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方法文章

用于研究新型抗癌疗法的临床前患者来源肿瘤异种移植模型的建立与维护

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DOI：

10.3791/54393

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2016年9月30日

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1Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus

本文内容

摘要

利用患者来源的肿瘤建立皮下临床前模型，是研究新型疗法疗效、预测性生物标志物发现以及耐药通路的极佳方法。在药物研发过程中，该模型对于确定多种新型抗癌疗法在进入临床研究前的命运至关重要。

摘要

患者来源的肿瘤异种移植（PDTX）模型为抗癌药物在进入人体试验前的开发提供了必要的研究平台。将人类肿瘤组织片段皮下注射到无胸腺裸鼠（免疫缺陷、T细胞缺乏）体内，可建立肿瘤库，并随后将肿瘤传代至不同代次的小鼠中，以持续保存来自患者的肿瘤。重要的是，该模型能够较好地模拟原始肿瘤的细胞异质性，从而为药物疗效研究（单药及联合用药）、生物标志物分析、耐药通路以及肿瘤干细胞生物学提供了更具临床相关性的模型。PDTX模型的一些局限性包括：在小鼠中传代第一代后，人类间质被小鼠间质所取代；由于肿瘤采用皮下注射方式，无法研究治疗对转移的影响；以及由于使用免疫缺陷小鼠，无法评估免疫疗法的效果。然而，尽管存在这些局限性，PDTX模型仍在药物发现过程中提供了一个强有力的临床前研究平台。

引言

结直肠癌（CRC）是美国癌症死亡的重要原因。2015年，估计有132,700例CRC新发病例，导致49,700例死亡1。尽管局限性疾病的患者预后良好，但晚期疾病患者的治疗效果较差，因此开发新型疗法成为当前的重要优先方向。尽管已有标准治疗方案的化疗方案以及针对该疾病的新一代生物制剂，但总体生存率仅实现逐步提高。因此，深入理解促进该疾病肿瘤生长的关键驱动通路已成为研究重点。癌症基因组图谱网络（The Cancer Genome Atlas Network）近期已鉴定出多个与CRC失调相关的主要通路，包括：WNT、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、RAS、转化生长因子-β（TGF-β）和TP532。此外，其他研究描述了可增强CRC生长的通路，这些发现共同推动了旨在显著改善该患者群体生存率的新疗法的开发3-5。在肿瘤药物研发中，利用临床前模型对于预测这些新型化合物的临床活性至关重要。

在药物开发过程中，已使用了多种临床前模型。鉴于临床前转基因动物模型和永生化细胞系在很大程度上无法反映人类肿瘤的复杂性，因而未能成功预测新型肿瘤疗法的临床疗效，研究人员已建立了患者来源肿瘤异种移植（PDTX）模型。该模型的最大优势在于肿瘤异质性得以完整保留，能够密切反映原发患者肿瘤的分子特征和克隆性 6-9PDTX 模型提供了极佳的 体内 用于研究新型药物、耐药通路、联合治疗策略及肿瘤干细胞生物学的临床前研究平台 10.

PDTX 流程的总体概述如图1所示。该过程始于临床阶段，研究人员征得患者知情同意后，将其手术中多余的肿瘤组织用于本项研究。随后，在手术过程中，病理科医生对肿瘤组织进行大体检查，并将其置于培养基中，运送至科研人员处。紧接着，将肿瘤组织切成小块，并皮下移植到免疫缺陷小鼠体内。待肿瘤生长后，将其传代至新一代小鼠中，以维持肿瘤的持续生长10。通常，在F3代之后，可将肿瘤扩增并用于治疗研究，以评估新型化合物和/或联合疗法的效果。通过应用下一代测序技术（外显子测序、RNA测序和SNP芯片），可发现潜在的预测性生物标志物，从而帮助筛选可能从特定治疗中获益的患者。

使用PDTX模型的总体目标是：1）评估新型疗法作为单药或联合用药的疗效；2）在临床研究之前识别预测药物敏感性或耐药性的生物标志物。在本文中，我们提供了建立和维持结直肠癌（CRC）PDTX库的方法，并阐述了该模型在药物研发发现中的优势与局限性。

