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方法文章

基于显微镜的高通量筛选参与宿主因素的检测方法 布鲁氏菌 Hela细胞感染

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DOI：

10.3791/54263

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2016年8月5日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel, 2Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy, Université de la Méditérannée UM2, INSERM U1104 CNRS UM7280, 3Departmento de Microbiologìa and Instituto de Salud Tropical, Universidad de Navarra, 4BioDataAnalysis GmbH

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了两种基于显微镜的高通量筛选方法，用于研究参与Brucella感染的宿主因子。Brucella入侵检测法用于鉴定宿主细胞中支持其入侵的关键因子，而终点检测法则用于鉴定支持其胞内复制的宿主因子。尽管这些方法可适用于其他实验体系，本文以HeLa细胞中的siRNA筛选为例，详细说明实验方案的操作流程。

摘要

Brucella 属细菌是兼性胞内病原体，可感染动物这一自然宿主。人类感染通常由直接接触受感染动物或摄入被污染的食物引起，可导致严重的慢性感染。

布鲁氏菌 可侵入专业和非专业的吞噬细胞，并在内质网（ER）来源的液泡内复制。宿主细胞中支持该过程所必需的因子包括 布鲁氏菌 进入宿主细胞、逃避溶酶体降解以及在类似内质网的区室中复制的机制在很大程度上仍不清楚。本文描述了两种用于鉴定参与这些过程的宿主因子的检测方法 布鲁氏菌 在HeLa细胞中的侵入与复制。本实验方案描述了RNA干扰技术的应用，但也可采用其他筛选方法。该检测基于使用自动化宽场显微镜，对荧光标记的细菌在荧光标记的宿主细胞中的定位进行检测。荧光图像通过CellProfiler中标准化的图像分析流程进行分析，可实现基于单细胞的感染评分。

在终点检测实验中，于感染后两天测定细胞内复制情况。这使得细菌有足够时间转运至其复制生态位，并在细菌进入宿主细胞约12小时后启动增殖。因此，成功建立细胞内生态位的布鲁氏菌（Brucella）将在宿主细胞内大量增殖。由于细胞内复制的细菌数量远超过单个细胞外或非复制性的细胞内细菌，因此可使用持续表达GFP的菌株，通过强烈的GFP信号来识别被感染的细胞。

相比之下，在侵入实验中，区分细胞内和细胞外细菌至关重要。此处使用一种编码四环素诱导型GFP的菌株。通过添加庆大霉素灭活细胞外细菌的同时诱导GFP表达，可根据GFP信号区分细胞内与细胞外细菌，仅细胞内细菌能够表达GFP。这使得在细胞内增殖启动之前，即可稳定地检测单个细胞内细菌。

引言

Brucella 属细菌是革兰氏阴性、兼性胞内寄生的病原菌，属于α-变形菌纲。它们在其自然宿主（如牛、山羊或绵羊）中可引起流产和不育，导致疫区严重的经济损失。布鲁氏菌病是全球最重要的人畜共患病之一，每年导致超过50万例新发人类感染1。人类感染通常通过与受感染动物直接接触或摄入受污染的食物（如未经巴氏消毒的牛奶）而传播。该发热性疾病的症状缺乏特异性，给布鲁氏菌病的诊断带来困难。若未及时治疗，患者可能发展为慢性感染，并出现更严重的症状，如关节炎、心内膜炎和神经病变2。

在细胞水平上 布鲁氏菌 能够侵入吞噬细胞和非吞噬细胞，并在一种称为细胞内区室的结构中进行复制 布鲁氏菌含细菌空泡（BCV）。细菌的内化需要Rac、Rho介导的肌动蛋白细胞骨架重排以及Cdc42的直接激活3在真核宿主细胞内，细菌容纳泡（BCV）沿内吞途径运输，尽管与溶酶体相互作用，细菌仍能避免被降解4液泡ATP酶对BCV的酸化作用是诱导细菌IV型分泌系统（T4SS）表达所必需的5. 研究认为，由 IV 型分泌系统（T4SS）分泌的细菌效应蛋白对于 布鲁氏菌 以建立其复制生态位，因为T4SS的缺失6 或抑制囊泡ATP酶会导致细胞内生态位建立的缺陷7细菌在转运阶段不会进行复制，直到它们 到达内质网来源的液泡区室8一旦发生细胞内增殖，BCV便会与内质网标志物（如calnexin和glucose-6-phosphatase）紧密共定位。6.

