到缓冲和保护。收集目标数量的细胞，并转移至含有新鲜配制回收培养基的新iMEF培养皿中。
    15. 在回收培养基中过夜孵育后更换培养基。此后必须使用含青霉素/链霉素（终浓度100单位/ml）的人多能干细胞培养基对培养物进行常规换液和传代。

6. 终点分析

  1. 末端碱性磷酸酶（AP）染色
    1. 采用末端显色法碱性磷酸酶染色，以将观察到的动力学和形态学事件与最终的重编程效率相关联。
    2. 重编程培养21天后，移除待染色孔中的培养基，并用200 mM Tris-HCl（pH 8.0）洗涤一次。
    3. 根据制造商说明书，在200 mM Tris-HCl中配制适量的染色液。
    4. 吸除洗涤液，向每孔加入2 ml配制好的染色液。室温避光孵育20至30分钟。
    5. 吸除染色液，用200 mM Tris-HCl洗涤一次。去除洗涤液后，在观察前加入蒸馏水。
    6. 使用普通数码相机采集比色信号。手动计数呈阳性染色的克隆数量。由于该染料本身具有荧光特性，可使用Trit-C通道进行荧光分析，并利用全孔成像仪进行全孔成像与分析。具体操作请参照制造商提供的方案。

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结果

使用流式细胞术监测重编程动力学

CD44 是成纤维细胞的标志物，而 SSEA4 是多能干细胞（PSC）的标志物 6,10. 根据这一表达模式，对BJ成纤维细胞进行流式细胞术分析显示SSEA4- CD44+ 群体，该群体可与未染色样本结合用于创建象限门。在利用仙台病毒对DF1成纤维细胞进行重编程的过程中，CD44逐渐丢失，而SSEA4则缓慢表达。在仙台病毒感染后第3天，已出现大量SSEA4阳性细胞群体。- CD44+ 细胞和一小部分SSEA4阳性细胞+ CD44+ 细胞在第7天变得更加明显（图1。在第13天，双阳性群体向SSEA4转变+ CD44- 状态。到第17天，培养物中已有很大比例的细胞为SSEA4阳性...

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讨论

本研究提供了利用流式细胞术和基于实时成像的分析方法来监测和追踪重编程过程的策略。该方案中的关键步骤包括启动重编程、根据标志物表达水平评估重编程进程以及对重编程过程进行实时监测。可采用任意选择的重编程方法，但本文重点介绍基于仙台病毒的人类成纤维细胞重编程。该方法的优势在于操作简便且重编程效率稳定且高。

为评估重编程进程，可在重编程的不同阶段分别收集细胞，并进行终点流式细胞术分析。通过对重编程培养物进行PSC阴性标志物CD44和PSC阳性标志物SSEA4的双染色，可评估重编程的进展情况6。更具体而言，通过分析在重编程各个阶段表达其中一种、两种均不表达或两种均表达的细胞分布情况，可对不同条件下的重编程动力学进行定量比较。该方法能够揭示不同重编程方法以及重编程过程中所使用的培养基和基质在动力学和效率上的差异。利用不同起始体细胞样本所得的结果证实了这些因素在重编程效率和进程中的重要性，同时也展示了该方法可用于优化重编程方案。通过流式细胞术监测重编程过程的可行性还可扩展至其他多能性与非多能性标志物组合，例如EPCAM、CD24、CD73和B2M，这些组合可与前述方法联合使...