患者来源异种移植工作流程图；肿瘤移植、扩增、治疗、生物标志物分析。
图1. 结直肠癌患者来源异种移植模型方案概述。 手术获取的患者来源肿瘤组织立即皮下接种至无胸腺裸鼠。待肿瘤生长后，将其传代扩增，并最终用于治疗研究。评估治疗反应，并鉴定可能有助于患者筛选的预测性生物标志物。请点击此处查看该图的放大版本。

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方案

伦理声明：根据科罗拉多州多个机构审查委员会（编号08-0439）批准的方案，从科罗拉多大学医院知情同意的患者处获取人源结直肠腺癌肿瘤标本。所有动物实验均依照科罗拉多大学丹佛分校机构动物护理和使用委员会（IACUC，方案编号 # 51412(06)1E 和 96813(04)1E）批准的动物实验方案进行。

1. 接收和准备患者血液

  1. 在含有柠檬酸钠的血液/细胞分离管中采集1-2 ml血液（管内分层包括血浆、淋巴细胞和单核细胞层、密度梯度液、凝胶屏障、红细胞和中性粒细胞）。注意：处理血液或组织时，须遵循血液传播病原体防护指南。
    注：PBMC 和血浆可用于未来的研究，可能包括：将种系基因变异与肿瘤突变进行比较、分离循环肿瘤细胞、评估无细胞 DNA（cfDNA）、检测蛋白质和微小 RNA（microRNAs）。 等等.
  2. 在室温下以2,500 x g离心血液/细胞分离管15分钟，离心过程中不使用刹车。
  3. 收集外周血单个核细胞（管中位于淋巴细胞和单核细胞层），转移至1.5 ml离心管（透明，可高压灭菌，无DNase、RNase和无热原），并用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）加至管顶。
    1. 在室温下以2,300 × g离心3分钟，使PBMC在管底形成沉淀。随后小心弃去上清液。加入1 ml无菌PBS洗涤沉淀，以3,000 × g离心30秒，然后弃去上清液。
  4. 使用移液器从血液/细胞分离管（管中的血浆相）中收集血浆，转移至一个1.5 ml无菌冻存管（无DNase、RNase、无人源DNA、无内毒素）中，并将血浆及PBMC沉淀物置于-80 °C冰箱中保存。

2. 接收与准备患者肿瘤样本

  1. 准备 RPMI 或 DMEM 培养基，加入 1:100（10%）的青霉素-链霉素和非必需氨基酸，1:1000（1%）的 Plasmocin，以及 10% 灭活胎牛血清（完全培养基），并将 20–25 ml 加入无菌收集杯中用于肿瘤标本。
  2. 将肿瘤样本置于含有完全培养基的无菌杯中，冰上运输或保持在 4 °C。
    注意：肿瘤样本是外科医生切除后由病理学家处理的患者多余肿瘤组织，随后放入含完全培养基的无菌收集杯中。注意遵循血液传播病原体防护指南处理血液或组织。此外，理想情况下，为注射五只小鼠，肿瘤体积应约为 1 cm³。
  3. 将肿瘤样本送至动物实验设施，用于注射免疫缺陷小鼠。
    注意：应尽快处理肿瘤样本。
    1. 在超净工作台内，将肿瘤样本从收集杯转移至无菌塑料切割皿中。使用经高压灭菌的小型剪刀和镊子将其切成 10–12 块大小约为 3 × 3 × 3 mm 的组织块，并放入已预先装有 300 µl 胶状蛋白混合液的灭菌 1.5 ml 微量离心管中。将管子置于冰上保存。
    2. 优先将肿瘤组织注射入小鼠体内；若仍有剩余，应收集速冻管（FF）、福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本杯以及一份活性肿瘤保存管。
    3. 对于速冻样本（FF），从无菌冻存管中取少量肿瘤组织，用于后续蛋白、RNA 或 DNA 提取等分析。立即将 FF 样本放入液氮杜瓦瓶中，并长期储存于 -80 °C 冰箱。
    4. 对于 FFPE 样本，若有足够肿瘤组织，取三小块放入 10 ml 10% 福尔马林溶液的样本杯中。待肿瘤在福尔马林中固定至少 24 小时后，进行石蜡包埋处理。
      注意：24 小时的固定时间依据本单位组织学核心实验室的建议11。
    5. 最后，将剩余肿瘤组织放入冻存管中。通过向完全培养基中添加 10% 二甲基亚砜（DMSO）制备活性保存培养基。随后向冻存管中加入 1 ml 该培养基，并置于冰上。注意：不宜在冰上长时间放置。
      1. 将任何剩余肿瘤切成小块，理想情况下应足够未来为 5 只小鼠注射共 10 个肿瘤样本。然后将活性肿瘤管置于冰上，直至可转移至异丙醇冷冻容器中（以每次 1°C 的速度缓慢冷冻），再放入 -80 °C 冰箱，以确保肿瘤在冷冻过程中不发生死亡。
        注意：长期储存时，应在冷冻 2–3 天后将肿瘤取出，转移至大型液氮杜瓦瓶中。请注意，活性保存管除非用于注射小鼠，否则不得允许其解冻。