分子机制 布鲁氏菌 进入细胞、逃避溶酶体降解并最终在类似内质网的区室中复制的具体机制仍 largely 未知。参与感染不同阶段的宿主因子主要通过靶向性方法或小规模的小干扰RNA（siRNA）筛选实验得以鉴定 黑腹果蝇 细胞9这些研究揭示了各个宿主因素在过程中的作用 布鲁氏菌 感染，但我们对整个过程仍缺乏全面的理解。

本文介绍了利用大规模RNA干扰（RNAi）筛选结合自动化的宽场荧光显微镜和自动化图像分析技术来鉴定人类宿主因子的实验方案。HeLa细胞的反向siRNA转染操作按照先前所述方法10,11进行，仅作轻微修改。该终点检测涵盖了布鲁氏菌（Brucella）胞内生命周期的大部分阶段，但不包括细菌的逸出及对邻近细胞的感染。为了进一步表征在终点检测中鉴定出的候选因子，采用了一种改进的实验方案，用于鉴定参与感染早期阶段的相关因子。

Brucella abortus 菌株可组成型表达 GFP，可用于终点检测，其中允许细菌感染细胞两天。在此期间，细菌进入细胞，迁移至内质网来源的复制生态位，并在核周区域进行复制。高水平的 GFP 信号可用于可靠地检测含有复制细菌的单个细胞。

为了在高通量实验中研究Brucella的侵入过程，必须能够区分细胞内和细胞外的细菌。本文所介绍的方法避免了对细胞内和细胞外细菌进行差异性抗体染色。该方法基于一种表达四环素诱导型GFP并同时组成型表达dsRed的Brucella菌株。组成型dsRed标记物的存在可识别样本中所有存在的细菌。通过在加入无毒性的四环素类似物脱水四环素（aTc）的同时使用庆大霉素（Gm）灭活细胞外细菌，从而诱导GFP表达。细胞膜不通透的抗生素Gm可杀死细胞外细菌，而aTc能够进入宿主细胞，选择性地诱导细胞内细菌表达GFP。利用宽场显微镜，该双报告系统可有效区分单个细胞内细菌（GFP与dsRed信号）和细胞外细菌（仅dsRed信号）。为使细胞内Brucella的GFP表达达到可检测水平，我们发现aTc诱导4小时即可获得可靠的信号。类似的选择性诱导GFP表达策略此前已被用于研究细胞内Shigella12。

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方案

注意：所有涉及活的Brucella abortus菌株的操作必须在符合所有相关法规和安全防护要求的生物安全三级（BSL3）实验室中进行。

1. 筛选平板的制备及细菌与细胞的培养

  1. 制备 布鲁氏菌 abortus 起始培养物
    1. 划线 Brucella abortus 2308 (B. abortus) 来自 -80 °C 含有胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）平板上的牛奶储备液 50 µg/ml 卡那霉素（TSA/Km）。将平板在3-4天内孵育 37 °C使用菌株 Brucella abortus 2308 pJC43 (apHT::GFP)13 用于终点测定和菌株 Brucella abortus pAC042.08 (apht::dsRed, tetO::tetR-GFP用于进入实验。
      注意：光滑型脂多糖（LPS）的 Brucella abortus 是一种重要的毒力决定因子，但粗糙型突变体可能以相对较高的频率出现14因此，我们建议在开始本实验前先检测培养菌株的状态。
    2. 在四个 TSA/Km 平板上重新划线接种细菌，覆盖整个平板，于 37°C 培养 2–3 天 37 °C.
    3. 使用一次性塑料接种环，将细菌从TSA/Km平板转移至10 ml 10%经高压灭菌的脱脂牛奶中并充分重悬。确保细菌充分重悬，以保证所有起始培养物中细菌浓度一致。
    4. 等分试样 250 µl 将细菌悬液分装至2 ml螺口管中，并于-80℃冷冻80 °C.
    5. 解冻一份起始培养物并转移 25 µl, 50 µl，以及 100 µl 将细菌起始培养物分别接种于含有50 ml胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）的250 ml螺口瓶中 50 µg/ml 卡那霉素（TSB/Km）。用Parafilm封口膜密封瓶口。
    6. 在摇床中以100 rpm转速振荡培养过夜 37 °C.
    7. 在600 nm处测定光密度（OD600) 以确定达到目标 OD 所需的种子培养物体积600 过夜培养后，OD值为0.8–1.1。
  2. HeLa细胞的制备
    1. 在添加了10%胎牛血清（FCS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）（DMEM/10% FCS）中培养HeLa细胞 37 °C 含5% CO₂的湿化培养箱2. 将细胞培养至80%汇合度。
  3. 用siRNA制备筛选板。
    1. 将siRNA用无RN酶水稀释至终浓度 0.32 µM转移 5 µl/well 384孔黑色透明平底板。
      1. 使用第1、2、23和24列作为标准对照。阴性对照使用非靶向siRNA（随机序列）以及不含siRNA的模拟转染孔（仅转染试剂）。转染对照使用可诱导细胞死亡的siRNA（KIF11），以及已知参与该过程的宿主因子的阳性对照。 布鲁氏菌 感染（例如，Arp2/3复合物的一个组分，参与肌动蛋白聚合）。将市售的siRNA文库或定制的siRNA转移至其余孔中。
      2. 用可剥离的铝箔密封板。将板在 -20 °C.
        注意：培养板可在 -20 °C 至少6个月，最长可达数年，具体取决于制造商的建议。

