协议小鼠胚胎成纤维细胞直接转化为滋养层干细胞

摘要

在这里，我们提出了一种方案，通过过表达 Tfap2c、Gata3、Eomes 和 Ets2 十天，将小鼠胚胎成纤维细胞直接转化为功能齐全且稳定的滋养层干细胞。

摘要

滋养层干细胞（TSC的）出现在哺乳动物发育第一细胞命运决定的结果。它们可以在体外进行培养，保持能力自我更新和分化为滋养层谱系的所有子类型，等同于体内干细胞群从而引发胎盘的胎儿部。因此，的TSC提供了一个独特的模型来研究胎盘发育和胚胎与体外胚外细胞命运决定。从开始的囊胚阶段，包括DNA甲基化和组蛋白修饰明显的后生屏障分隔紧密谱系两者。在这里，我们描述了一个协议，通过瞬态过表达的滋养重点监管TFAP2C，GATA3，EOMES和ETS2在小鼠胚胎成纤维细胞完全克服这一障碍的血统。诱导滋养层干细胞是能自我更新和几乎相同的囊胚滋养衍生的干细胞我形态，标记基因的表达和甲基化模式的n项。功能的体外和体内测定确认这些细胞能够沿滋养层谱系产生多倍体滋养层巨细胞和当注入胚泡嵌合化胎盘区分。从体细胞组织滋养层干细胞的诱导打开了新的途径来研究这个胚外谱系遗传和表观遗传特性，并提供给产生滋养层干细胞系，而不破坏各自的胚胎的可能性。

引言

最近，比较小鼠胚胎干细胞的几种方法来滋养层干细胞转化的一项研究显示，在所有的分析系统，沿袭转换仍然是不完整的。代替诱导滋养层干细胞（iTSCs）所谓的滋养层干的已产生细胞样细胞保持原点¹的细胞命运的存储器中。在这里，我们跟着ITSC一代不同的方法。类似于来自小鼠胚胎成纤维细胞（MEF中^）2多能干细胞的直接感应，iTSCs已直接从分化的体细胞组织转化。首先，我们确定了MEF中过表达时诱导TSC命运12个候选的因素。稍后，因素TFAP2C，GATA3，EOMES和ETS2已经确定是必要的和足够的ITSC感应^3。同时，另一组独立地发现TFAP2C，GATA3和EOMES足以MEF中转换成iTSCs。然而，在研究中，对转基因表达所需要的时间相当长相比，我们的研究中，表明不同的转化动力学，当ETS2从转鸡尾酒⁴不存在。

含有诱导和囊胚衍生滋养层干细胞的培养常规胎牛血清（FBS）依赖于由生长灭活的MEF ^5,6-分泌的因子的存在。在ITSC感应过程中，由MEF中，缺乏转基因的充分结合，并且不接受转提供了这些因素。然而，一旦个人ITSC菌落亚培养，它们需要媒体，已预处理由生长灭活的MEF。从那里，iTSCs可以培养并根据标准协议，如胚泡衍生的TSC处理。值得注意的是，在对比田中等人的^5，我们经常培养的TSC和iTSCs无凝胶化的细胞培养皿。

方案

所有小鼠实验按照与当地机构动物护理委员会（Landesamt附耳NATUR，UMWELT UND Verbraucherschutz，北莱茵 - 威斯特法伦州[批准ID号批准同意保护动物和德国法律规定进行:AZ 84-02.04.2013 .A428]）。

