小鼠胚胎成纤维细胞直接转化为滋养层干细胞的实验方案

摘要

本文介绍了一种通过在十天内过表达 Tfap2c、Gata3、Eomes 和 Ets2，将小鼠胚胎成纤维细胞直接转化为功能完整且稳定的滋养层干细胞的实验方案。

摘要

滋养层干细胞（Trophoblast stem cells, TSCs）是哺乳动物发育过程中首次细胞命运决定的产物。它们可以被培养 体外，保持自我更新能力，并能分化为滋养层谱系的所有亚型，相当于 体内 产生胎盘胎儿部分的干细胞群体。因此，滋养层干细胞（TSCs）为研究胎盘发育以及胚胎与胚外细胞命运决定提供了独特的模型 体外从囊胚阶段开始，由DNA甲基化和组蛋白修饰构成的特定表观遗传屏障严格区分了这两个谱系。本文介绍了一种通过在小鼠胚胎成纤维细胞中瞬时过表达滋养层关键调控因子Tfap2c、Gata3、Eomes和Ets2，以完全克服该谱系屏障的实验方案。所诱导生成的滋养层干细胞具有自我更新能力，在形态学、标志基因表达及甲基化模式方面与囊胚来源的滋养层干细胞几乎完全相同。功能上 体外 和 体内 检测证实，这些细胞能够沿滋养层谱系分化，产生多倍体滋养层巨细胞，并在注入胚泡时嵌合到胎盘中。由体细胞组织诱导产生滋养层干细胞为研究这一胚外谱系的遗传与表观遗传特性开辟了新途径，同时也提供了无需破坏相应胚胎即可生成滋养层干细胞系的可能性。

引言

最近，一项比较多种小鼠胚胎干细胞向滋养层干细胞转化方法的研究表明，在所有被分析的系统中，谱系转化均未完全完成。所生成的并非诱导性滋养层干细胞（iTSCs），而是所谓的滋养层干细胞样细胞，这些细胞仍保留着起源细胞命运的记忆¹。在此，我们采用了一种不同的iTSC生成策略。类似于从小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）直接诱导生成多能干细胞的方法²，我们实现了从已分化的体细胞组织直接转化为iTSCs。首先，我们筛选出12个候选因子，当在MEFs中过表达时可诱导滋养层干细胞命运。随后发现，Tfap2c、Gata3、Eomes和Ets2这四个因子对于诱导iTSCs是必要且充分的³。与此同时，另一研究团队独立证实Tfap2c、Gata3和Eomes三个因子足以将MEFs转化为iTSCs。然而，在该研究中，相较于我们的实验，外源基因表达所需时间显著更长，表明当转分化组合中缺少Ets2时，转化动力学存在差异⁴。

传统的含有胎牛血清（FBS）的培养体系在诱导型及囊胚来源的滋养层干细胞培养中依赖于经增殖失活的MEF细胞所分泌的因子^5,6。在诱导型滋养层干细胞（iTSC）的诱导过程中，这些因子由MEF细胞提供，这些MEF细胞不携带完整的转基因组合，也不会发生转分化。然而，一旦单个iTSC克隆被传代培养，它们就需要使用经增殖失活的MEF细胞预处理过的培养基。此后，iTSC可按照标准操作流程，像囊胚来....

方案

所有小鼠实验均依照德国动物保护法进行，并获得当地机构动物护理委员会（北莱茵-威斯特法伦州自然、环境与消费者保护局[批准编号：AZ 84-02.04.2013.A428]）的批准。

1. 培养基制备

1. 配制293T培养基：DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基），10%（v/v）胎牛血清（FBS），L-谷氨酰胺（2 mM），丙酮酸钠（1 mM），青霉素/链霉素（1×）。
2. 配制MEF培养基：DMEM，10%（v/v）FBS，L-谷氨酰胺（2 mM），1×非必需氨基酸，青霉素/链霉素（1×）。
3. 配制TS培养基（不含FGF4/肝素）：RPMI 1640（Roswell Park Memorial Institute 1640培养基），20%（v/v）FBS（干细胞培养级），青霉素/链霉素（1×），L-谷氨酰胺（2 mM），丙酮酸钠（1 mM），2-巯基乙醇（0.1 mM）。
4. 配制含FGF4/肝素的TS培养基（TS + F4H）：RPMI 1640，20%（v/v）FBS（干细胞培养级），青霉素/链霉素（1×），L-谷氨酰胺（2 mM），丙酮酸钠（1 mM），2-巯基乙醇（0.1 mM），25 ng/ml FGF4，1 µg/ml肝素。
   注意：FGF4和肝素需在使用前立即直接加入培养基中。
5. 配制含FGF4/肝素的TS条件培养基（TS-CM + F4H）：70% M....