3. 患者来源肿瘤异种移植的注射

  1. 每个患者来源的肿瘤使用五只6至8周龄的雄性或雌性裸鼠（T细胞缺陷型），每只小鼠皮下（SQ）注射两个肿瘤，共注射10个肿瘤。
    注意：原始人源肿瘤记为F0代，接种至小鼠体内后产生的下一代记为F1代。此外，每次进行不同的组织块移植时，应使用经高压灭菌的镊子、剪刀和套管针。
  2. 将来自凝胶状蛋白质混合溶液的肿瘤组织块装入已灭菌的12G套管针中，并确保肿瘤完全推入套管针内。
    1. 在无菌超净工作台内，将5只小鼠放入与异氟烷麻醉机相连的麻醉箱中（初始麻醉浓度为5%异氟烷、3–4%氧气，维持麻醉浓度为2–3%异氟烷），并连接活性炭过滤器（用于吸收过量气体）。
      注意：经验丰富的技术人员通常可在约5分钟内完成一笼5只小鼠的全部操作（每只约30秒），因此一般无需额外提供保温支持或眼部润滑。对于经验较少的操作者或培训期间，建议每次操作较少数量的小鼠，和/或在麻醉时间超过5分钟时使用加热垫和眼部润滑剂。本操作程序依据本校IACUC标准制定。
  3. 轻捏小鼠脚趾以确认其无反应后，将小鼠从异氟烷麻醉箱中取出。将小鼠置于清洁的操作区域，在其背部中线颈部区域进行皮下注射，并将已灭菌的12G套管针沿皮下缓慢推进至侧腹部区域。
    1. 在每只小鼠的两侧侧腹部区域各皮下注射一个肿瘤。当套管针拔出时轻轻捏住肿瘤，确保肿瘤保留在目标侧腹部区域。凝胶状蛋白质混合物在小鼠体温作用下迅速固化，可在约1周内包裹肿瘤，促进其生长并固定于皮下结缔组织。套管针造成的创口不超过4 mm，无需使用钉皮器闭合皮肤。
      注意：根据本单位兽医评估，由于创口极小、愈合迅速（背部中线颈部区域可减少皮肤张力及动物自我抓挠行为）、无感染发生，且在此期间对动物进行了密切监测，因此无需缝合或闭合创口。
  4. 在小鼠完全苏醒前，于肿瘤注射部位以外区域皮下注射美洛昔康2 mg/kg（镇痛药物）。随后将小鼠放回笼中，并持续观察直至其清醒并能自主活动。
    注意：在动物完全清醒前不得将其无人看管。美洛昔康的给药剂量依据本校IACUC标准制定。
    1. 接着，对剩余4只小鼠重复相同操作，并持续监测其呼吸状况。
      注意：请注意该操作过程非常迅速，小鼠在注射美洛昔康后很快苏醒，但可根据需要调整异氟烷浓度。每次取出小鼠时应调低异氟烷流量。美洛昔康药效可持续24小时，套管针造成的创口将在1周内完全愈合。