1.媒体准备

1. 制备293T培养基:Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM），10％（V / V）FBS，L-谷氨酰胺（2毫摩尔），丙酮酸钠（1毫米），青霉素/链霉素（1×）。
2. 制备MEF培养基:DMEM，10％（V / V）FBS，L-谷氨酰胺（2毫摩尔），1×非必需氨基酸，青霉素/链霉素（1×）。
3. 制备的TS培养基（W / O型FGF4 /肝素）:罗斯韦尔园区纪念研究所培养基（RPMI）1640 20％（V / V）FBS的（干细胞培养级），青霉素/链霉素（1×），L-谷氨酰胺（2mM的），丙酮酸钠（1毫摩尔），2-巯基乙醇（0.1毫摩尔）。
4. 制备的TS培养基FGF4 /肝素（TS + F4H）:RPMI 1640，20％（V / V）FBS的（干细胞培养级），青霉素/链霉素（1×），L-谷氨酰胺（2毫摩尔），丙酮酸钠（1毫摩尔），2-巯基乙醇（0.1毫摩尔），25纳克/毫升FGF4，1微克/毫升肝素。
   注意:FGF4和肝素被直接添加到媒体即将使用前。
5. 制备的TS-CM与FGF4 /肝素（TS-CM + F4H）:70％MEF条件的TS培养基+ 30％新制备的TS培养基+ 25毫微克/毫升FGF4，1微克/毫升肝素。
   注意:FGF4和肝素被直接添加到媒体即将使用前。
6. 制备转染培养基:高级DMEM，2％（V / V）FBS的（干细胞培养级），L-谷氨酰胺（2mM的），青霉素/链霉素（1×）。
7. 制备病毒生产培养基:高级DMEM，5％（V / V）FBS的（干细胞培养级），L-谷氨酰胺（2mM的），青霉素/链霉素（1×）。

2.小​​鼠胚胎成纤维细胞的推导

1. ^{（B6.Cg-GT（ROSA）26Sor TM1 rtTA;}设置定时交配使用重量129S2SV女性和男性的纯合子R26 :: rtTA小鼠（品系名称* M2）宰/ J 7）。上通过颈椎脱位E13.5牺牲小鼠和隔离根据标准方案⁸初级小鼠胚胎成纤维细胞（MEF中）。此后，板细胞一个胚胎在MEF媒体150毫米的菜。
2. 一旦主要的MEF培养150 mm培养皿中达到汇合，洗涤细胞两次用10毫升的PBS，并添加4毫升0.05％胰蛋白酶/ EDTA溶液。于37℃在培养箱中4分钟 - 孵育3菜肴。
3. 孵育检查后，如果使用倒置显微镜（使用10X透镜）从培养皿分离的细胞。添加5毫升MEF培养基以停止胰蛋白酶消化，并收集细胞悬浮到50ml锥形管中。
4. 从几盘池细胞悬浮液，并收集到50ml锥形管中。离心细胞悬浮液，在200 xg离心3分钟，10℃。
5. 丢弃在含有10％（体积/体积）二甲基亚砜的FBS上清，重悬细胞沉淀。冻结等分进一步使用MEF中。
   注:另外，用野生典型Ë主要的MEF;然而，需要表达rtTA额外慢病毒载体也可以与其它慢病毒载体一起转导（例如，使用由Maherali 等人 ⁹所述的FUdeltaGW-rtTA质粒）。
6. MEF条件TS培养基的制备
   注:在转换实验，MEF条件（CM）TS媒体已经做好准备，这是需要单独ITSC线（在第6条所述）的亚文化。
   1. 板1×10 ⁷每150毫米的菜有丝分裂灭活的MEF在菜肴所需数量MEF培养基。通过失活γ射线的MEF用剂量9戈瑞。
      注:每150毫米的菜产量约为60毫升CM的。
   2. 后镀，吸白天和丢弃MEF培养基，并添加新鲜制备的TS培养基（无FGF4 /肝素）20毫升到有丝分裂失活的MEF和地点的菜肴的每个培养皿放回37℃的培养箱。
   3. 孵化后对有丝分裂灭活的MEF3天TS中，收集在50毫升锥形管网上平台。通过0.2微米的过滤器过滤介质和2.6.4进行。用20ml新鲜的TS培养基的制备另一批次的CM的替换CM。
      注意:有丝分裂失活的MEF可用于CM制备高达三倍。
   4. 等分试样35毫升过滤的CM到50ml锥形管中并储存在-20℃直到需要。解冻后，以获得70％的TS-CM和储存于4℃最多一个月增加15毫升新制备的TS培养基。

