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方法文章

RNA结合蛋白的检测方法 体外 脂肪细胞培养中的RNA下拉实验

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DOI：

10.3791/54207

⸱

2016年7月22日

 ,  ,  , 
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School, 2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore, 3Division of Bioengineering, School of Chemical & Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

* These authors contributed equally

本文内容

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摘要

本文优化了一种RNA下拉实验方案，用于检测RNA结合蛋白（RBPs）与非编码RNA以及编码RNA之间的相互作用。以雄激素受体（AR）的RNA片段为例，展示了如何从原代棕色脂肪细胞的裂解液中富集与其结合的RNA结合蛋白。

摘要

RNA结合蛋白（RBPs）在脂肪组织的发育和功能中正逐渐被视为一种重要的调控层次。RBPs通过影响靶标mRNA的稳定性和翻译效率，在转录后水平上对基因表达起关键调控作用。RNA pull-down技术已被广泛用于研究RNA-蛋白质相互作用，这对于阐明RBPs以及长链非编码RNA（lncRNAs）功能的分子机制至关重要。然而，脂肪细胞中富含脂质，为该实验的实施带来了技术上的挑战。本文提供了一种针对原代脂肪细胞培养体系优化的详细RNA pull-down实验方案。以雄激素受体（AR）3'非翻译区（3'UTR）中包含腺苷酸-尿苷酸富集元件的一段RNA片段为例，展示了如何从脂肪细胞裂解液中富集其RBP结合蛋白HuR。本方法可广泛应用于检测RBPs与非编码RNA之间，以及RBPs与编码RNA之间的相互作用。

引言

RNA结合蛋白（RBPs）是一类能够与细胞内的双链或单链RNA结合并参与形成RNA-蛋白质复合物的蛋白质。RBPs可结合多种RNA分子，包括mRNA和长链非编码RNA（lncRNA），并在转录后水平发挥调控作用。目前，RBPs和lncRNA正被逐步揭示为脂肪组织发育与功能中的新型调控因子1,2,3。为了理解RBPs和lncRNA介导的细胞通路调控机制，通常需要检测特定RNA分子与一个或多个RBPs之间的相互作用，有时还需鉴定某一RNA转录本所结合的全部蛋白质伙伴。然而，由于脂肪细胞中含有大量脂质，此类实验往往具有挑战性。本文所述的RNA下拉（pull-down）实验方案可用于从原代培养的脂肪细胞裂解液中富集特定RNA的蛋白质结合伙伴4,5。

本方案的原理总结如下。一种RNA诱饵 体外 从DNA模板转录而来，经生物素标记后与链霉亲和素包被的磁珠偶联4将RNA诱饵与细胞裂解液共同孵育，以形成RNA-蛋白质复合物，随后在磁力架上进行下拉。具体而言，下述RNA下拉实验方案采用来自AR 3'非翻译区（3'UTR）的RNA片段作为诱饵，用于富集HuR蛋白——一种广泛表达的RNA结合蛋白，可结合mRNA的3'UTR区域。6,7，来自原代培养的脂肪细胞裂解液。为检测该实验的结合特异性，设置无关RNA以及链霉亲和素磁珠阴性对照。本方案可与蛋白质印迹（western blotting）或质谱分析（MS）联用，分别用于验证特定RNA结合蛋白（RBP）的捕获，或鉴定所捕获RBP的完整谱系8.

研究 RNA-蛋白质相互作用有多种技术可供选择。为了揭示特定 RNA 结合蛋白（RBP）所结合的 RNA，可采用 RIP（RNA 免疫沉淀）和 CLIP（紫外线交联与免疫沉淀）。相反，若要鉴定特定 RNA 的蛋白互作伙伴，则可应用 RNA pull-down、ChIRP（通过 RNA 纯化进行染色质分离）、CHART（RNA 靶标捕获杂交分析）和 RAP（RNA 反义纯化）。与后几种方法相比，RNA pull-down 技术的实验建立更为简便。该技术可用于在体外（in vitro）和体内（in vivo）捕获蛋白质。in vivo 的 RNA pull-down 方法在技术上比其 in vitro 版本更具挑战性，它通过在细胞内进行交联以保留 RNA-蛋白质相互作用，从细胞中捕获带有适配体标签的目标 RNA，进而检测与其结合的 RNA 结合蛋白（RBP）。RNA pull-down 可用于富集丰度较低的 RBP，并分离和鉴定在调控细胞功能中具有多种作用的 RNA-蛋白质复合物9,10。

