方法文章

RNA结合蛋白的检测通过体外 RNA下拉

DOI：

10.3791/54207

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2016年7月22日

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1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School, 2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore, 3Division of Bioengineering, School of Chemical & Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

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摘要

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的RNA下拉协议这里优化用于检测RNA结合蛋白（限制性商业惯例）和非编码以及编码RNA之间的相互作用。从雄激素受体（AR）的RNA片段作为例子来演示如何从初级的棕色脂肪细胞的lystate检索其RBP。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA结合蛋白（限制性商业惯例）正在成为在脂肪的发育和功能的调节层。限制性商业惯例通过影响靶mRNA的稳定性和翻译效率发挥在转录后水平的基因表达的调控中起关键作用。 RNA的下拉技术已被广泛用于研究RNA-蛋白质相互作用，这是必要阐明该机制底层限制性商业惯例'以及长的非编码RNA"（lncRNAs）函数。然而，高血脂丰度在脂肪细胞构成在进行该实验中一个技术挑战。这里详细的RNA下拉协议是初级脂肪细胞培养进行了优化。从雄激素受体的（AR）3'非翻译区含作为一个例子来说明如何检索其RBP合作伙伴的HuR蛋白质，脂肪细胞从一个lystate富含腺苷酸尿苷酸-elementwas（3'UTR）的RNA片段。可以应用这里描述的方法来检测之间的相互作用限制性商业惯例和非编码RNA，以及间限制性商业惯例和编码RNA。

引言

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限制性商业惯例是结合在细胞中的双链或单链RNA和参与形成RNA-蛋白复合物的蛋白质。限制性商业惯例可以结合多种RNA分子，包括mRNA和长非编码RNA（lncRNAs），并在发挥转录后水平的影响力。限制性商业惯例和lncRNAs在脂肪发展逐渐成为新的监管机构和功能1,2,3。理解RBP-的机制和细胞途径lncRNA介导的调节，它通常需要检测特定RNA分子和一个或多个限制性商业惯例之间的相互作用，并且，有时，以识别RNA的蛋白伴侣的全谱成绩单。然而，该实验可以是具有挑战性由于脂质的脂肪细胞的高含量。这里所描述的RNA的下拉协议可被用于检索来自原代培养4,5的脂肪细胞裂解物的特定RNA的蛋白质的合作伙伴。

理这个原山口总结如下。的RNA诱饵是在体外从DNA模板转录，生物素标记和缀合到链霉抗包被的磁珠4。所述RNA诱饵与细胞裂解物孵育以允许RNA-蛋白质复合物，其随后被拉下来的磁性支架的形成。更具体地，该RNA下拉协议如下所述使用的RNA片段从AR 3'UTR作为诱饵检索的HuR蛋白质，普遍表达RBP势必的mRNA 6,7的3'UTR，从theadipocytelysate原代培养。为了测试该测定的结合特异性，非相关RNAas以及空白链霉珠被包括作为对照。此协议是与蛋白质印迹或质谱（MS）兼容，以确认一个特定RBP的捕获或识别捕获的限制性商业惯例，分别为

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方案

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注:在本研究的上下文中感兴趣的RNA为AR 3'UTR的片段。

1.生物素标记的RNA的制备

  1. 以获得的RNA，使用商业试剂盒和以下生产商的说明11通过PCR扩增T7-AR-低聚，随后通过体外转录。
    注:引物用于PCR列于表4:T7-AR-F和T7-AR-R。
  2. 对于非特异性结合控制，通过PCR扩增的萤火虫萤光素酶（FL）的DNA psiCHECK-2的质粒，随后通过体外转录的部分序列。
    注:引物用于PCR列于表4:hluc（+） - T7探针-F和hluc（+） -探针- R 表4模板和引物进行PCR扩增的序列。
  3. 对于50微升的PCR反应，混合50纳克DNA（寡核苷酸或质粒），4微升的dNTP（每个人的dNTP为2.5毫米），5微升10X反应缓冲液，1微升2.5 U /＆＃181;微升DNA聚合酶，2微升10μM的正向引物，2微升10μM反向引物，和无核酸酶水。
    1. 使用下列程序运行在热循环仪进行PCR扩增。第1步:95℃2分钟一个循环;第2步:35个循环的95℃30秒，55℃30秒和72℃30秒（AR）或60秒（佛罗里达州）; STEP3:10分钟，72℃的一个周期。
  4. 合成使用以下制....