2. 反向siRNA转染

  1. 在室温下以 300 × g 离心 20 分钟，解冻一块黑色 384 孔板。
    注意：此步骤可使附着在盖子或孔壁上的所有液体沉降至孔底。
  2. 在室温下，将转染试剂用不含 FCS 的 DMEM 按 1:200 比例稀释，配制转染培养基。转染培养基应在使用前不超过 20 分钟内配制，并在使用前轻轻混匀。
  3. 使用试剂分配器向每孔加入 25 µl 转染培养基，并通过前后移动平板使溶液充分混匀。
  4. 在室温下孵育 1 小时，以促进 siRNA/转染试剂复合物的形成。
  5. 在此期间，准备 HeLa 细胞：用 2.5 ml 含 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 的 PBS（胰蛋白酶）洗涤一个 75 cm2 培养瓶中的亚融合细胞一次。
  6. 加入 1.5 ml 新鲜胰蛋白酶，将培养瓶转移至 37 °C 孵育 2–3 分钟，直至细胞变圆。
  7. 用 10 ml 预热的 DMEM/16% FCS 重悬细胞。
  8. 使用自动细胞计数仪计数细胞，并用 DMEM/16% FCS 配置成浓度为 10,000 个细胞/ml 的细胞悬液。
  9. 使用试剂分配器向每孔加入 50 µl 细胞悬液，使每孔含有 500 个细胞。
  10. 前后移动平板，使细胞均匀分布。将平板在室温下静置 5–10 分钟，使细胞充分沉降。
  11. 用 Parafilm 密封平板，并将其置于 37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中，在预热的铝板上孵育 72 小时。
    注意：预热的铝板可确保整个 384 孔板温度均匀分布。

3. 感染与固定

  1. 感染前一天，接种1.1.7中确定的数量的样本 B. abortus 在250 ml螺口瓶中，将起始菌种接种于50 ml TSB/Km培养基中。用Parafilm封口，在37°C下过夜培养细菌 37 °C 以及在摇床中以100 rpm振荡至OD600 = 0.8-1.1.
  2. 测量OD600 细菌培养物，并通过将细菌培养物用DMEM/10% FCS稀释，制备感染培养基，以达到预期的感染复数（MOI）。
    注意：为了在HeLa细胞中获得5-10%的感染率，使用MOI值为10,000。应针对每种细胞类型进行MOI滴定曲线实验，以获得最佳感染率。
  3. 更换384孔板的转染培养基 50 µl 使用自动洗板机清洗感染培养基。
  4. 将384孔板在400 x g条件下离心 4 °C 20 分钟。
    注意：这有助于同步感染过程。
  5. 用Parafilm密封培养板，并将其置于预热的铝板上孵育 37 °C 含5% CO₂的湿润培养箱2 4小时
  6. 用含10% FCS的DMEM洗涤细胞 100 µg/ml 使用自动洗板机灭活细胞外细菌 200 µl/well 溢出洗涤
    注意：在溢流冲洗过程中，自动洗板机同时分配和吸取培养基。
  7. 对于侵入实验，用含10%胎牛血清的DMEM再次洗涤细胞 100 µg/ml Gm 和 100 ng/ml aTc，使用自动酶标洗板机（使用 200 µl/well 溢出洗涤
  8. 用封口膜密封培养板，并将其放回预热的铝制培养板中 37 °C 含5% CO₂的湿润培养箱2 分别用于终点检测和进入检测，再孵育40小时或4小时。
  9. 固定时，使用自动洗板机以 PBS 清洗孔板（使用 200 µl/well 溢出洗涤
  10. 更换 PBS 50 µl 使用自动洗板机，以pH 7.4的0.2 M HEPES溶液配制的3.7%多聚甲醛（PFA）进行处理。
    注意：警告：PFA 通过吸入、皮肤接触或吞食具有毒性.
  11. 室温孵育20分钟。
  12. 更换固定液 50 µl 使用自动洗板机用 PBS 洗涤。注意：如果需要，样品现在可以移出 BSL3 实验室。
    注意：从生物安全等级3级（BSL3）设施中移出任何样本均须进行风险评估，并验证相关操作程序，且须遵守适用的生物安全法规。

