本文优化了一种RNA下拉实验方案，用于检测RNA结合蛋白（RBPs）与非编码RNA以及编码RNA之间的相互作用。以雄激素受体（AR）的RNA片段为例，展示了如何从原代棕色脂肪细胞的裂解液中富集与其结合的RNA结合蛋白。
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方法文章
RNA结合蛋白的检测方法 体外 脂肪细胞培养中的RNA下拉实验
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
RNA结合蛋白（RBPs）在脂肪组织的发育和功能中正逐渐被视为一种重要的调控层次。RBPs通过影响靶标mRNA的稳定性和翻译效率，在转录后水平上对基因表达起关键调控作用。RNA pull-down技术已被广泛用于研究RNA-蛋白质相互作用，这对于阐明RBPs以及长链非编码RNA（lncRNAs）功能的分子机制至关重要。然而，脂肪细胞中富含脂质，为该实验的实施带来了技术上的挑战。本文提供了一种针对原代脂肪细胞培养体系优化的详细RNA pull-down实验方案。以雄激素受体（AR）3'非翻译区（3'UTR）中包含腺苷酸-尿苷酸富集元件的一段RNA片段为例，展示了如何从脂肪细胞裂解液中富集其RBP结合蛋白HuR。本方法可广泛应用于检测RBPs与非编码RNA之间，以及RBPs与编码RNA之间的相互作用。
引言
RNA结合蛋白（RBPs）是一类能够与细胞内的双链或单链RNA结合并参与形成RNA-蛋白质复合物的蛋白质。RBPs可结合多种RNA分子，包括mRNA和长链非编码RNA（lncRNA），并在转录后水平发挥调控作用。目前，RBPs和lncRNA正被逐步揭示为脂肪组织发育与功能中的新型调控因子1,2,3。为了理解RBPs和lncRNA介导的细胞通路调控机制，通常需要检测特定RNA分子与一个或多个RBPs之间的相互作用，有时还需鉴定某一RNA转录本所结合的全部蛋白质伙伴。然而，由于脂肪细胞中含有大量脂质，此类实验往往具有挑战性。本文所述的RNA下拉（pull-down）实验方案可用于从原代培养的脂肪细胞裂解液中富集特定RNA的蛋白质结合伙伴4,5。
本方案的原理总结如下。一种RNA诱饵 体外 从DNA模板转录而来，经生物素标记后与链霉亲和素包被的磁珠偶联4将RNA诱饵与细胞裂解液共同孵育，以形成RNA-蛋白质复合物，随后在磁力架上进行下拉。具体而言，下述RNA下拉实验方案采用来自AR 3'非翻译区（3'UTR）的RNA片段作为诱饵，用于富集HuR蛋白——一种广泛表达的RNA结合蛋白，可结合mRNA的3'UTR区域。6,7，来自原代培养的脂肪细胞裂解液。为检测该实验的结合特异性，设置无关RNA以及链霉亲和素磁珠阴性对照。本方案可与蛋白质印迹（western blotting）或质谱....
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方案
注意：本研究中的目标 RNA 是 AR 3'非翻译区的一个片段。
1. 生物素标记RNA的制备
- 通过PCR扩增T7-AR-oligo以获得RNA，随后 体外 使用商业试剂盒并按照制造商说明进行转录11.
注意：PCR 引物列于 表 4T7-AR-F 和 T7-AR-R - 作为非特异性结合对照，从 psiCHECK-2 质粒通过 PCR 扩增萤火虫荧光素酶（FL）DNA 的部分序列，随后 体外 转录
注意：PCR 引物列于 表4：hluc(+)-T7-探针-F 和 hluc(+)-探针-R。 表4PCR扩增所用的模板和引物序列。 - 对于一个50 µl的PCR反应，混合以下组分：50 ng DNA（寡核苷酸或质粒）、4 µl dNTPs（每种dNTP浓度为2.5 mM）、5 µl 10×反应缓冲液、1 µl DNA聚合酶（2.5 U/µl）、2 µl 10 µM正向引物、2 µl 10 µM反向引物，以及无核酸酶水。
- 使用以下程序在热循环仪中进行PCR扩增。第一步：95 °C预变性2分钟，1个循环；第二步：95 °C变性30秒、55 °C退火30秒、72 °C延伸30秒（AR）或60秒（FL），共35个循环；第三....
