脂质体在肿瘤内部的异质性蓄积与异常的肿瘤微环境相关。本文介绍了通过灌注成像和基于影像引导的机器人系统测量肿瘤微循环及升高的间质液压力（IFP）的方法。这些测量结果与利用容积微计算机断层扫描（micro-CT）成像确定的脂质体在肿瘤内部的蓄积情况进行比较。
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本文内容
摘要
摘要
肿瘤内脂质体分布不均是决定其疗效的关键因素。肿瘤微循环紊乱和间质液压（IFP）升高均与基于纳米技术的药物递送系统（如脂质体）在肿瘤内的分布不均密切相关。本研究通过探究肿瘤微循环、升高的IFP与纳米颗粒蓄积之间的关系 体内 实验通过动态对比增强计算机断层扫描（DCE-CT）评估肿瘤微循环，并利用一种新型图像引导的机器人穿刺针定位系统连接微CT扫描仪来测量肿瘤间质液压力（IFP）。通过基于CT图像评估一种稳定包封造影剂碘海醇的纳米脂质体制剂（CT-脂质体），确定脂质体在肿瘤内的积聚情况。CT成像实现了在单个乳腺癌皮下异种移植小鼠模型中，肿瘤血流动力学、IFP及CT-脂质体积聚空间分布的共定位分析。测量结果揭示灌注和血浆容积分数是脂质体在肿瘤内分布的重要调控因素。此外，结果提示IFP通过调节血流在脂质体分布中起间接调控作用。
引言
测量纳米颗粒药物递送系统在肿瘤内部的蓄积情况，可能为判断肿瘤内是否已达到足够的细胞毒性药物浓度提供一种重要工具。该领域的研究发展推动了 "可成像的" 脂质体系统可实现无创且定量的 体内 使用正电子发射断层扫描（PET）等成像方式检测药物递送载体1光学荧光2和计算机断层扫描（CT）3,4 和磁共振成像（MRI）5成像技术已被用于确定脂质体递送系统的药代动力学和生物分布，并揭示纳米颗粒在个体间及肿瘤内蓄积的异质性程度。6,7然而，仅对纳米颗粒进行成像并不能识别导致其在肿瘤内蓄积和分布不佳的生物学屏障。这一知识对于合理设计更有效的制剂以及改善瘤内蓄积的策略至关重要。8已证明，可以通过应用治疗策略来调节特定的生物屏障，从而改善纳米颗粒的转运。9此外，已开发出纳米颗粒制剂，以专门克服特定的生物转运屏障。10在这两种情况下，生物屏障的测量可用于指导选择合适的纳米颗粒药物递送策略。
肿瘤微循环和升高的IFP被认为是决定纳米颗粒（如脂质体）在实体瘤内蓄积的两个关键因素9,11。然而，其他影响脂质体蓄积不良的因素还包括致密的细胞外基质、不通透的脉管系统以及固体组织压力12。这些屏障在时空上相互关联，其中异常的血流和升高的间质液压力是驱动纳米颗粒....
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方案
所有体内实验均在经大学健康网络机构动物护理与使用委员会批准的方案下进行。
1. 动物模型
- 培养5至7天 x 106 DMEM 培养基中加入 10% 胎牛血清（FBS）和 100 倍稀释的青霉素-链霉素，培养 MDA-MB-231 乳腺腺癌肿瘤细胞。
- 当细胞融合度达到80%时，使用0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液消化收集细胞。消化3–5分钟后，加入3倍体积的DMEM中和胰蛋白酶-EDTA。取15 µl细胞悬液，用血细胞计数板进行细胞计数。将细胞在200 × g离心5分钟形成细胞沉淀，然后重悬于HBS中，调整细胞浓度为10 × 10⁶ cells/ml。6 每毫升细胞数
- 通过皮下注射1至2个肿瘤组织，植入皮下（SC）肿瘤 x 106 每只8至12周龄雌性SCID小鼠（n = 5）的后肢注射细胞。使用标准的25 G针头进行注射。
- 使用游标卡尺监测肿瘤生长（体积 = 0.5 x 长度 x 宽度2）并在皮下肿瘤体积达到预定大小后开始测量 >200 mm3 （大约7到9天）。
2. CT脂质体的制备与表征
- 脂....
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结果
上述方案应获得包载碘海醇浓度、平均脂质体直径和ζ电位分别为55 mg ml-1分别为 91.8 ± 0.3 nm 和 -45.5 ± 2.5 mV。 图1a 包含具有代表性的DCE-CT成像结果，生成显示肿瘤内碘海醇蓄积随时间变化的容积数据时间序列。在肿瘤内选择感兴趣区域（ROI）可获得时间-密度曲线（TIC），该曲线可通过示踪剂动力学建模方法进行量化，以估算血流量、血管通透性、血浆容积分数和间质容积分数。图1b）。在本研究中，采用了一个双室示踪剂动力学模型，并利用Matlab中实现的非线性曲线拟合程序对测得的时间-强度曲线（TIC）进行拟合14将肿瘤体积分割为多个大小相等的兴趣区域，可实现对肿瘤体积内血流动力学参数空间分布的定量分析。图1c分割可手动进行，但耗时且困难，也可采用此处使用的算法自动完成，该算法利用球面坐标系将肿瘤划分为多个等尺寸的感兴趣区域（ROI）。动态对比增强CT（DCE-CT）方法可定量评估灌注、血管通透性.......