4. 染色

  1. 用 50 µl PBS 洗涤细胞两次。
  2. 加入 50 µl 含 0.1% Triton-X-100 的 PBS，室温孵育 10 分钟以透化细胞。
  3. 用 PBS 洗涤细胞三次。加入 20 µl 含 1 µg/ml DAPI (4',6-二脒基-2-苯基吲哚) 的 PBS，室温避光孵育 30 分钟。
  4. 用 PBS 洗涤细胞三次，并用铝箔包裹以避光保护染色样本。

5. 成像

  1. 设置全自动宽场显微镜以进行图像采集。
    注意：以下描述的是使用 MetaXpress 软件的 Molecular Devices ImageXpress 显微镜的设置。也可使用具有适当硬件规格和成像软件的其他 2D 宽场显微镜设备（详见材料/设备表）。
    1. 选择10倍物镜，相机二乘一合并像素，增益为1。
    2. 选择与384孔板相对应的板型格式。
    3. 每孔采集9个位点。
    4. 使用 "启用基于激光的对焦" 和 "聚焦于培养板及孔底".
    5. 设置 "第一个孔" 作为寻找样本的初始孔 "所有位点" 用于位点自动对焦。
    6. 使用 DAPI 通道手动设置 Z 轴偏移以进行对焦。
    7. 手动选择 DAPI 的 Z 轴偏移量，用于所有其他通道。
    8. 手动调整所有通道的曝光时间，以确保具有宽动态范围且过曝程度较低。
      1. 使用自动曝光功能获取一个代表性位点的图像。以此曝光时间对整块板上的3-5个位点进行成像，并手动调整曝光时间，直至所有位点中最亮像素的亮度达到最大亮度的约80%。
    9. 使用DAPI和GFP通道对整块培养板进行成像，用于终点检测。对于进入检测，还需额外选择RFP通道。

6. 自动化图像分析

注意：本实验采用 CellProfiler 215 作为图像分析软件，用于分割细胞和细菌对象，并在已识别的对象内进行自动化测量。该软件将图像分析算法以独立模块的形式提供，这些模块可组合成一个流程（pipeline），对所有图像依次执行各模块，从而自动完成特定的图像分析任务。为遵循本方案，请安装 CellProfiler 2.1.1 或更高版本，然后加载所提供的流程文件，并根据以下说明调整各模块中的必要参数。所有流程中各个模块的详细说明见补充文件。

注意：每种检测使用两条独立的流程。第一条流程计算阴影模型，该模型由第二条流程在分析前用于校正图像。应用阴影校正以减少显微镜光路不均匀所造成的影响。第一条流程中阴影模型的计算过程较为耗时，但结果具有更高的准确性。

