小鼠原位接种卵巢癌细胞构建原发肿瘤及腹膜转移的实验模型 via 正位接种卵巢癌细胞

摘要

为了阐明卵巢癌腹膜播散的多步骤过程，本研究通过将这些肿瘤细胞进行原位接种，建立了一种小鼠实验模型，用于原发肿瘤的形成及腹膜转移的研究。

摘要

上皮性卵巢癌（EOC）因具有腹膜播散特性而预后不良。为了改善预后，控制腹膜播散至关重要。然而，肿瘤细胞如何从原发灶脱落并黏附于间皮层的机制尚不明确。建立合适的动物模型对于阐明腹膜播散的机制十分必要 体内在本研究中，我们介绍了从人上皮性卵巢癌（EOC）细胞局部注射至小鼠卵巢表面，到肿瘤发生腹膜及远端器官转移的完整过程。实验采用8周龄雌性裸鼠（BALB/c nu/nu）。在显微镜视野下，将EOC细胞（1 × 10⁵ 通过背部侧腹膜后途径，将细胞/µl 培养基-细胞外基质（ECM）-基水凝胶/单侧卵巢/小鼠注入小鼠卵巢。该方法是一种对小鼠创伤较小的微创操作，可最大限度减少对卵巢的损伤。本文中，我们描述了卵巢上皮性癌（EOC）原发性及转移性肿瘤形成的实验方法步骤。

引言

上皮性卵巢癌（EOC）在妇科恶性肿瘤中导致的癌症相关死亡率最高¹。EOC 预后较差，主要原因是其症状出现较晚，且常伴有多种腹膜内播散和远处转移^2-4。腹膜播散是一个多步骤过程：首先，肿瘤细胞从原发灶脱落并迁移至腹腔内；当肿瘤细胞附着于腹膜间皮层后，便开始通过间皮层侵入组织^5,6。为了更好地理解肿瘤生物学特性（例如，癌症进展和治疗反应），小鼠模型提供了大量信息。将人源癌细胞移植到小鼠体内的异种移植模型被广泛应用，人癌细胞可通过皮下、腹腔内、静脉内或原位接种等方式植入。与异位移植的动物模型相比，原位移植肿瘤的动物模型能够更高效、更准确地模拟人类肿瘤微环境。因此，针对多种人类肿瘤，已建立了原位移植模型^7-11。

本文描述了通过腹膜后途径从背部 flank 区域进行人 EOC 细胞原位接种的方法，与腹侧接种相比，该方法的侵入性更小。该技术可提供关于 EOC 的多种有用信息，尤其是腹膜内播散的机制。

方案

治疗方案遵循名古屋大学采纳的动物实验指导原则。

1. 细胞悬液的制备

1. 人卵巢透明细胞癌细胞系。
   1. 将ES-2细胞¹² 培养于含10%胎牛血清（FBS）和青霉素/链霉素（青霉素：100单位/毫升，链霉素：0.1毫克/毫升）的RPMI-1640培养基中。于37 °C、5% CO₂的湿化培养箱中培养细胞。
   2. 用0.05%胰蛋白酶/0.02% EDTA溶液（胰蛋白酶/EDTA）收集处于对数生长期的细胞。
      1. 首先从细胞培养容器中移除旧培养基，然后用PBS洗涤细胞一次（无Ca²⁺/Mg²⁺的PBS，每25 cm²加3–4 ml）。
      2. 接着每25 cm²加入1 ml胰蛋白酶/EDTA，旋转培养容器使胰蛋白酶/EDTA覆盖细胞单层。吸除并弃去胰蛋白酶/EDTA后，将培养容器放回培养箱中孵育3–5分钟，或直至细胞脱落。
      3. 在显微镜下观察细胞，确认细胞已从培养容器表面脱落并悬浮。
      4. 加入含新鲜血清的生长培养基以灭活胰蛋白酶（每25 cm²加5 ml），重悬细胞。将重悬后的细胞转移至15 ml锥形管中。
      5. 以300 × g离心5分钟。可在4 °C或室温下进行离心。小心吸除上清液，并用生长培养基重悬细胞（每25 cm²加5 ml）。
   3. 对细胞进行计数（例如，通过台盼蓝排斥法），然后以2 × 10⁸ 个细胞/毫升的密度重悬于生长培养基中。将细胞悬液置于冰上。
2. 在冰浴中解冻基于细胞外基质（ECM）的水凝胶冻存 aliquot。
3. 按1:1的比例将细胞悬液加入基于ECM的水凝胶aliquot中（最终细胞浓度：1 × 10⁵ 个细胞/µl 培养基-ECM水凝胶），充分混匀。将制备好的细胞悬液置于冰浴中待用。

