方法文章

小鼠原位接种卵巢癌细胞构建原发肿瘤及腹膜转移的实验模型 via 正位接种卵巢癌细胞

DOI：

10.3791/54353

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2016年12月9日

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1Bell Research Center for Reproductive Health and Cancer, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Nagoya University Graduate School of Medicine, 3Department of Cancer Biology, Nagoya University Graduate School of Medicine

本文内容

摘要

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为了阐明卵巢癌腹膜播散的多步骤过程，本研究通过将这些肿瘤细胞进行原位接种，建立了一种小鼠实验模型，用于原发肿瘤的形成及腹膜转移的研究。

摘要

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上皮性卵巢癌（EOC）因具有腹膜播散特性而预后较差。为了改善预后，控制腹膜播散至关重要。然而，肿瘤细胞如何从原发灶脱落并黏附至间皮层的机制仍不明确。in vivo条件下理解腹膜播散机制需要建立合适的动物模型。本研究介绍了将EOC细胞局部注射至小鼠卵巢表面后，肿瘤转移至腹膜及远端器官的全过程。实验采用8周龄雌性裸鼠（BALB/c nu/nu）。在显微镜视野下，通过背部侧 flank 的腹膜后途径，将EOC细胞（1 × 105 细胞/µl 培养基-细胞外基质（ECM）水凝胶/单侧卵巢/小鼠）注射至小鼠卵巢。该方法对小鼠创伤较小，且可最大限度减少对卵巢的损伤。本文详细描述了EOC原位及转移性肿瘤形成的实验操作步骤。

引言

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上皮性卵巢癌（EOC）在妇科恶性肿瘤中导致的癌症相关死亡率最高1。EOC 预后较差，主要原因是其症状出现较晚，且常伴有多种腹膜内播散和远处转移2-4。腹膜播散是一个多步骤过程：首先，肿瘤细胞从原发灶脱落并迁移至腹腔；当肿瘤细胞附着于腹膜间皮层后，便开始通过间皮层侵入组织5,6。为了更好地理解肿瘤生物学特性（例如，癌症进展和治疗反应），小鼠模型提供了大量信息。将人源癌细胞移植至小鼠体内建立异种移植模型，通常采用皮下、腹腔内、静脉内或原位接种等方式。与异位移植肿瘤的动物模型相比，原位移植肿瘤的动物模型能够更高效、更准确地模拟人类肿瘤微环境。因此，针对多种人类肿瘤，已建立了相应的原位移植模型7-11。

本文描述了通过背侧腹膜后途径进行人卵巢上皮癌（EOC）细胞原位接种的方法，该方法相较于腹侧接种具有较低的侵入性。该技术可提供关于EOC的多种有用信息，尤其是腹膜内播散机制方面的研究。

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方案

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治疗方案遵循名古屋大学采用的动物实验指导原则。

1. 细胞悬液的制备

  1. 人卵巢透明细胞癌细胞系。
    1. 将ES-2细胞12 培养于含10%胎牛血清（FBS）和青霉素/链霉素（青霉素：100单位/ml，链霉素：0.1 mg/ml）的RPMI-1640培养基中。于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中培养细胞。
    2. 用0.05%胰蛋白酶/0.02% EDTA溶液（胰蛋白酶/EDTA）收集对数生长期的细胞。
      1. 首先从细胞培养容器中移除旧培养基，然后用PBS洗涤细胞一次（无Ca2+/Mg2+的PBS，每25 cm2加3–4 ml）。
      2. 接着每25 cm2加入1 ml胰蛋白酶/EDTA，旋转培养容器使胰蛋白酶/EDTA覆盖细胞单层。吸除并弃去胰蛋白酶/EDTA后，将培养容器放回培养箱中孵育3–5分钟，或直至细胞脱落。
      3. 在显微镜下观察细胞，确认细胞已从培养容器表面脱落并悬浮。
      4. 加入含新鲜血清的生长培养基以灭活胰蛋白酶（每25 cm2加5 ml），重悬细胞。将重悬后的细胞转移至15 ml锥形管中。
      5. 以300 × g离心5分钟。可在4 °C或室温下进行离心。小心吸除....

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结果

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按照本方案所述，六只裸鼠的卵巢接种了人透明细胞癌细胞系 ES-2。如图1A所示，接种后2周，6只小鼠中有5只在接种ES-2细胞的卵巢中形成肿瘤，而未接种的对侧卵巢（作为对照）未见肿瘤生长。此外，5只成瘤小鼠中有2只出现多发性腹膜转移并伴有腹水。癌细胞转移至肝脏（图1B）。将接种侧和对照侧的卵巢均进行解剖，切片后进行苏木精-伊红（HE）染色，并在显微镜下分析（图2）。在接种侧卵巢中观察到大量卵巢癌细胞，而对侧卵巢未见癌细胞。癌细胞形态与亲本肿瘤一致。

小鼠模型中 ES2 细胞接种后的组织反应，比较分析，组织学研究。
图 1：.......

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讨论

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动物模型对于分析肿瘤发生、发展、转移以及抗癌药物对癌细胞作用机制至关重要。携带人卵巢癌细胞的小鼠也已被用作动物模型。本文介绍一种在原位接种卵巢肿瘤细胞的微创操作方法。该方法通过背部侧区经腹膜后途径将细胞接种至卵巢，相较于其他常用技术具有显著优势。首先，原位接种能够更高效、准确地模拟人类肿瘤微环境13,21。其次，这种从背部侧区进行的腹膜后入路仅需较小的切口（< 1 - 2 cm），与腹腔入路相比操作更为快速。因此，该腹膜后入路对小鼠的创伤更小。第三，小鼠卵巢体积很小，难以容纳大量试剂。在本方案中，我们采用高浓度细胞悬液（1 × 105 个细胞/µl）并以单次低接种体积（1 - 2 µl/次）进行注射，从而最大限度减少对卵巢的损伤，同时避免接种细胞从卵巢泄漏。尽管仍需进一步研究，但所述的小鼠原位接种方法可能为未来上皮性卵巢癌（EOC）新疗法的开发提供有力支持。

本实验方案中有两个关键点。首先，细胞应处于对数生长期。其次，用基于细胞外基质（ECM）的水凝胶悬浮的细胞在使用前需置于冰上。当基于ECM的水凝胶开始升温时，凝胶化过程即会启动.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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作者感谢妇产科和癌症生物学系成员提供的有益讨论和技术支持。本研究由日本科学促进会（JSPS）科学研究费补助金（15K15604；授予 H. Kajiyama）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Matrigel 基质 BD354234基于 ECM 的水凝胶
胰岛素注射器TERUMOSS-05M29131/2 cc，29 G × 1/2"
带缝线的缝合针11 mm，3/8，尼龙线 6-0
Reflex 7 mm 伤口缝合钉施加器CellPoint Scientific204-1000
 Reflex 7 mm 伤口缝合钉CellPoint Scientific203-1000

参考文献

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  1. Jemal, A., et al. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin. 61 (2), 69-90 (2011).
  2. Kajiyama, H., et al. Long-term clinical outcome of patients with recurrent epithelial ovarian carcinoma: is it the same for each histological type. ....

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EDTA

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