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结果

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在这个演示实验中，AR RNA片段作为诱饵捕捉到它的结合蛋白的HuR。两者FL的RNA诱饵即非相关的HuR蛋白，以及未缀合的链霉空白珠的等分试样用作阴性对照。 RNA-蛋白的相互作用，可能会发生无论是在细胞核或细胞质中，并且此下拉协议可以应用到无论是总或分级（核或细胞质）细胞裂解物。通过Western印迹的蛋白质的分析表明，15微升未分级细胞裂解物的样品（见4.8节），如无珠输入控制，给予了肯定的结果，这表明的HuR蛋白是通过使用在小鼠原代培养的脂肪细胞的溶胞产物检测的单克隆抗体。在AR的RNA洗脱级分，得到一个肯定的结果，这表明的HuR蛋白是通过使用对AR的RNA共轭珠RNA的下拉测定法中的脂肪细胞裂解物进行检测。既在FL的RNA洗脱级分和将b平直珠样品是阴性的，这表明FL的RNA片段和的HuR蛋白质之间的非特异性相互作用，以及空白珠的HuR蛋白质之间不通过该RNA下拉方法检测的。这两个阴性对照的结果还表明，在AR的RNA片段和的HuR蛋白之间的特异性相互作用被成功通过此处所描述的RNA的下拉协议检测到。

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讨论

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lncRNAs和限制性商业惯例在健康和疾病的重要角色，但这些分子的分子机制知之甚少。与lncRNA分子相互作用的蛋白的鉴定是朝着阐明的调节机制的关键步骤。通过将RNA下拉测定系统限制性商业惯例的富集是基于在溶液中相互作用的复杂，使得从细胞裂解物蛋白可使用结合于链霉抗磁珠的生物素化的RNA诱饵被选择性地提取的捕获。其他一些方法，如啁啾，图表，RAP可以达到同样的目的，但这些方法需要更多的努力，以建立比RNA下拉技术16,17,18。

RNA的下拉的主要优点是，它是相对简单的协议，并容易进行。既啁啾和RAP涉及交联步骤可以保留天然存在的RNA-蛋白质复合物和全套反义寡核苷酸的设计（90 nucleotides长RAP和长鸣声20个核苷酸）平铺整个目标RNA 16,17,18。 RNA折叠是在RNA的下拉测定法的一个关键步骤。该协议的主要限制是，在靶RNA 在体外合成，并且可能不能正确折叠成天然结构，以允许适当的与其RBP（多个）结合。错误折叠非天然RNA可以既不能形成RNA-蛋白的相互作用和失效功能测定法，或仅发生

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披露

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没有利益冲突的声明。

致谢

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这项工作是由新加坡NRF奖学金（NRF-2011NRF-NRFF001-025）以及CBRG（NMRC / CBRG / 0070/2014）的资助。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
本研究中使用的主要材料。
MEGAscript 套件 Ambion
生物素-14-CTP Invitrogen
NucAway 离心柱 Ambion
Dynabeads M-280 链霉亲和素 Invitrogen
HuR （3A2） 小鼠单克隆抗体 （sc-5261） Santa Cruz Biotechnology
山羊抗小鼠 IgG-HRP（sc-2005） Santa Cruz Biotechnology
Hypure分子生物学级水（无核酸酶） HyClone
磷酸盐缓冲盐水（1 次;PBS） HyClone
RNase 抑制剂 Bioline
蛋白酶抑制剂 
Pfu Turbo DNA 聚合酶 安捷伦科技
TRIsure 生物线
名称公司目录号注释
本研究使用的主要设备。
Sorvall Legend Micro 21R 离心机 Thermo Scientific
Sorvall Legend X1R 离心机 Thermo Scientific
Bio-Rad T100 热循环仪 Bio-Rad
Nanodrop 2000 Thermo Scientific
BOECO 旋转器 Multi Bio RS-24 德国
蛋白凝胶电泳和印迹仪 Bio-Rad
DynaMag-2 磁力架 Life Technologies
SigmaBOECO 公司

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huot, M. É, et al. The Sam68 STAR RNA-binding protein regulates mTOR alternative splicing during adipogenesis. Mol Cell. 46 (2), 187-199 (2012).
  2. Sun, L., et al. Long noncoding RNAs regulate adipogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110

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重印与许可

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勘误

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture
Posted by JoVE Editors on 8/20/2016. Citeable Link.

A correction to the author list was made to: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture.

The author list has been updated from:

Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Lei Sun1,2

1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School

2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore

*These authors contributed equally

to:

Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Shaohai Xu3, Lei Sun1,2

1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School

2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore

3Division of Bioengineering, School of Chemical & Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

*These authors contributed equally

标签

RNA HuR AR 3

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