利用转录因子重编程小鼠胚胎成纤维细胞以诱导造血程序

摘要

本文所述方案详细介绍了通过过表达少量转录因子，在小鼠胚胎成纤维细胞中诱导造血程序的方法。该技术可被拓展至人类体系，为未来研究造血过程、血液系统疾病以及造血干细胞移植提供平台。

摘要

本方案详细描述了通过过表达转录因子（TFs）在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中诱导造血程序的方法。我们首先设计了利用人源CD34-tTA/TetO-H2BGFP（34/H2BGFP）双转基因小鼠来源的MEFs进行的报告基因筛选。CD34⁺ 这些小鼠的细胞用GFP标记H2B组蛋白，并在加入多西环素（DOX）后停止标记。MEFs被转导候选转录因子（TFs）后，观察GFP的出现情况⁺ 可指示造血或内皮细胞命运获得的细胞。从18个候选转录因子（TFs）出发，通过组合式筛选剔除，我们获得了一组最小因子组合，可诱导最高比例的GFP⁺ 细胞。我们发现Gata2、Gfi1b和cFos是必需的，而加入Etv6可实现最佳诱导效果。在重编程过程的不同时间点进行的一系列基因表达分析显示，这些细胞似乎经历了一个由内皮向造血转变（EHT）的前体细胞阶段。因此，该重编程过程实现了“在培养皿中”模拟发育性造血，从而为研究造血过程提供了可能 体外 以及一个用于鉴定该特化过程机制的平台。该方法还为将此项研究转化应用于人类系统提供了框架，旨在为多种血液系统疾病的治疗和研究提供一种替代来源的患者特异性造血干细胞（HSCs）。

引言

造血作用是一个复杂的发育过程，其中造血干细胞（HSCs）从存在于多种胚胎造血位点（如主动脉-性腺-中肾区和胎盘）的生血性内皮中产生^1,2无法培养造血干细胞 体外 阻碍了对该过程的深入分析以及这些研究的临床应用。为克服这一局限性，先前的研究已尝试衍生出HSCs 从头合成 通过多能干细胞（PSCs）的分化³，或通过重编程培养基诱导体细胞的可塑性及定向分化^4,5然而，这些研究尚无法生成具有临床安全性的可植入细胞，也无法用于研究确定性发育造血过程。 "在培养皿中。"

山中伸弥及其同事开创的新型工作——通过体细胞成纤维细胞生成诱导性多能干细胞（iPSCs）——为基于转录因子（TF）过表达的细胞命运重编程策略提供了框架^6,7这项工作促使多个领域的研究人员通过转录因子重编程技术，将易于获取的体细胞转化为所需的目的细胞类型。本文所述重编程策略的目标是利用基于转录因子的重编程方法，诱导小鼠体细胞发生造血生成过程，并致力于将这些发现转化为人类体系，以重编程患者特异性成纤维细胞，从而研究人类造血过程。 体外 并为疾病建模、药物测试和干细胞移植生成患者特异性的血液制品。

在此小鼠系统中确保正确重编程的第一步是构建一种报告基因小鼠品系，用于检测CD34的表达情况，CD34是内皮祖细胞和造血干....

方案

伦理声明：小鼠细胞系的制备需遵循西奈山伊坎医学院的动物护理指南，并应符合任何所在机构的相关规定。

1. C57BL/6 小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的分离

1. 设置定时交配¹³。一旦观察到阴道栓，记为第0.5天。
2. 在发现阴道栓的当天将雌鼠分离，并于第10-11天检查以确认是否怀孕。
3. 在第13.5-14.5天，通过吸入CO₂的方式对怀孕雌鼠实施安乐死，随后进行颈椎脱位。
4. 用70%乙醇浸泡怀孕雌鼠腹部，使用无菌剪刀和镊子沿腹中线切开腹腔，手术取出含有胚胎的子宫角¹⁴。在切除残余腹腔组织的同时轻柔取出胚胎。
   注意：每侧约获得4个胚胎，共约8个胚胎。
5. 将含有胚胎的子宫角放入盛有5-10 ml无菌冷磷酸盐缓冲液（PBS）的10 cm培养皿中。
6. 使用无菌剪刀和镊子沿子宫角剪开，分离出携带胚胎的胚囊。将胚囊转移至另一盛有5-10 ml无菌冷PBS的新10 cm培养皿中，并置于冰上。
7. 取部分胚囊放入另一盛有5-10 ml无菌冷PBS的10 cm培养皿中。使用无菌剪刀和镊子轻轻剪开胚囊（避免切得过深），以防刺破胚胎。
8. 剪断脐带，将胚胎与胎盘分离。
9. 将胚胎转移至另一盛有5-10 ml冷PBS的10 cm培养皿中，在完成其余解剖操作期间保持冰上放置。
10. 使用无菌镊子....