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披露

所有作者 [RHQ、JSTA、KS 和 UL] 均为赛默飞世尔科技公司的员工，该公司生产本文所用部分试剂和仪器。

致谢

作者感谢 Chad MacArthur 提供的有益讨论。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEM，高糖，含GlutaMAX补充剂，含丙酮酸钠Thermo Fisher Scientific10569-010
胎牛血清，适用于胚胎干细胞，美国来源Thermo Fisher Scientific16141-061
MEM非必需氨基酸溶液（100倍浓缩）Thermo Fisher Scientific11140-050
胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红 Thermo Fisher Scientific25300-054
小鼠（ICR）失活胚胎成纤维细胞Thermo Fisher ScientificA24903
贴壁因子蛋白（1倍浓度）Thermo Fisher ScientificS-006-100
DMEM/F-12，含GlutaMAX补充剂Thermo Fisher Scientific10565-018
KnockOut血清替代物Thermo Fisher Scientific10828010
2-巯基乙醇（55 mM）Thermo Fisher Scientific21985-023
IV型胶原酶，粉末Thermo Fisher Scientific17104-019
TrypLE Select酶（1倍浓度），无酚红 Thermo Fisher Scientific12563-011
不含钙、镁的DPBS Thermo Fisher Scientific14190-144
Geltrex LDEV-Free，适用于hESC，低生长因子基底膜基质Thermo Fisher ScientificA1413302
Essential 8培养基Thermo Fisher ScientificA1517001
碱性成纤维细胞生长因子（氨基酸1-155），重组人源蛋白Thermo Fisher ScientificPHG0264
UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0Thermo Fisher Scientific15575-020
牛血清白蛋白V组分（7.5%溶液）Thermo Fisher Scientific15260-037
HEPES（1 M）Thermo Fisher Scientific15630-080
青霉素-链霉素（10,000 U/ml）Thermo Fisher Scientific15140-122
InSolution Y-27632EMD Millipore688001
CytoTune-iPS Sendai重编程试剂盒Thermo Fisher ScientificA1378001
CytoTune-iPS 2.0 Sendai重编程试剂盒Thermo Fisher ScientificA16517
Countess II全自动细胞计数仪Thermo Fisher ScientificAMQAX1000
Countess细胞计数板Thermo Fisher ScientificC10228
BJ ATCC人包皮成纤维细胞，新生ATCCCRL-2522
DF1成人人皮肤成纤维细胞Thermo Fisher ScientificN/A
BG01V/hOG细胞 变异型人胚胎干细胞 hOct4-GFP报告细胞Thermo Fisher ScientificR7799-105
IncuCyte ZOOMEssen BioScience
SSEA-4抗体，Alexa Fluor 647标记（MC813-70）Thermo Fisher ScientificSSEA421
SSEA-4抗体，Alexa Fluor 488标记（eBioMC-813-70 (MC-813-70)）Thermo Fisher ScientificA14810
SSEA-4抗体（MC813-70）Thermo Fisher Scientific41-4000
TRA-1-60抗体（克隆A）Thermo Fisher Scientific 41-1000
CD44大鼠抗人/小鼠单克隆抗体（克隆IM7），PE-Cy5标记Thermo Fisher ScientificA27094
CD44 Alexa Fluor 488标记试剂盒，用于活细胞成像Thermo Fisher ScientificA25528
CD44大鼠抗人/小鼠单克隆抗体（克隆IM7）Thermo Fisher ScientificRM-5700（已停产）
山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 488标记Thermo Fisher Scientific A-11029
山羊抗大鼠IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 594标记Thermo Fisher Scientific A-11007
碱性磷酸酶活细胞染色试剂Thermo Fisher ScientificA14353
TRA-1-60 Alexa Fluor 488标记试剂盒，用于活细胞成像Thermo Fisher ScientificA25618
CD24小鼠抗人单克隆抗体（克隆SN3），FITC标记Thermo Fisher ScientificMHCD2401
β-2微球蛋白抗体，FITC标记（B2M-01）Thermo Fisher ScientificA15737
EpCAM / CD326抗体，FITC标记（VU-1D9）Thermo Fisher ScientificA15755
CD73 / NT5E抗体（7G2）Thermo Fisher Scientific41-0200
VECTOR Red碱性磷酸酶（AP）底物试剂盒Vector LaboratoriesSK-5100
Zeiss Axio Observer.Z1显微镜 Carl Zeiss491912-0003-000
FlowJo数据分析软件FLOJO, LLCN/A
Attune声学聚焦流式细胞仪，蓝/红激光Thermo Fisher Scientific使用Attune NXT 
S3e细胞分选仪（488/561 nm）BIO-RAD1451006
Falcon 12 x 75 mm带细胞筛盖离心管Corning352235
Falcon 15 ml高透明度圆顶密封螺旋盖离心管Corning352097
Falcon T-75培养瓶Corning353136
Falcon T-175培养瓶Corning353112
Falcon 6孔板Corning353046
Heraeus Heracell CO2 滚动培养箱Thermo Fisher Scientific51013669
无粘性、无RNase的微量离心管，1.5 mlAM12450
HulaMixer样品混合器15920D

参考文献

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