3.慢病毒载体生产的293T细胞

注意:所有步骤都是在授权给生物安全2级实验室空间进行。

1. 在此之前转换实验，准备多西环素（DOX）依赖过度表达TFAP2C，GATA3，EOMES，ETS2和mCherry的慢病毒载体。对于每一个慢病毒，共转染的293T细胞用各自的慢病毒转移连同包装质粒和VSV-G包膜表达质粒（质粒信息，请参阅材料表）载体。
   注意:有用的信息有关病毒的产生是指GAVRILESCU 等^[10]。虽然它描述逆转录病毒生产，关于293T细胞和质粒DNA的质量一般评论是慢病毒的生产也是如此。
   小心:适当的安全措施需要与慢病毒载体和工作时进行拍摄，具有在生物安全等级2设施执行。
2. 外套个100毫米培养皿用聚-L-赖氨酸（100微克/毫升）通过覆盖菜用5ml溶液并轻轻摇动以均匀分布的涂层溶液溶液。放置碗碟放回培养箱中于37℃30分钟。 30分钟后吸出涂布溶液，并用PBS漂洗碗碟一次​​。
3. 板7×10 ⁶ 293T细胞培养皿每10毫升293T细胞媒体，SWIRL菜在37℃下均匀地分布的细胞和地方菜肴放回培养箱中。
4. 第二天早上，用5ml转染培养基替换生长培养基。添加6微升1000倍的股票氯溶液（25毫米），地方菜的回37℃培养箱。
5. 同时，准备转染混合物:
   1. 对于每一个慢病毒载体准备两个5毫升的反应管中，标记为A和B.
   2. 添加600μl的2×HEPES缓冲盐水（HBS）到管A.
   3. 管B中混合61.5微升的CaCl ₂溶液（2M），用18.5微克慢病毒DNA和9.25微克psPAX2和9.25微克pMD2.G.的音量调整到600微升无菌文化品位H ₂ O.
   4. 从加入B管滴来管的解决方案，而涡旋。孵育转染混合物在室温15分钟。
6. 添加转染混合物非常小心滴明智的准备293T细胞上100毫米的菜。一个压脚提升5至6小时除去培养基并用10毫升的病毒生产培养基替换。放置碗碟放回培养箱中于37℃。
   注:拆卸和更换介质，因为293T细胞很容易地从盘分离时要小心。更换培养基在转染后5-6小时是至关重要的，因为长时间暴露于氯喹是对细胞有毒。
7. 第二天早晨，小心地取出并抛弃中，用7ml病毒生产培养基替换。
8. 第二天早上收获了第一批含病毒的培养基。吸中，收集15毫升锥形管。再次，添加7毫升病毒生产培养基到细胞上。含病毒介质在冰箱商店直到第二批收获第二天。
9. 第二天早上吸第二批含有病毒的介质其加入到15ml含有第一批锥形管的。 293T细胞现在可以丢弃。含病毒介质通过0.45μm河畔滤波器免费factant - 醋酸纤维素-membrane过滤器。等分试样过滤，介质和存储在-80℃用于进一步使用含病毒。
   注:病毒生产也可以在6孔皿进行。因此缩小体积和手机号码。

4.成纤维细胞转导有4个因素与mCherry矢量控制

注意:所有步骤在生物安全等级2设施进行。

1. 为实验概要的示意图见图1。解冻初级rtTA-MEF中的一个等分试样和板每6孔培养皿的孔3.33×10 ^5个细胞在2毫升的MEF培养基的总体积。至少准备3井和4个因素（4F），mCherry和控制贴上标签。
   注意:可替换地，野生型MEFs中可以使用，当步骤4.2中一个rtTA表达慢病毒载体被添加到慢病毒鸡尾酒。
2. 细胞后第二天从cryopre完全恢复servation，更换三六井传导介质为0.6毫升（4F），0.9毫升（mCherry）1毫升（控制）MEF媒体分别。解冻PLV-TETO-TFAP2C，-Gata3，-Eomes，-ets和-mCherry病毒之一等分在室温，加入100微升各含病毒的上清液（TFAP2C，GATA3，EOMES，ETS2）到4F好。
   注意:在野生型的MEF的情况下，由100微升减少预电镀媒体的体积和另加100μl包含上清到4F混合FUdeltaGW-rtTA病毒。
3. 加入100微升mCherry含有病毒的媒体与mCherry井标记。加入聚凝胺至8微克/毫升到每个孔中的最终浓度。放置培养皿放回培养箱中于37℃孵育的MEF O / N与含有病毒的上清液。
   注意:在野生型的MEF的情况下，由100微升减少预电镀媒体的体积和另加100微升FUdeltaGW-rtTA含病毒上清。
4. 第二天早晨，小心地取出含有病毒的介质和洗涤三次用2ml PBS中。最后，加2ml TS媒体（不FGF4 /肝素）。
   注意:转导的MEF既可以直接用于ITSC感应实验或冷冻用于进一步使用。