结果

在转基因表达4F被激活的培养皿中，细胞形态迅速发生变化（比较 图2A和B。大约在第14至21天，出现明显的转分化区域（文中给出了两个示例） 图2B和C）。这些原代集落缺乏典型的滋养层干细胞（TSC）形态；然而，一旦进行传代培养，便会呈现出特征性的上皮样形态，边缘紧密、边界清晰，与真正的TSCs高度相似（图 2D）。4F-iTSCs 对滋养层转录因子 Cdx2 和 Tfap2c 呈阳性染色（图2E）。这些诱导性滋养层干细胞系现在可用于后续实验 体外 或 体内 分析， 即, 体外 分化实验或胎盘嵌合实验。

讨论

本文介绍的基于4种因子（Tfap2c、Gata3、Eomes、Ets2）的转分化方案，提供了一种可靠的方法，可将小鼠胚胎成纤维细胞高效地转化为诱导型滋养层干细胞（iTSCs）。此外，该方法也可用于出生后尾部成纤维细胞的转化，但其效率较胚胎成纤维细胞有所下降³。总体而言，原代成纤维细胞的质量是转分化效果的关键因素，应尽量使用低代次细胞（第2至第3代）。

本方案的优势在于使用强力霉素诱导型载体，可实现对转基因表达的时间控制。这使得能够建立稳定的诱导型滋养层干细胞（iTSC）系，激活内源性转录因子网络，从而在不依赖转基因表达的情况下维持滋养层干细胞命运。这与先前发表的方案形成对比，后者描述了从胚胎干细胞诱导产生滋养层干细胞命运的方法，而该方法迄今为止仅能获得重编程不完全的类滋养层干细胞¹。

然而，本方案的一个已知局限性在于转分化后出现的克隆数量存在变异，导致难以预测转分化效率。这些局限性是由于 若干高度可变的因素对转分化结果至关重要：单个慢病毒载体的转导效率、起始细胞群体的增殖程.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
盐酸多西环素	Sigma-Aldrich	D9891-10G	溶于无菌 PBS 中，配制 2 mg/ml 储存液。分装后于 -20 °C 保存
磷酸氯喹	Sigma-Aldrich	C6628-25G	用无菌细胞培养级水配制 25 mM 储存液。分装后于 -20 °C 保存
聚凝胺（六亚甲基溴化双胺）	Sigma-Aldrich	107689-10G	用无菌细胞培养级水配制 8 mg/ml 储存液。分装后于 -20 °C 保存
人重组成纤维细胞生长因子 4	ReliaTech	300-131L	溶于含 0.1% BSA 的无菌 PBS 中，配制 25 µg/ml 储存液。分装后于 -80 °C 保存
肝素钠盐	Sigma-Aldrich	H3149-10KU	用无菌 PBS 溶解，配制 1 mg/ml 储存液。分装后于 -80°C 保存
ProFection 哺乳动物转染系统	Promega	E1200
PBS，不含钙、不含镁	ThermoFisher Scientific	1419-094
DMEM (1x) + GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	31966-021
RPMI 1640，不含谷氨酰胺	ThermoFisher Scientific	31870-025
高级 DMEM (1x)	ThermoFisher Scientific	12491-015
胰蛋白酶-EDTA (0.05%)，含酚红	ThermoFisher Scientific	25300-054
聚-L-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P4707
胎牛血清	Hyclone	SH30071.03IR
无表面活性剂的醋酸纤维素膜滤器	Corning	431220
非必需氨基酸	ThermoFisher Scientific	11140-035
青霉素-链霉素	ThermoFisher Scientific	15140-122
丙酮酸钠	ThermoFisher Scientific	11360-039
L-谷氨酰胺	ThermoFisher Scientific	25030-24
2-巯基乙醇	ThermoFisher Scientific	31350-010
二甲基亚砜 (DMSO)，细胞培养级	Panreac AppliChem GmbH	A3672,0100
pLV-tetO-Tfap2c	Addgene	70269
pLV-tetO-Gata3	Addgene	70270
pLV-tetO-Eomes	Addgene	70271
pLV-tetO-Ets2	Addgene	70272
pLV-tetO-mCherry	Addgene	70273
psPAX2	Addgene	12260
pMD2.G	Addgene	12259
FUdeltaGW-rtTA	Addgene	19780
小鼠 B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7	JAX Mice	6965
129S2SV	Charles River	129