2. 细胞悬液的原位接种

注意：手术无需专用手术室。手术可在实验室工作台面上进行，但应选择房间内独立且活动较少的区域。也可使用层流罩。必须使用无菌外科器械，且不得使用剪刀进行皮肤切口。

1. 使用8周龄的雌性裸鼠（BALB/c nu/nu）进行该原位接种模型实验。
2. 首先，使用异氟烷（2 - 4%）吸入麻醉小鼠。通过用力捏压脚趾无回缩反应来确认麻醉深度。小鼠麻醉后，根据需要在其眼睛上涂抹无刺激性的无菌眼膏，以防止角膜干燥。
3. 将麻醉后的小鼠腹侧朝下置于手术台上。使用酒精以及含碘或含氯己定的消毒剂反复消毒手术区域数次。
4. 在右侧肋弓与股骨之间靠近脊柱处，纵向做一个约2厘米的切口。在切口周围使用无菌手术巾。用夹子固定切开的皮肤边缘以保持切口开放。
   注意：可使用牵开器代替止血钳。
5. 接下来，在第一切口下方的壁层腹膜上做第二个切口（约1 cm），以打开腹腔。用止血钳夹住切开的腹壁切口边缘。用止血钳夹住包围同侧卵巢和输卵管的脂肪组织，将卵巢从腹腔中取出。小心地将卵巢和输卵管置于纱布上。然后，将小鼠腹部朝下放置于解剖显微镜下。
6. 将细胞悬液在注射前置于胰岛素注射器（1/2 cc，29 G）中。小心地将制备好的细胞悬液（1–2 µl）注入卵巢。注射后保持针头在卵巢内数秒，以确保基于细胞外基质的水凝胶发生凝胶化。凝胶化完成后，注入的肿瘤细胞将保留在卵巢内部。
7. 将卵巢小心放回体内。用无菌医用丝线缝合第二处切口，然后用伤口夹封闭皮肤。
8. 术后，小鼠将接受镇痛处理（例如，美洛昔康，肌内（i.m.）或皮下（s.c.）注射，0.2 mg/kg，持续最初24小时 时期。

3. 术后治疗

1. 将每只小鼠单独置于一个笼子中，笼内铺上干净的纸巾并放置暖包，以保持小鼠体温，直至其恢复足够的意识并能维持胸卧位。随后，将动物放回笼中进行饲养和观察。手术处理后每日观察小鼠 3 至 7 天。
2. 术后小鼠的观察
   1. 若出现疼痛症状，每日给予镇痛药物（例如，美洛昔康，肌内或皮下注射，0.2 mg/kg）。
   2. 若小鼠出现感染迹象（例如，红肿、分泌物），每日注射抗感染试剂（例如，青霉素，肌内注射，100,000 IU/kg）。
3. 术后 10 至 14 天拆除皮肤闭合材料。

4. 肿瘤与转移灶的分析

注意：接种后2-3周，注射侧卵巢将形成肿瘤。

1. 通过二氧化碳处死小鼠，然后采集样品（例如肿瘤、转移灶、器官^13-15 用于进一步分析^14,16-20.
   注意：如果一个 体内 成像系统可用时，可检测表达能够产生生物发光的酶的细胞（例如，荧光素酶）或荧光蛋白（例如，GFP）可用于本实验方案。该改良方案将为癌细胞从原发性肿瘤扩散的动态过程提供有价值的信息。

结果

按照本方案所述，六只裸鼠的卵巢接种了人透明细胞癌细胞系 ES-2。如图1A所示，接种后2周，6只小鼠中有5只在接种ES-2细胞的卵巢中形成肿瘤，而未接种的对侧卵巢（作为对照）未见肿瘤。此外，5只成瘤小鼠中有2只出现多发性腹膜播散并伴有腹水。癌细胞转移至肝脏（图1B）。将接种侧和对照侧的卵巢均进行解剖，切片后用苏木精-伊红（HE）染色，并在显微镜下分析（图2）。在接种侧卵巢中观察到大量卵巢癌细胞，而在对侧卵巢中未见癌细胞。癌细胞形态与亲本肿瘤一致。

图 1：<...

讨论

动物模型对于分析肿瘤发生、发展、转移以及抗癌药物对癌细胞作用机制至关重要。携带人卵巢癌细胞的小鼠也已被用作动物模型。本文介绍一种在原位接种卵巢肿瘤细胞的微创操作方法。该方法通过背部侧 flank 的腹膜后途径将细胞接种至卵巢，相较于其他常用技术具有显著优势。首先，原位接种能够更高效、准确地模拟人类肿瘤微环境^13,21。其次，这种从背部 flank 进行的腹膜后入路仅需较小的切口（< 1 - 2 cm），与腹腔入路相比操作更为快速。因此，该腹膜后入路对小鼠的创伤更小。第三，小鼠卵巢体积很小，难以容纳大量试剂。在本方案中，我们采用高浓度细胞悬液（1 × 10⁵ 个细胞/µl）并以单次低接种体积（1 - 2 µl/次）进行注射，从而最大限度减少对卵巢的损伤，同时避免接种细胞从卵巢泄漏。尽管仍需进一步研究，但所述的小鼠原位接种方法可能为未来上皮性卵巢癌（EOC）新疗法的开发提供有力支持。

该实验方案中有两个关键点。首先，细胞应处于对数生长期使用。其次，用基于细胞外基质（ECM）的水凝胶悬浮的细胞需置于冰上直至使用。当基于ECM的水凝胶开始...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Matrigel 基质	BD	354234	基于细胞外基质的水凝胶
胰岛素注射器	TERUMO	SS-05M2913	1/2 cc，29 G × 1/2"
带缝线的缝合针			11 mm，3/8，尼龙线 6-0
Reflex 7 mm 伤口缝合钉施加器	CellPoint Scientific	204-1000
Reflex 7 mm 伤口缝合钉	CellPoint Scientific	203-1000