4. 患者来源肿瘤异种移植模型库的维护

  1. 每周至少监测一次小鼠的生长状况和健康状况。使用电子表格（或其他追踪系统）记录肿瘤大小、肿瘤成瘤情况、肿瘤接种日期以及小鼠健康状况。
    注意：若小鼠体重减轻超过原始体重的15%，体况评分较低（≥ 2），出现肿瘤溃烂，或肿瘤体积达到2,000 mm³，应予以安乐死。3 或总肿瘤体积 3,000 mm3，或出现病态（弓背、发冷、嗜睡） 等。以任何方式处死小鼠时，均通过CO₂安乐死，或先麻醉再以颈椎脱位作为辅助方法。若需采集肿瘤，则采用麻醉后颈椎脱位法处死；否则，采用CO₂安乐死后进行颈椎脱位。
  2. 当肿瘤体积约为1,500–2,000 mm³时3 按照上述方法对小鼠进行麻醉，然后实施颈椎脱位处死。
    1. 检查小鼠无心跳后，使用已灭菌的剪刀和镊子切除皮下肿瘤。
      注意：允许肿瘤生长长达1年，若未观察到肿瘤，则通过CO₂处死小鼠2随后以颈椎脱位作为辅助方法。
    2. 将生长状况最佳的肿瘤传代至下一代（又称为 一组新的5只小鼠）。按照上述说明收集10–12个肿瘤用于传代，然后按上述方法收集剩余的肿瘤组织。
      注意：在早期世代（F1 - F8）中收集大量可存活的试管非常重要；因此，每代应收集多个可存活的试管、FF试管以及1个FFPE样本。
    3. 保留剩余小鼠，直至新一代小鼠的肿瘤生长至约300 mm³3当剩余小鼠的肿瘤较大时，继续按照上述方法进行收集。
  3. 继续传代肿瘤，并在每一阶段收集样本，直至F15代。此时，从液氮中取出最早一代尚存活的肿瘤样本管，置于冰上融化，并按照上述肿瘤接种步骤进行操作。
    注意：与传代培养相比，由存活的组织块生长的肿瘤在小鼠体内生长所需时间更长，规划实验时请考虑这一因素。若在某一传代阶段不再需要特定的PDTX模型，应及时实施安乐死并采集肿瘤，以确保收集到足够数量的存活组织块供后续使用。

5. 基于患者来源肿瘤异种移植模型的发育治疗学

注意：F3 代的大多数肿瘤具有良好的生长动力学特性（生长更快且更稳定），因此可进行 PDTX 药物疗效研究。

  1. 当目标肿瘤体积较大（1,500 - 2,000 mm3）时，按照上述步骤采集肿瘤组织，扩增至所需数量的小鼠模型。
    1. 根据待验证的假设，确定每治疗组所需肿瘤数量。
      注意：1 ml 胶状蛋白质混合溶液大约可容纳 30 个小型肿瘤组织块（具体数量取决于肿瘤形态），用于注射至小鼠体内。
  2. 每周检查荷瘤小鼠，当大多数肿瘤明显较小时（约 50 - 300 mm³），使用游标卡尺测量肿瘤尺寸以计算肿瘤体积。肿瘤体积 = [宽度²（最小测量值）× 长度（最大测量值）] × 0.52。
    注意：胶状蛋白质混合溶液将在注射后包裹肿瘤组织块约一周时间，一周后肿瘤生长情况将更为准确可靠。
  3. 选取肿瘤体积在 50 - 300 mm³ 范围内的小鼠，取左右两侧肿瘤体积的平均值，随后将小鼠随机分组，每组包含 10 个肿瘤，且各组间平均肿瘤体积相差较小（数值接近）。接着，将小鼠按分组安排，并开始相应的治疗实验。
  4. 根据药物特性设定给药方案，对小鼠进行给药，并每周称重和测量肿瘤两次。实验结束时，通过麻醉结合颈椎脱臼法处死小鼠，取下肿瘤组织以供后续实验室内的药效动力学分析。
    注意：实验周期通常为 30 天，具体时长可根据对照组肿瘤大小及小鼠健康状况调整。