  1. 终点检测实验
    1. 计算阴影校正模型
      1. 进入“文件”菜单，选择“导入” → “从文件导入流程…”，然后选择提供的流程文件“BrucellaShadingCorrectionPart1-Ver007”。当提示是否转换旧版流程时，选择“不转换”。
      2. 进入“输出” → “查看输出设置”，选择包含图像的输入文件夹以及用于保存生成的阴影校正模型的输出文件夹。
      3. 在模块（1）“LoadImages”中，调整“这些图像共有的文本名称”以匹配实际图像文件名。
      4. 确保在运行完整分析前，所有模块均不显示其输出结果，方法是取消勾选各模块旁的所有眼睛图标。注意：此操作可显著降低流程处理过程中所需的计算资源。
      5. 点击“分析图像”以开始计算阴影校正模型。
    2. 运行图像分析
      1. 进入“文件”菜单，选择“导入” → “从文件导入流程…”，然后选择提供的流程文件“BrucellaEndpointWithShadingCorrectionPart2-Ver007”。当提示是否转换旧版流程时，选择“不转换”。
      2. 进入“输出” → “查看输出设置”，选择包含图像的输入文件夹以及用于保存生成表格文件的输出文件夹。
      3. 在模块（1）“LoadImages”中，调整“这些图像共有的文本名称”以匹配实际图像文件名。
      4. 在模块（2）“LoadSingleImage”中，通过指定两个阴影校正模型的存储路径和文件名，加载在6.1.1步骤中计算得到的阴影校正模型。
      5. 在模块（4）至（5）“ImageMath”中，根据显微镜相机的位深度调整参数“将第一幅图像乘以”的数值：对于8位和16位图像，设置为“1.0”；对于12位图像，设置为“16.0”。
      6. 在模块（9）“ImageMath”中，调整参数“将第二幅图像乘以”的数值（初始值设为0.25），以抑制DAPI染色中的Brucella信号，同时不抑制细胞核信号。
        1. 点击“启动测试模式”，然后点击模块对应图标，激活模块（9）的暂停符号和显示功能。
          注意：激活后，暂停符号将显示为黄色，眼睛图标将显示为睁开状态。
        2. 点击“运行”，执行分析至模块（9）并触发暂停。为测试该模块的参数值，请点击“单步”。
        3. 右键单击新打开的图像，将“图像对比度”设置为“对数归一化”。反复返回模块（9），调整“将第二幅图像乘以”的参数，并再次单步执行该模块，直至Brucella信号被完全抑制，同时结果图像中指示过度减除的黑色区域最小化。
      7. 在模块（10）“IdentifyPrimaryObjects”中，将参数“阈值下限”设置得足够高（初始值设为零），以实现细胞核的分割并忽略背景。
        1. 为确定模块（10）的合适参数值，按照步骤6.1.2.6.1和6.1.2.6.2所述方法，单步执行该模块并显示输入图像。
        2. 右键单击输入图像并显示其直方图。
          注意：直方图的峰值通常代表背景信号。
        3. 从背景强度开始逐步提高参数值，直至输出图像中细胞核实现良好分割。
          注意：将阈值设为高于背景强度对于空位点尤为重要。
      8. 在模块（15）“FilterObjects”中，调整参数“最小值”，保留细胞核内有明显可见Brucella的细胞，其余细胞均被过滤掉。此步骤中忽略位于细胞核外的Brucella。
        1. 为确定合适的参数值，按照步骤6.1.2.6.1和6.1.2.6.2所述方法，单步执行该模块并显示输出图像。从零开始（即所有细胞均被识别为感染），逐步增加参数值，直至仅保留细胞核周围有明显可见Brucella的细胞。
      9. 在模块（16）“FilterObjects”中，调整参数“最小值”，保留核周区域有明显可见Brucella的细胞，其余细胞均被过滤掉。采用与前一模块类似的方法进行调整。
      10. 在模块（17）“FilterObjects”中，调整参数“最小值”，保留Voronoi细胞体区域有明显可见Brucella的细胞，其余细胞均被过滤掉。采用与前一模块类似的方法进行调整。
        注意：Voronoi细胞体定义为以细胞核为中心向外径向扩展25像素的区域，且不与邻近Voronoi细胞体重叠。
      11. 退出测试模式，并通过取消勾选各模块旁的所有眼睛图标，确保在运行完整分析前无任何模块显示其输出。
        注意：此操作可显著降低流程处理过程中所需的计算资源。
      12. 点击“分析图像”以启动分析。
      13. 分析完成后，检查生成的PNG图像及CSV表格文件，确保整块板的分析结果可靠。
  2. 侵入检测实验
    1. 计算阴影校正模型
      1. 进入“文件”菜单，选择“导入” → “从文件导入流程…”，然后选择提供的流程文件“BrucellaShadingCorrectionPart1-Ver007”。当提示是否转换旧版流程时，选择“不转换”。
      2. 进入“输出” → “查看输出设置”，选择包含图像的输入文件夹以及用于保存生成的阴影校正模型的输出文件夹。
      3. 在模块（1）“LoadImages”中，调整“这些图像共有的文本名称”以匹配实际图像文件名。
      4. 确保在运行完整分析前，所有模块均不显示其输出结果，方法是取消勾选各模块旁的所有眼睛图标。
        注意：此操作可显著降低流程处理过程中所需的计算资源。
      5. 点击“分析图像”以开始计算阴影校正模型。
    2. 运行图像分析
      1. 进入“文件”菜单，选择“导入” → “从文件导入流程…”，然后选择提供的流程文件“BrucellaEntryWithShadingCorrectionPart2-Ver007”。当提示是否转换旧版流程时，选择“不转换”。
      2. 进入“输出” → “查看输出设置”，选择包含图像的输入文件夹以及用于保存生成表格文件的输出文件夹。
      3. 在模块（1）“LoadImages”中，调整“这些图像共有的文本名称”以匹配实际图像文件名。
      4. 在模块（2）“LoadSingleImage”中，通过指定两个阴影校正模型的存储路径和文件名，加载在6.2.1步骤中计算得到的阴影校正模型。
      5. 在模块（4）至（5）“ImageMath”中，根据显微镜相机的位深度调整参数“将第一幅图像乘以”的数值：对于8位和16位图像，设置为“1.0”；对于12位图像，设置为“16.0”。
      6. 在模块（6）“IdentifyPrimaryObjects”中，将参数“阈值下限”设置得足够高，以仅分割细胞核并忽略背景。
        1. 为确定模块（6）的合适参数值，按照步骤6.1.2.6.1和6.1.2.6.2所述方法，单步执行该模块并显示输入图像。
        2. 右键单击输入图像并显示其直方图。
          注意：直方图的峰值通常代表背景信号。
        3. 从背景强度开始逐步提高参数值，直至输出图像中细胞核实现良好分割。
          注意：将阈值设为高于背景强度对于空位点尤为重要。
      7. 在模块（8）“IdentifyPrimaryObjects”中，将参数“阈值下限”设置得足够高，以仅分割Brucella并忽略背景。
        1. 为确定模块（8）的合适参数值，按照步骤6.1.2.6.1和6.1.2.6.2所述方法，单步执行该模块并显示输入图像。
        2. 右键单击输入图像并显示其直方图。
          注意：直方图的峰值通常代表背景信号。
        3. 从背景强度开始逐步提高参数值，直至输出图像中Brucella实现良好分割。
          注意：将阈值设为高于背景强度对于空位点尤为重要。
      8. 在模块（11）“FilterObjects”中，调整参数“最小值”，以滤除背景和伪影，仅保留Brucella菌落。
        1. 为确定合适的参数值，按照步骤6.1.2.6.1和6.1.2.6.2所述方法，单步执行该模块并显示输出图像。从6.2.2.7中选定的值开始，逐步增加参数值，直至仅保留Brucella对象。
      9. 退出测试模式，并通过取消勾选各模块旁的所有眼睛图标，确保在运行完整分析前无任何模块显示其输出。
        注意：此操作可显著降低流程处理过程中所需的计算资源。
      10. 点击“分析图像”以启动分析。
      11. 分析完成后，检查生成的PNG图像及CSV表格文件，确保整块板的分析结果良好。