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方案

注意：本研究中的目标 RNA 是 AR 3'非翻译区的一个片段。

1. 生物素标记RNA的制备

  1. 通过PCR扩增T7-AR-oligo以获得RNA，随后 体外 使用商业试剂盒并按照制造商说明进行转录11.
    注意：PCR 引物列于 表 4T7-AR-F 和 T7-AR-R
  2. 作为非特异性结合对照，从 psiCHECK-2 质粒通过 PCR 扩增萤火虫荧光素酶（FL）DNA 的部分序列，随后 体外 转录
    注意：PCR 引物列于 表4：hluc(+)-T7-探针-F 和 hluc(+)-探针-R。 表4PCR扩增所用的模板和引物序列。
  3. 对于一个50 µl的PCR反应，混合以下组分：50 ng DNA（寡核苷酸或质粒）、4 µl dNTPs（每种dNTP浓度为2.5 mM）、5 µl 10×反应缓冲液、1 µl DNA聚合酶（2.5 U/µl）、2 µl 10 µM正向引物、2 µl 10 µM反向引物，以及无核酸酶水。
    1. 使用以下程序在热循环仪中进行PCR扩增。第一步：95 °C预变性2分钟，1个循环；第二步：95 °C变性30秒、55 °C退火30秒、72 °C延伸30秒（AR）或60秒（FL），共35个循环；第三步：72 °C延伸10分钟，1个循环。
  4. 使用体外转录法合成生物素标记的RNA 体外 按照制造商说明使用转录试剂盒11在本实验中，使用PCR产物作为RNA合成的模板。对于20 µl反应体系 体外 转录反应中，混合200 ng PCR扩增的DNA、每种单个NTP各2 µl、1 µl 10 mM生物素标记的CTP、2 µl 10×反应缓冲液和2 µl T7 RNA聚合酶。37 °C孵育4小时。
  5. 随后 体外 转录后，在37 °C下用1 µl 2 U/µl DNase处理反应混合物15分钟，以降解模板DNA。最后，将生物素标记的RNA稀释至终体积60 µl，用于后续纯化。
  6. 使用纯化柱纯化生物素标记的RNA，以去除盐分和未掺入的核苷酸，具体操作遵循制造商说明书12测定RNA浓度，并于-80 °C保存，用于后续下拉实验。
  7. 为确保RNA-蛋白质相互作用中目标RNA具有正确的二级结构，将50 µl生物素标记的RNA（50 pM）于90 °C加热2分钟，冰上冷却2分钟，然后加入50 µl 2x RNA结构缓冲液（表3），并在室温下孵育30分钟，使RNA折叠13,14.

2. RNA 偶联磁珠的制备

注意：使用磁力架分离磁珠和上清液。

  1. 根据制造商说明，通过短暂涡旋使链霉亲和素包被的磁珠在原装小瓶中重悬。取150 µl重悬磁珠转移至1.5 ml离心管中。将离心管置于磁力架上1分钟。弃去上清液，保留磁珠沉淀。
    注意：在RNA pull-down实验中，从原装小瓶分装重悬磁珠时，若后续进行Western blot检测，使用50 µl磁珠；若后续进行质谱分析（MS），则使用200 µl磁珠。
  2. 用1 ml制造商推荐的1× W&B（结合与洗涤）缓冲液（表3）重悬磁珠沉淀，于旋转仪中室温旋转5分钟，洗涤磁珠一次。弃去上清液，保留磁珠沉淀。
  3. 为灭活磁珠上的RNase，使用400 µl缓冲液A重悬磁珠沉淀，重复洗涤两次。缓冲液A为含0.1 M NaOH和0.05 M NaCl的碱性溶液（表3）。每次在旋转仪中室温旋转2分钟。弃去上清液，保留磁珠沉淀。
  4. 为去除磁珠上的NaOH，使用400 µl缓冲液B（表3）重悬磁珠沉淀，重复洗涤两次，每次在旋转仪中室温旋转2分钟。弃去上清液，保留磁珠沉淀。
  5. 用300 µl 2× W&B缓冲液重悬磁珠沉淀，将磁珠均分为三份，分别转移至三个1.5 ml离心管中（每管100 µl磁珠）。向各含磁珠的离心管中分别加入100 µl无RNase水、100 µl生物素标记的FL RNA和100 µl生物素标记的AR 3'UTR RNA。
  6. 将各管磁珠混合物在旋转仪中室温孵育1小时。将离心管置于磁力架上1分钟，弃去全部上清液，保留磁珠沉淀。
  7. 用400 µl 1× W&B缓冲液重悬各管磁珠沉淀，重复洗涤两次，每次在旋转仪中室温旋转5分钟。
  8. 将离心管置于磁力架上1分钟，弃去全部上清液。用50 µl核分离缓冲液（表3）重悬各管磁珠沉淀。

3. 前脂肪细胞的分离与脂肪生成诱导

  1. 如先前出版物所述5从肩胛间棕色脂肪组织中分离前脂肪细胞（C57BL6野生型小鼠，3周龄）。
  2. 培养并 体外 诱导前脂肪细胞分化5细胞在开始分化后4-5天即可用于后续实验应用。