6. PDTX 库的组织

  1. 保留详尽的记录表格，以避免重复研究并确保动物的合理使用。
    注意：这是建立成功的患者来源肿瘤异种移植（PDTX）库的关键。
    1. 使用电子表格来追踪肿瘤从临床患者到PDTX库中实验小鼠的全过程，包括治疗方案、数据记录以及所采集的样本信息。注意：此记录也应包括冻存管、液氮杜瓦瓶和福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本的存储信息。

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结果

CRC PDTX 模型与 TCGA 中常见突变的相似性

我们研究了常见突变的比例是否（KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA、APC、CTNNB1 和 TP53在CRC PDTX库中，这些突变频率具有代表性，与CRC患者群体中的突变频率一致。如图所示 图2A （TCGA）和 B （结直肠癌PDTX库）中，这些基因的突变频率在TCGA队列（n=276例患者）与结直肠癌PDTX库（n=59例结直肠癌患者）之间非常相似。观察到的最大差异位于APC基因，差异达23%。这些结果表明，结直肠癌患者群体中常见的突变在结直肠癌PDTX模型中得到了良好代表。

不同世代间治疗反应稳定性的评估

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讨论

PDTX 药物发现平台克服了其他临床前模型在预测新化合物临床活性方面不可靠的缺陷，提供了一种更优的模型。重要的是，该模型中的肿瘤具有生物学稳定性，保留了转移潜能，并且在不同代次间表现出相似的药物反应性。在此模型中，将来源于患者的肿瘤组织接种至裸鼠体内，进行传代培养，随后用于药物疗效评估。成功建立 PDTX 肿瘤库的关键步骤包括：1）一个协作紧密的临床团队，负责筛选并获取患者知情同意，以及完成肿瘤组织的切除与初步处理；2）一个具备优秀实验室操作和动物实验技术的研究团队，负责肿瘤接种、PDTX 肿瘤库的组织与维护，以及小鼠健康状况的监测。我们 PDTX 模型的一个显著优势是采用套管针法进行肿瘤接种。另一种常用方法是切开形成肿瘤植入腔后再缝合或使用皮肤夹，该方法耗时更长，需要为小鼠使用更多镇痛药物，并需对缝合部位或伤口夹区域进行额外监测。相比之下，套管针法所需培训较少，操作迅速，小鼠处于麻醉状态的时间更短，所需镇痛药物也更少。因此，根据我们的经验，使用套管针接种肿瘤是优于其他方法的最佳选择。这些因素将显著影响 PDTX 肿瘤库的整体成功率以及药物发现过程的效率。尽管这种 in vivo 模型的成本明显高于在癌细胞系培养中进行...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由资助项目 1R01CA152303-01 支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
RPMI 或 DMEMCorning10-0040-CV
青霉素-链霉素Corning30-002-CI
非必需氨基酸Corning25-025-CI
胎牛血清Corning35-010-CV在 -4 °C 下解冻，然后在 60 °C 水浴中活化 30 分钟
CPT 血液采血管BD vacutainer362761
微量离心管SurelockA-7002
磷酸盐缓冲液Corning21-040-CV
冻存管CyrokingC0732901
塑料肿瘤切割皿TruelineTR4001
剪刀RobozRS-5881
镊子RobozRS-5135
Matrigel（胶状蛋白混合物）Corning354234储存于 -20 或 -80 °C，冰上解冻，切勿置于室温
10% 甲醛杯Protocol032-059
液氮杜瓦罐储存器ThermolyneCY50900
便携式液氮杜瓦罐Nalgene4150-2000
二甲基亚砜Fischer67-68-5
冻存容器：Mr FrostyNalgene5100-0001
异丙醇Decon64-17-5
套管针Innovative Research of AmericaMP-182
麻醉机Patterson Veterinary
麻醉箱Patterson Veterinary
异氟烷Vet one1038005
F-Air 气罐Bickford Omnicon80120
美洛昔康Vet one5182-90C
游标卡尺Fowler54-100-167
电子天平OhausScout Pro SP601

参考文献

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