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结果
在本演示实验中，使用AR RNA片段作为诱饵来捕获其结合蛋白HuR。同时设置与HuR蛋白无关的全长RNA（FL RNA）诱饵以及未偶联的空白链霉亲和素磁珠等分试样作为阴性对照。RNA-蛋白质相互作用可能发生在细胞核或细胞质中，本沉淀实验方案可适用于全细胞裂解液或分馏后的（核或胞质）细胞裂解液。通过蛋白质印迹分析显示，15 µl未分馏细胞裂解液样品（见第4.8节）作为无磁珠输入对照呈阳性结果，表明利用单克隆抗体可在小鼠原代培养脂肪细胞裂解液中检测到HuR蛋白。AR RNA洗脱组分也呈阳性结果，表明在RNA沉淀实验中，使用AR RNA偶联磁珠可从脂肪细胞裂解液中检测到HuR蛋白。而FL RNA洗脱组分和空白磁珠样品均呈阴性结果，表明FL RNA片段与HuR蛋白之间以及空白磁珠与HuR蛋白之间的非特异性相互作用在本RNA沉淀方法中无法被检测到。这两个阴性对照的结果也表明，本研究所述的RNA沉淀实验方案成功检测到了AR RNA片段与HuR蛋白之间的特异性相互作用。
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讨论
长链非编码RNA（lncRNA）和RNA结合蛋白（RBP）在健康与疾病中具有重要作用，但这些分子的分子机制尚不明确。鉴定与lncRNA分子相互作用的蛋白质是阐明其调控机制的关键步骤。RNA下拉实验系统通过在溶液中捕获相互作用复合物来富集RBP，从而利用结合在链霉亲和素磁珠上的生物素化RNA探针从细胞裂解液中选择性地提取目标蛋白。其他一些方法如ChIRP、CHART和RAP也可实现相同目的，但相比RNA下拉技术，这些方法的建立更为复杂16,17,18。
RNA 沉淀法的主要优势在于其操作相对简单且易于实施。CHIRP 和 RAP 均包含交联步骤，可保留天然存在的 RNA-蛋白质复合物，并需要设计覆盖整个目标 RNA 的反向互补寡核苷酸探针组（RAP 中为 90 个核苷酸长度，ChIRP 中为 20 个核苷酸长度）16,17,18RNA 折叠是 RNA 拉下实验中的关键步骤。该方案的主要局限性在于目标 RNA 是体外合成的 体外 且可能无法正确折叠成天然结构，从而无法与其RNA结合蛋白（RBP）正常结合。错误折叠的非天然RN.......
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致谢
本工作由新加坡国家研究基金会资助（NRF-2011NRF-NRFF001-025）以及CBRG（NMRC/CBRG/0070/2014）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 本研究使用的主要材料。 | |||
| MEGAscript 试剂盒 | Ambion | ||
| Biotin-14-CTP | Invitrogen | ||
| NucAway 离心柱 | Ambion | ||
| Dynabeads M-280 链霉亲和素磁珠 | Invitrogen | ||
| HuR (3A2) 小鼠单克隆抗体 (sc-5261) | Santa Cruz Biotechnology | ||
| Goat anti-mouse IgG-HRP (sc-2005) | Santa Cruz Biotechnology | ||
| Hypure 分子生物学级水（无核酸酶） | HyClone | ||
| 磷酸盐缓冲液 (1×PBS) | HyClone | ||
| RNase 抑制剂 | Bioline | ||
| 蛋白酶抑制剂 | Sigma | ||
| Pfu Turbo DNA 聚合酶 | Agilent Technologies | ||
| TRIsure | Bioline | ||
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 本研究使用的主要设备。 | |||
| Sorvall Legend Micro 21R 离心机 | Thermo Scientific | ||
| Sorvall Legend X1R 离心机 | Thermo Scientific | ||
| Bio-Rad T100 梯度PCR仪 | Bio-Rad | ||
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| BOECO 多管旋转混合仪 Multi Bio RS-24 | BOECO, Germany | ||
| 蛋白质凝胶电泳及转膜装置 | Bio-Rad | ||
| DynaMag-2 磁力架 | Life Technologies |
参考文献
- Huot, M. É, et al. The Sam68 STAR RNA-binding protein regulates mTOR alternative splicing during adipogenesis. Mol Cell. 46 (2), 187-199 (2012).
- Sun, L., et al. Long noncoding RNAs regulate adipogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture
Posted by JoVE Editors on 8/20/2016. Citeable Link.
A correction to the author list was made to: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture.
The author list has been updated from:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
*These authors contributed equally
to:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Shaohai Xu3, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
3Division of Bioengineering, School of Chemical & Biomedical Engineering, Nanyang Technological University
*These authors contributed equally