4. 原代脂肪细胞细胞裂解液的制备

注意：细胞裂解液制备的所有步骤均需在冰上进行，所有缓冲液需预先在冰上预冷。将玻璃匀浆器（Dounce 玻璃匀浆器）提前在冰上预冷。

  1. 在15 cm培养皿中培养并诱导前脂肪细胞分化5 （参见第3.2节）。每皿细胞可满足一次RNA下拉实验所需。在分化第4天或第5天，弃去细胞培养基，用1×PBS洗涤细胞一次。
  2. 收集细胞时，向细胞中加入10–15 ml 1×PBS，刮取细胞并收集至50 ml离心管中，于室温下以200 × g离心5分钟收集细胞沉淀。使用1 ml移液器弃去上清液。
  3. 用2 ml低渗缓冲液（表3）重悬细胞沉淀，冰上孵育15分钟。将细胞转移至15 ml玻璃Dounce匀浆器中，冰上机械剪切20次。
  4. 于4 °C下以3,300 × g离心15分钟收集细胞核沉淀。将细胞核沉淀置于冰上备用（参见第4.6节）。将上清液转移至1.5 ml离心管中，加入3 M KCl使终浓度达到150 mM，然后于4 °C下以20,000 × g离心15分钟。
  5. 离心后，使用1 ml移液器小心去除顶部的脂层，收集上清液作为细胞质裂解物。
  6. 用1 ml核分离缓冲液重悬细胞核沉淀（参见第4.4节）。用1 ml移液器将细胞核转移至15 ml玻璃Dounce匀浆器中，冰上机械剪切100次。于4 °C下以20,000 × g离心15分钟去除核碎片，收集上清液作为核裂解物。
  7. 可将核裂解物与细胞质裂解物混合，或分别用于后续的下拉实验。在本示范实验中，这两种裂解物按1:1体积比混合。
  8. 向此未分馏的细胞裂解物中加入RNase抑制剂，使其终浓度为0.5 U/µl。预留100 µl细胞裂解物作为输入对照用于Western blotting15。

5. RBP 的结合与洗脱

  1. 将细胞裂解液均分为三等份（每份1 ml细胞裂解液置于1.5 ml离心管中），分别与空白 beads、FL RNA 偶联 beads 和 AR 3'UTR RNA 偶联 beads（参见第2.8节）在4 °C下旋转孵育3小时。
  2. 将离心管置于磁力架上1分钟。使用1 ml移液器收集上清液，随后从上清液中提取RNA以确认RNA完整性。按照制造商说明书，使用酸性硫氰酸胍-苯酚溶液提取RNA。表2）。通过分析核糖体RNA的28S和18S亚基评估RNA完整性。将珠粒沉淀物置于冰上保存。
  3. 用含有40 U RNase抑制剂和0.25% IGEPAL的1 ml核分离缓冲液重悬磁珠沉淀，洗涤6次，每次重悬后将离心管在旋转仪上室温旋转2分钟。使用磁力架分离磁珠与上清液，弃去全部上清液。将磁珠沉淀置于冰上保存。
  4. 使用以下步骤从磁珠中洗脱RNA-蛋白质复合物用于蛋白质印迹分析。首先，将每份磁珠沉淀重悬于75 µl核分离缓冲液中；然后加入25 µl 4x蛋白质印迹上样缓冲液（含SDS），使总体积达到100 µl。最后，将磁珠在此100 µl溶液中于95 °C煮沸5分钟。
    注意：使用以下步骤从磁珠中洗脱RNA-蛋白质复合物用于质谱分析。步骤1：将每份磁珠沉淀重悬于100 µl洗脱缓冲液中表3）；步骤2：室温下旋转孵育珠子样品2-3小时；步骤3：离心并收集含蛋白质的上清液；步骤4：在提交质谱分析前将蛋白质溶液浓缩至20-30 µl。
  5. 在 4 °C 条件下，将每份 100 µl 珠子样品以 12,000 × g 离心 30 秒，收集上清液。取 15 µl 上清液用于蛋白质印迹分析（见第 6.1 和 6.2 节）。用稀释的 HuR 小鼠单克隆抗体（1:1,000 稀释）对所得膜进行杂交，孵育过夜。

6. 用于验证 RBP 的蛋白质印迹法

  1. 使用标准技术通过SDS-PAGE分离RNA结合蛋白。
  2. 使用标准技术进行蛋白质印迹实验，检测与目标RNA相关的RNA结合蛋白。
    注意：在此演示实验中，使用了HuR小鼠单克隆抗体用于HuR蛋白的免疫检测。
  3. 将所得膜置于含稀释后HuR抗体（1:1,000稀释度）的5% w/v脱脂奶粉、1×TBS溶液中孵育， 0.1% Tween-20，4℃ 在室温下轻柔振荡孵育过夜。用1×TBST缓冲液洗涤膜三次。将膜与二抗（山羊抗小鼠IgG-HRP）在室温下孵育1小时。洗涤膜。显影并记录信号。