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讨论
本文介绍的基于成像的测量方法可用于确定肿瘤微循环特性、组织间液压力（IFP）以及CT脂质体积累的空间分布。以往尝试关联这些特性的研究依赖于对多只荷瘤动物进行整体测量，因此难以灵敏地揭示纳米级药物递送系统在肿瘤内积累异质性现象背后的机制15。动态对比增强CT（DCE-CT）提供了一种测量肿瘤内微循环特性差异的工具，容积CT可准确描绘CT脂质体沉积的动力学过程，而CT-IFP机器人系统则可在同一只动物体内实现IFP的空间定位图谱绘制。此外，DCE-CT成像是一种已在临床环境中获批用于评估肿瘤血流动力学的方法，这使得本研究的结果具有潜在的临床转化价值。
鉴于测量的复杂性，为确保获得可靠的数据集，有几个关键因素需要注意。基于DCE-CT的肿瘤微循环定量分析在准确评估肿瘤血流动力学方面可能是最具挑战性的。该方法需要获取具有高信噪比（SNR）的时间-密度曲线（TICs），并采用稳健的拟合算法对TICs进行定量分析16,17。通过目视检查TICs，可将低信噪比的数据从分析中剔除。此外，若操作不当，即使对高信噪比的TICs进行拟合，也可能导致肿瘤灌注、血.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露
致谢
作者谨此感谢 Javed Mahmood 博士在培养 MDA-MB-231 细胞及移植 MDA-MB-231 异种移植瘤方面提供的帮助，感谢 Linyu Fan 在制备 CT 脂质体方面的贡献。Shawn Stapleton 感谢加拿大自然科学与工程研究委员会研究生奖学金项目以及加拿大卫生研究院（CIHR）21 世纪放射治疗研究卓越战略计划（EIRR21）提供的经费支持。本研究得到了加拿大特里·福克斯基金会新前沿计划（020005）和加拿大卫生研究院（102569）资助项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| MDA-MB-231 转移性乳腺腺癌肿瘤细胞 | ATCC | HTB-26 | |
| 杜氏改良伊格尔培养基（DMEM） | Life Technologies | 11965-092 | |
| 胎牛血清（FBS） | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| HyClone 青霉素-链霉素 100 倍溶液 | GE Healthcare Life Sciences | SV30010 | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红 | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | |
| 1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DPPC） | Avanti Lipids Inc., USA | 850355P | |
| 胆固醇（CH） | Avanti Lipids Inc., USA | 700000P | |
| 1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-聚（乙二醇）2000（DSPE-PEG2000） | Avanti Lipids Inc., USA | 880128P | |
| Omnipaque（碘海醇）300 mg 碘/ml | GE Healthcare, CA | ||
| 80 nm 孔径 Track-Etch 聚碳酸酯膜 | Whatman Inc., USA | ||
| 200 nm 孔径 Track-Etch 聚碳酸酯膜 | Whatman Inc., USA | ||
| 10 m Lipex 挤出器 | Nothern Lipids Inc, CA | ||
| 截留分子量（MWCO）为 8 kDa 的透析袋 | Spectrum Labs, USA | ||
| 标称分子量截留值（NMWC）为 750,000 的切向流层析柱 | MidGee 超滤柱，GE Healthcare, CA | ||
| 蠕动泵 | Watson Marlow Inc., USA | ||
| 紫外分光光度计 | Helios γ, Spectronic Unicam, USA | ||
| 90Plus 粒径分析仪 | Brookhaven, Holtsville, USA | ||
| eXplore Locus Ultra 微型 CT 系统 | GE Healthcare, CA | 通过 CT-Console 软件操控 | |
| AxRecon 基于 GPU 的重建软件 | Acceleware Corp. CA | ||
| 27 G 带翼输液导管 SURFLO | Terumo Medical Products, USA | SV*27EL | |
| PE20 聚乙烯导管 | Becton Dickinson, USA | 427406 | |
| 笔尖式 25 G × 3.5′′ Whitacre 脊髓穿刺针 | Becton Dickinson, USA | 405140 | IFP 针 |
| P23XL 压力传感器 | Harvard Apparatus, CA | P23XL | |
| PowerLab 4/35，桥式放大器，配备 LabChart Pro 7.0 | ADInstruments Pty Ltd., USA | PL3504, FE221 | IFP 采集系统及采集软件 |
| CT-Sabre 小动物介入系统（CT-IFP 机器人） | Parallax Innovations, CA | 通过 CT-IFP 机器人控制软件操控 | |
| CT-IFP 机器人校准软件 | 定制 Matlab 软件 | ||
| DCE-CT 分析软件 | 定制 Matlab 软件 | ||
| Matlab 2013b | Mathworks, USA |
参考文献
- Seo, J. W., Zhang, H., Kukis, D. L., Meares, C. F., Ferrara, K. W. A novel method to label preformed liposomes with 64Cu for positron emission tomography (PET) imaging. Bioconjugate chemistry. 19 (12), 2577-2584 (2008).
- Huang, H., Dunne, M., Lo, J., Jaffray, D., Allen, C.
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