结果

造血作用是一个复杂的发育过程，起始于多个胚胎部位。这些部位中存在的生血性内皮细胞通过细胞出芽的方式产生造血干细胞（HSCs）。²³目前尚无法通过将造血干细胞（HSCs）或造血前体细胞置于体外培养来重现这一过程，因此需要一种能够以某种方式获取这些细胞的方法。 体外，通过HSPC扩增 离体 或生成 从头合成本方案展示了我们的一项新技术，该技术通过在MEFs中过表达转录因子（TF）来尝试获得这些细胞。

图1展示了整体的重编程过程。在生成并扩增小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）后，用Gata2、Gfi1b、cFos、Etv6和FUW-M2rtTA对细胞进行转导。转导后继续扩增并暴露于DOX中3天以启动外源基因表达，随后在第4天将细胞解离，并接种至明胶包被的培养板上，置于添加补充物的造血培养基中培养。

讨论

生成造血干细胞和祖细胞（HSPCs） 从头合成 从易于获取的体细胞中研究造血作用提供了一种独特的方法 体外，并有望将该技术应用于人类系统。这种转化将产生一种在体外研究人类血液系统疾病的新工具，同时为药物筛选平台和基因靶向治疗提供机会，从而利用新型疗法或造血干细胞移植治疗多种疾病。在该领域，近期研究已进一步拓展了生成造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的能力 从头合成，表明重编程过程多个特征的重要性，包括起始细胞群体和转录因子组合的选择，以及培养条件（共培养微环境）和添加物（细胞因子、小分子等）对重编程效率的显著影响^24-26多项研究正在将重编程技术应用于人类体系，且不经过多能性中间阶段，^27,28 这些过程中的一个不理想步骤。

以下是一项首次通过发育过程从体细胞生成造血干细胞样细胞（HSC-like cells）的方案，该过程避免了使用多能性因子及形成多能性中间态细胞。所生成的造血干细胞样细胞似乎经历了一个类似发育的进程，首先需要细胞经过一种类似于内皮-造血转化（EHT）的生血性内皮中间态.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Invitrogen	11965-092
0.45 μM 滤器	康宁	430625
Amicon Ultra 离心滤器	Millipore	UFC900324
青霉素/链霉素	Invitrogen	15140-122
L-谷氨酰胺	Invitrogen	25030-081
FBS	双子座基准测试	100-106
PBS	Life Technologies	14190-144
18 G 针头	BD	305195
20 G 针头	BD	305175
25 G 针头	BD	305125
I型胶原酶	Sigma	C0130-100MG
TrypLE Express	Invitrogen	12605-010
Myelocult 培养基	干细胞技术	M5300
SCF	R & D 系统	455-MC
Flt3L	R & D 系统	427-FL
IL-3	R & D 系统	403-ML
IL-6	R & D 系统	406-ML
TPO	R & D 系统	488-TO
多西环素	Sigma	D9891-1G
Polybrene（六亚甲基溴化物）	Sigma	AL-118
Durapore 0.65 μM 膜过滤器	Millipore	DVPP14250
甲基纤维素培养基	干细胞技术	Methocult M3434
氢化可的松	干细胞技术	07904
C57BL/6小鼠	杰克逊实验室	000664
明胶	Sigma	G-1890 100g
pFUW-tetO	Addgene	质粒 #20321
Gata2	OriGene	MR226728
Gfi1b	OriGene	MR204861
cFos	Addgene	质粒 #19259
Etv6	OriGene	MR207053
psPAX2	Addgene	质粒 #12260
pMD2.G	Addgene	质粒编号 #12259
CaCl2	Sigma	C5670-100g
FUW-M2rtTA	Addgene	质粒编号 #20342
35 mm x 10 mm 培养皿	赛默飞世尔科技	171099