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结果

在本演示实验中，使用AR RNA片段作为诱饵来捕获其结合蛋白HuR。同时设置与HuR蛋白无关的全长RNA（FL RNA）诱饵以及未偶联的空白链霉亲和素磁珠等分试样作为阴性对照。RNA-蛋白质相互作用可能发生在细胞核或细胞质中，本沉淀实验方案可适用于全细胞裂解液或分馏后的（核或胞质）细胞裂解液。通过蛋白质印迹分析显示，15 µl未分馏细胞裂解液样品（见第4.8节）作为无磁珠输入对照呈阳性结果，表明利用单克隆抗体可在小鼠原代培养脂肪细胞裂解液中检测到HuR蛋白。AR RNA洗脱组分也呈阳性结果，表明在RNA沉淀实验中，使用AR RNA偶联磁珠可从脂肪细胞裂解液中检测到HuR蛋白。而FL RNA洗脱组分和空白磁珠样品均呈阴性结果，表明FL RNA片段与HuR蛋白之间以及空白磁珠与HuR蛋白之间的非特异性相互作用在本RNA沉淀方法中无法被检测到。这两个阴性对照的结果也表明，本研究所述的RNA沉淀实验方案成功检测到了AR RNA片段与HuR蛋白之间的特异性相互作用。

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讨论

长链非编码RNA（lncRNA）和RNA结合蛋白（RBP）在健康与疾病中具有重要作用，但这些分子的分子机制尚不明确。鉴定与lncRNA分子相互作用的蛋白质是阐明其调控机制的关键步骤。RNA下拉实验系统通过在溶液中捕获相互作用复合物来富集RBP，从而利用结合在链霉亲和素磁珠上的生物素化RNA探针从细胞裂解液中选择性地提取目标蛋白。其他一些方法如ChIRP、CHART和RAP也可实现相同目的，但相比RNA下拉技术，这些方法的建立更为复杂16,17,18。

RNA 沉淀法的主要优势在于其操作相对简单且易于实施。CHIRP 和 RAP 均包含交联步骤，可保留天然存在的 RNA-蛋白质复合物，并需要设计覆盖整个目标 RNA 的反向互补寡核苷酸探针组（RAP 中为 90 个核苷酸长度，ChIRP 中为 20 个核苷酸长度）16,17,18RNA 折叠是 RNA 拉下实验中的关键步骤。该方案的主要局限性在于目标 RNA 是体外合成的 体外 且可能无法正确折叠成天然结构，从而无法与其RNA结合蛋白（RBP）正常结合。错误折叠的非天然RN...

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致谢

本工作由新加坡国家研究基金会资助（NRF-2011NRF-NRFF001-025）以及CBRG（NMRC/CBRG/0070/2014）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
本研究使用的主要材料。
MEGAscript 试剂盒 Ambion
Biotin-14-CTP Invitrogen
NucAway 离心柱 Ambion
Dynabeads M-280 链霉亲和素磁珠 Invitrogen
HuR (3A2) 小鼠单克隆抗体 (sc-5261) Santa Cruz Biotechnology
Goat anti-mouse IgG-HRP (sc-2005) Santa Cruz Biotechnology
Hypure 分子生物学级水（无核酸酶） HyClone
磷酸盐缓冲液 (1×PBS) HyClone
RNase 抑制剂 Bioline
蛋白酶抑制剂 Sigma
Pfu Turbo DNA 聚合酶 Agilent Technologies
TRIsure Bioline
名称公司货号备注
本研究使用的主要设备。
Sorvall Legend Micro 21R 离心机 Thermo Scientific
Sorvall Legend X1R 离心机 Thermo Scientific
Bio-Rad T100 梯度PCR仪 Bio-Rad
Nanodrop 2000 Thermo Scientific
BOECO 多管旋转混合仪 Multi Bio RS-24 BOECO, Germany
蛋白质凝胶电泳及转膜装置 Bio-Rad
DynaMag-2 磁力架 Life Technologies

参考文献

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重印与许可

勘误


Formal Correction: Erratum: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture
Posted by JoVE Editors on 8/20/2016. Citeable Link.

A correction to the author list was made to: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture.

The author list has been updated from:

Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Lei Sun1,2

1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School

2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore

*These authors contributed equally

to:

Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Shaohai Xu3, Lei Sun1,2

1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School

2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore

3Division of Bioengineering, School of Chemical & Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

*These authors contributed equally

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体外转录生物素化RNA链霉亲和素磁珠细胞裂解液制备蛋白质印迹HuR蛋白AR 3-非翻译区
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