5.成纤维细胞转化ITSC

注意:所有步骤都是在授权给生物安全2级实验室空间进行。

1. 4分钟 - 用2毫升PBS和加入0.5ml胰蛋白酶/ EDTA溶液孵化它们在孵化器3洗净后转的MEF的两倍。检查细胞的合适脱离倒置显微镜下。
   1. 通过加入1ml的TS介质灭活胰蛋白酶。细胞悬液转移到15毫升锥形管中并离心，在200×g下3分钟。弃去上清，重悬在2ml的TS培养基中的细胞。使用未转染对照样品计数细胞。
   2. 板4F-的MEF，mCherry-的MEF和未转导的MEF控制各以2×10 ⁵的密度每100mm细胞培养皿细胞在10毫升的TS培养基含有2微克/毫升DOX（TS培养基+ FGF4 /肝素+ DOX）。
   3. 另外，在较小的菜肴进行转。板上所需盘大小，缩放量相应地^每平方厘米3.6×10 ^3个 。
2. 第二天，用落射荧光显微镜（使用10X透镜和适合于红色荧光激发过滤器）监视器，以估计转导效率mCherry蛋白质的表达。
   注意:转导效率应接近100％。如果增加的细胞死亡是转基因诱导后显而易见。这意味着病毒滴度过高。转导应具有减少的含病毒介质的量被重复。
3. 从现在开始，改变媒体隔日，直到电镀后的10天所有的菜。此后，与饲料中的TS细胞无DOX（TS培养基+ FGF4 /肝素）。
4. 使用倒置显微镜监测的外观"转分化区"（参照图2B和C）上4F盘长达3周。这样的菌落不应该在两个控制盘（mCherry-MEF中和未转的MEF）可见。

6.隔离个别ITSC线路

注意:对于步骤6.3不需要组织培养罩。建议擦拭用70％乙醇在倒置显微镜，以减少细菌污染的机会。个别ITSC菌落天21和转分化28天之间进行分离。

1. 加入40微升0.05％胰蛋白酶/ EDTA溶液到96 U型底孔盘的12口井，并置于冰上的菜。
2. 菌落分离，在4F-MEF转碟吸介质之前。用10ml的PBS洗涤细胞一次。再次，加10毫升的PBS和地点培养皿倒置显微镜下。
3. 使用100微升移液器设置为40微升抬单个菌落，用C枪头ircling他们吸浮殖民地。一个菌落转移细胞每到准备好的96孔盘的一个孔中。采摘后12菌落置于在37℃下孵化5分钟的96孔培养皿中。
4. 通过上下吹打数次和转移细胞悬液与制备500μl的TS-CM培养基（30％的新鲜的TS培养基+ 70％的CM + FGF4 /肝素）的24孔培养皿的一个孔中解离的细胞。
5. 第二天用新鲜的TS-CM培养基更换培养基去除死细胞。更换培养基隔日1次。
6. 监视器明亮的界限上皮菌落外观（参见图2）。一旦出现菌落，培养至70％汇合或长达一个星期，并逐步扩大更大的菜肴。从现在开始，培养细胞作为真正的TSC，根据在含血清培养基或无血清，确定的培养基^-3,5,11-标准协议。

结果

上，其中4F的转基因表达被激活的菜，细胞迅速改变形态（比较图2A和B）。围绕天14 - 21不同转分化区域出现（两个例子在图2B和C给出）。这些主要的菌落缺乏典型的TSC形态;然而，一旦他们的子培养，特色上皮形态与紧边和明亮的界限高度回忆善意的TSC的出现（ 图2D）。 4F-iTSCs染色阳性的滋养层转录因子CDX2和TFAP2C（ 图2E）。这些ITSC线现在可以在体外或体内分析用于后续， 即 ， 在体外分化测定法或胎盘嵌合实验。

图1. MEF到ITSC转换的时间轴。MEF中的转分化iTSCs的图形表示...