7. 感染评分

注意：对细胞活力有显著影响的siRNA需谨慎使用，因为这可能导致假阳性结果。细胞数量的变化会影响实际感染复数（MOI），而靶向必需基因可能对病原体感染产生多效性影响。尽管siRNA介导的不完全敲低可用于研究必需基因，但此类靶点必须通过其他方法进行验证。例如， 药物干扰）以验证其在感染过程中作为宿主因子的作用。

  1. 终点检测实验
    1. 打开步骤 6.1.2.12 中生成的 CSV 表格，通过将感染细胞数量（CellProfiler 读数：“Count_InfectedCells”）除以细胞总数（CellProfiler 读数：“CountNuclei”），计算每个孔的感染率。如果每个孔拍摄了多个视野，需先对每个孔的所有视野数据进行汇总，得到该孔的总感染细胞数和总细胞数。
    2. 若孔板中包含足够数量的非靶向 siRNA，可进行 Z 分数标准化，以校正孔板间的差异。若筛选的是完整文库，则可认为每块孔板上的非靶向 siRNA 数量充足。
      figure-protocol-1
  2. 入侵检测实验
    1. 打开步骤 6.2.2.10 中生成的 CSV 表格，通过将感染细胞数量（CellProfiler 读数：“Count_InfectedCells”）除以细胞总数（CellProfiler 读数：“CountNuclei”），计算每个孔的感染率。如果每个孔拍摄了多个视野，需先对每个孔的所有视野数据进行汇总，得到该孔的总感染细胞数和总细胞数。
    2. 为量化感染细胞内的细菌载量，估算每个感染细胞内被胞内细菌占据的平均面积。为此，将所有与细胞重叠的胞内细菌的累积面积（CellProfiler 读数：“AreaOccupied_AreaOccupied_TrueIntPathogenInCells”）除以该视野中的感染细胞数量。为排除伪影干扰，使用该读数在所有视野中的中位数作为该孔的最终读数。
      注意：若该检测作为后续实验，用于分析大量参与 Brucella 感染过程的基因，则不应采用 Z 分数标准化，而应以阴性对照孔（mock wells）作为参考进行标准化，以校正孔板间的差异。