讨论

这里介绍的4因子（TFAP2C，GATA3，EOMES，ETS2）的转协议提供了一种可靠的方法来生成忠实地转换从小鼠胚胎成纤维细胞iTSCs。此外，该方法也适用于产后尾成纤维细胞，虽然在效率的降低相比胚胎成纤维细胞^3。在一般情况下，初级成纤维细胞的质量是转结果和护理的一个关键因素，应采取使用早期传代细胞（传代两到三个）。

该协议的优点是使用强力霉素诱导的载体，它允许转基因表达的时空控制。这使得那激活内源转录因子网络稳定ITSC线，保持TSC命运独立的转基因表达的产生。这与先前公布的协议，描述的TSC命运从胚胎干细胞的诱导，一种方法塔吨至迄今只有不完全产生滋养层重编程的干细胞样细胞^1。

然而，在这里描述的方案的一个已知的限制是变量数新兴转分化菌落，因此很难预测转效率。这些限制是由于几个高度可变因素的影响，这些都为转结果至关重要:单慢病毒载体的转导效率，起始细胞群的增殖的量，和细胞死亡的转期间的量。在某些情况下转分化ITSC菌落不出现。在这种情况下，媒体和试剂应为自己支持正版TSC文化，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Hyclate 多西环素	Sigma-Aldrich	D9891-10G	溶于无菌 PBS 中，制备 2 mg/ml 储备液。将等分试样储存在 -20 °C;C
氯喹二磷酸盐	Sigma-Aldrich	C6628-25G	在无菌细胞培养级水中制备 25 mM 储备液。将等分试样储存在 -20 °C;C
聚凝胺（溴化己二甲铵）	Sigma-Aldrich	107689-10G	在无菌细胞培养级水中制备 8 mg/ml 储备液。将等分试样储存在 -20 °C;C
人重组成纤维细胞生长因子 4	ReliaTech	300-131L	溶于 PBS 中的无菌 0.1% BSA 中，制备 25 &微量;g/ml 储备液。将等分试样储存在 -80 °C;C
肝素钠盐	Sigma-Aldrich	H3149-10KU	溶解在无菌 PBS 中，制备 1 mg/ml 储备液。将等分试样储存在 -80°;C
ProFection 哺乳动物转染系统	Promega	E1200
PBS，无钙、无镁	ThermoFisher Scientific	1419-094
DMEM （1x） + GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	31966-021
RPMI 1640，无谷氨酰胺	ThermoFisher Scientific	31870-025
Advanced DMEM （1x）	ThermoFisher Scientific	12491-015
胰蛋白酶-EDTA （0.05%），酚红	ThermoFisher Scientific	25300-054
聚-L-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P4707
胎牛血清	Hyclone	SH30071.03IR
不含表面活性剂的醋酸纤维素膜过滤器	康宁	431220
非必需氨基酸	ThermoFisher Scientific	11140-035
青霉素 链霉素	ThermoFisher Scientific	15140-122
丙酮酸钠	ThermoFisher Scientific	11360-039
L-谷氨酰胺	ThermoFisher Scientific	25030-24
2-巯基乙醇	ThermoFisher Scientific	31350-010
二甲基亚砜 （DMSO），细胞培养级	Panreac AppliChem GmbH	A3672,0100
pLV-tetO-Tfap2c	Addgene	70269
pLV-tetO-Gata3	Addgene	70270
pLV-tetO-Eomes	Addgene	70271
pLV-tetO-Ets2	Addgene	70272
pLV-tetO-mCherry	Addgene	70273
psPAX2	Addgene	12260
pMD2.G	Addgene	12259
FUdeltaGW-rtTA	Addgene	19780
小鼠 B6。Cg-GT（ROSA）26Sortm1（rtTA*M2）Jae/J 7	JAX 小鼠	6965
129S2SV	查尔斯·里弗	129