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结果

图1A展示了在终点检测中用于自动识别感染细胞的图像分析示例。通过DAPI染色识别HeLa细胞的细胞核，计算出围绕细胞核、宽度为8个像素的核周区域，以及通过将细胞核扩展25个像素得到的Voronoi细胞体。由于细菌主要在核周区域增殖，因此该区域内的GFP荧光强度是区分感染与非感染细胞最可靠的指标。在某些情况下，细菌被发现可在核周区域外增殖，或与细胞核存在较大程度的重叠。因此，这两个额外的区域也被纳入感染细胞的识别考量。图像分割及GFP荧光强度的测量均使用图像分析软件CellProfiler 2完成。

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讨论

细菌病原体已进化出多种策略，以操纵真核宿主细胞为其自身利益服务。引起急性感染的病原体通常表现出快速增殖，这往往伴随着免疫系统的显著激活以及感染细胞活力的丧失。相比之下，引起慢性感染的Brucella及其他病原体则能够在宿主细胞内建立长期的相互作用。因此，这些细菌需要在不破坏细胞稳态的前提下，精细调控宿主细胞的功能以利于自身生存。一种在基因组水平上鉴定参与感染过程的宿主细胞因子的常用策略，是利用系统性基因敲低（例如通过siRNA）并结合感染的功能性检测读出结果。本文介绍了适用于基于荧光细菌检测的高内涵、高通量筛选的实验方案。

成功进行大规模筛选的一个重要方面是稳健的自动化图像分析和感染评分。本文所述方法依赖于通过DAPI染色检测细胞核，该方法通常非常可靠，并定义一个感兴趣区域用于测量病原体信号。终点检测利用在核周、细胞核以及Voronoi细胞体中增殖细菌的检测，从而能够可靠地识别被感染的细胞。此外，该方法允许为各个区室设定不同的阈值。虽然在细胞核和核周区域可以设置相对较低的阈值，但在Voronoi细胞体中应采用较高的阈值。这有助于避免检测到来自邻近细胞的GFP信号，...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作得到了瑞士系统生物学计划 SystemsX.ch 框架下研究与技术开发（RTD）项目 InfectX 和 TargetInfectX 的资助，项目编号分别为 51RT 0_126008 和 51RTP0_151029。我们感谢瑞士国家科学基金会（SNSF）提供的资助 310030B_149886。S.H.L 和 A.C. 的工作得到了巴塞尔生物中心“卓越奖学金”国际博士生项目的资助。感谢 Simone Muntwiler 提供的技术支持。我们感谢 Dirk Bumann 提供质粒 pNF106，以及 Jean Celli 提供质粒 pJC43 和 pJC44。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）BD236950
胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）Fluka22092
硫酸卡那霉素Sigma-Aldrich60615
脱脂牛奶
250 ml 螺口瓶康宁8396
DMEMSigma-AldrichD5796
胎牛血清（FCS）Gibco10270热灭活
胰蛋白酶-EDTA（0.5%）Gibco15400-05410倍浓度储存液，用PBS按1:10稀释
Scepte 2.0 细胞计数仪默克密理博PHCC20060可使用其他细胞计数设备
Greiner CELLSTAR 384孔板Sigma-AldrichM2062
可剥离铝箔Costar6570
试剂分配器： "Multidrop 384 试剂分配器"赛默飞世尔科技5840150可使用其他试剂分配器。
转染试剂： "Lipofectamine RNAiMAXInvitrogen13778-150
自动酶标洗板机 "ELx50-16型洗板机"BioTekELX5016该洗板机配备适用于384孔板的16通道歧管，可置于生物安全柜内使用，且带有覆盖板孔的盖子，可在洗涤过程中减少气溶胶的产生。也可使用具有类似功能的其他洗板机。
庆大霉素Sigma-AldrichG1397
盐酸无水四环素Sigma-Aldrich37919100 μg/ml 溶液溶于 100% 乙醇中，保存于 -20 °C 避光保存于铝箔中
PBSGibco20012
多聚甲醛Sigma-AldrichP6148溶于0.2 M HEPES缓冲液，pH 7.4。储存于-20 °C，在使用前一天新鲜解冻。注意：PFA 通过吸入、皮肤接触或吞咽具有毒性。
HEPESSigma-AldrichH3375
Triton X-100Sigma-AldrichT9284
DAPI罗氏10236276001
随机对照siRNADharmaconD-001810-10
Kif11 siRNADharmaconL-003317-00
ARPC3 siRNADharmaconL-005284-00
布鲁氏菌 2308
pJC43（apHT::GFP)Celli 等12
pAC042.08 (apht::dsRed, tetO::tetR-GFP)构建：pJC44 4 用EcoRI进行消化，随后使用Klenow酶生成平末端，再用SalI进行消化。使用引物prAC090和prAC092从pNF106中扩增出TetR-GFP。经SalI消化后，将TetR-GFP产物连接至已消化的pJC44载体中。
引物 prAC090Sigma-AldrichTTT TTG AAT TCT GGC AAT TCC GAC GTC TAA GAA ACC
引物 prAC092Sigma-AldrichTTT TTG TCG ACT TTG TCC TAC TCA GGA GAG CGT TC
HeLa CCL-2ATCCCCL-2
ImageXpress MicroMolecular Devices IXM 成像 MSCOPE配备精密电动Z轴载物台的自动化细胞成像显微镜。可根据需要选用以下指定的自动化显微成像系统的替代设备，以及硬件和软件的替代组件。
高速激光自动对焦Molecular Devices 1-2300-1037
CFI Super Fluor 10X 物镜尼康 MRF00100数值孔径 0.50，工作距离 1.20 mm，微分干涉差（DIC）棱镜：10倍，弹簧加载
Photometrics CoolSNAP HQ 单色 CCD 相机Molecular Devices 1-2300-10601,392 × 1,040 成像像素，6.45 × 6.45 µm 像素，12 位数字化
MetaXpress 软件Molecular Devices 9500-0100
LUI-Spectra-X-7LumencorSPECTRA X V-XXX-YZ光源引擎。使用的光源如下：紫色（DAPI）、青色（GFP）、绿色/黄色（RFP）
DAPI单波段激发器SemrockFF01-377/50-25
单波段DAPI发射器SemrockFF02-447/60-25
单波段二向色镜用于 DAPISemrockFF409-Di03-25x36
用于GFP的单波段激发器SemrockFF02-472/30-25
单波段GFP发射器SemrockFF01-520/35-25
用于GFP的单波段二向色镜SemrockFF495-Di03-25x36
RFP单波段激发器SemrockFF01-562/40-25
单一带通发射滤光片用于RFPSemrockFF01-624/40-25
用于RFP的单波段二向色镜SemrockFF593-Di03-25x36

参考文献

  1. Pappas, G., Papadimitriou, P., Akritidis, N., Christou, L., Tsianos, E. V. The new global map of human brucellosis. Lancet Infect Dis. 6, 91-99 (2006).
  2. Atluri, V. L., Xavier, M. N., de Jong, M. F., den Hartigh, A. B., Tsolis, R. E. Interactions of the human pathogenic Brucella species with their hosts. Annu Rev Microbiol. 65, 523-541 (2011).
  3. Guzman-Verri, C., et al. GTPases of the Rho subfamily are required for Brucella abortus internalization in nonprofessional phagocytes: direct activation of Cdc42. J Biol Chem. 276, 44435-44443 (2001).
  4. Starr, T., Ng, T. W., Wehrly, T. D., Knodler, L. A., Celli, J. Brucella intracellular replication requires trafficking through the late endosomal/lysosomal compartment. Traffic. 9, 678-694 (2008).
  5. Boschiroli, M. L., et al. The Brucella suis virB operon is induced intracellularly in macrophages. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1544-1549 (2002).
  6. Celli, J., et al. Brucella evades macrophage killing via VirB-dependent sustained interactions with the endoplasmic reticulum. J Exp Med. 198, 545-556 (2003).
  7. Porte, F., Liautard, J. P., Kohler, S. Early acidification of phagosomes containing Brucella suis is essential for intracellular survival in murine macrophages. Infect Immun. 67, 4041-4047 (1999).
  8. Anderson, T. D., Cheville, N. F. Ultrastructural morphometric analysis of Brucella abortus-infected trophoblasts in experimental placentitis. Bacterial replication occurs in rough endoplasmic reticulum. Am J Pathol. 124, 226-237 (1986).
  9. Qin, Q. M., et al. RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication. PLoS Pathog. 4, e1000110(2008).
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  12. Kentner, D., et al. Shigella reroutes host cell central metabolism to obtain high-flux nutrient supply for vigorous intracellular growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9929-9934 (2014).
  13. Celli, J., Salcedo, S. P., Gorvel, J. P. Brucella coopts the small GTPase Sar1 for intracellular replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1673-1678 (2005).
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