利用患者来源的肿瘤建立皮下临床前模型，是研究新型疗法疗效、预测性生物标志物发现以及耐药通路的极佳方法。在药物研发过程中，该模型对于确定多种新型抗癌疗法在进入临床研究前的命运至关重要。
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摘要
摘要
患者来源的肿瘤异种移植（PDTX）模型为抗癌药物在进入人体试验前的开发提供了必要的研究平台。将人类肿瘤组织片段皮下注射到无胸腺裸鼠（免疫缺陷、T细胞缺乏）体内，可建立肿瘤库，并随后将肿瘤传代至不同代次的小鼠中，以持续保存来自患者的肿瘤。重要的是，该模型能够较好地模拟原始肿瘤的细胞异质性，从而为药物疗效研究（单药及联合用药）、生物标志物分析、耐药通路以及肿瘤干细胞生物学提供了更具临床相关性的模型。PDTX模型的一些局限性包括：在小鼠中传代第一代后，人类间质被小鼠间质所取代；由于肿瘤采用皮下注射方式，无法研究治疗对转移的影响；以及由于使用免疫缺陷小鼠，无法评估免疫疗法的效果。然而，尽管存在这些局限性，PDTX模型仍在药物发现过程中提供了一个强有力的临床前研究平台。
引言
结直肠癌（CRC）是美国癌症死亡的重要原因。2015年，估计有132,700例CRC新发病例，导致49,700例死亡1。尽管局限性疾病的患者预后良好，但晚期疾病患者的治疗效果较差，因此开发新型疗法成为当前的重要优先方向。尽管已有标准治疗方案的化疗方案以及针对该疾病的新一代生物制剂，但总体生存率仅实现逐步提高。因此，深入理解促进该疾病肿瘤生长的关键驱动通路已成为研究重点。癌症基因组图谱网络（The Cancer Genome Atlas Network）近期已鉴定出多个与CRC失调相关的主要通路，包括：WNT、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、RAS、转化生长因子-β（TGF-β）和TP532。此外，其他研究描述了可增强CRC生长的通路，这些发现共同推动了旨在显著改善该患者群体生存率的新疗法的开发3-5。在肿瘤药物研发中，利用临床前模型对于预测这些新型化合物的临床活性至关重要。
在药物开发过程中，已使用了多种临床前模型。鉴于临床前转基因动物模型和永生化细胞系在很大程度上无法反映人类肿瘤的复杂性，因而未能成功预测新型肿瘤疗法的临床疗效，研究人员已建立了患者来源肿瘤异种移植（PDTX）模型。该模型的最大优势在于肿瘤异质性得以完整保留，能够密切反映原发患者肿瘤的分子特征和克隆性 6-9PDTX 模型提供了极佳的 体内 用于研究新型药物、耐药通路、联合治疗策略及肿瘤干细胞生物学的临床....
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方案
伦理声明：根据科罗拉多州多个机构审查委员会（编号08-0439）批准的方案，从科罗拉多大学医院知情同意的患者处获取人源结直肠腺癌肿瘤标本。所有动物实验均依照科罗拉多大学丹佛分校机构动物护理和使用委员会（IACUC，方案编号 # 51412(06)1E 和 96813(04)1E）批准的动物实验方案进行。
1. 接收和准备患者血液
- 在含有柠檬酸钠的血液/细胞分离管中采集1-2 ml血液（管内分层包括血浆、淋巴细胞和单核细胞层、密度梯度液、凝胶屏障、红细胞和中性粒细胞）。注意：处理血液或组织时，须遵循血液传播病原体防护指南。
注：PBMC 和血浆可用于未来的研究，可能包括：将种系基因变异与肿瘤突变进行比较、分离循环肿瘤细胞、评估无细胞 DNA（cfDNA）、检测蛋白质和微小 RNA（microRNAs）。 等等. - 在室温下以2,500 x g离心血液/细胞分离管15分钟，离心过程中不使用刹车。
- 收集外周血单个核细胞（管中位于淋巴细胞和单核细胞层），转移至1.5 ml离心管（透明，可高压灭菌，无DNase、RNase和无热原），并用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）加至管顶。
- 在室温下以2,300 × g离心3分钟，使PBMC在管底形成沉淀。随后小心弃去上清液。加入1 ml无菌PBS洗涤沉淀，以3,000 × g离心30秒，然后弃去上清液。
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结果
CRC PDTX 模型与 TCGA 中常见突变的相似性
我们研究了常见突变的比例是否（KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA、APC、CTNNB1 和 TP53在CRC PDTX库中，这些突变频率具有代表性，与CRC患者群体中的突变频率一致。如图所示 图2A （TCGA）和 B （结直肠癌PDTX库）中，这些基因的突变频率在TCGA队列（n=276例患者）与结直肠癌PDTX库（n=59例结直肠癌患者）之间非常相似。观察到的最大差异位于APC基因，差异达23%。这些结果表明，结直肠癌患者群体中常见的突变在结直肠癌PDTX模型中得到了良好代表。
不同世代间治疗反应稳定性的评估
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讨论
PDTX 药物发现平台克服了其他临床前模型在预测新化合物临床活性方面不可靠的缺陷，提供了一种更优的模型。重要的是，该模型中的肿瘤具有生物学稳定性，保留了转移潜能，并且在不同代次间表现出相似的药物反应性。在此模型中，将来源于患者的肿瘤组织接种至裸鼠体内，进行传代培养，随后用于药物疗效评估。成功建立 PDTX 肿瘤库的关键步骤包括：1）一个协作紧密的临床团队，负责筛选并获取患者知情同意，以及完成肿瘤组织的切除与初步处理；2）一个具备优秀实验室操作和动物实验技术的研究团队，负责肿瘤接种、PDTX 肿瘤库的组织与维护，以及小鼠健康状况的监测。我们 PDTX 模型的一个显著优势是采用套管针法进行肿瘤接种。另一种常用方法是切开形成肿瘤植入腔后再缝合或使用皮肤夹，该方法耗时更长，需要为小鼠使用更多镇痛药物，并需对缝合部位或伤口夹区域进行额外监测。相比之下，套管针法所需培训较少，操作迅速，小鼠处于麻醉状态的时间更短，所需镇痛药物也更少。因此，根据我们的经验，使用套管针接种肿瘤是优于其他方法的最佳选择。这些因素将显著影响 PDTX 肿瘤库的整体成功率以及药物发现过程的效率。尽管这种 in vivo 模型的成本明显高于在癌细胞系培养中进行.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由资助项目 1R01CA152303-01 支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RPMI 或 DMEM | Corning | 10-0040-CV | |
| 青霉素-链霉素 | Corning | 30-002-CI | |
| 非必需氨基酸 | Corning | 25-025-CI | |
| 胎牛血清 | Corning | 35-010-CV | 在 -4 °C 下解冻，然后在 60 °C 水浴中活化 30 分钟 |
| CPT 血液采血管 | BD vacutainer | 362761 | |
| 微量离心管 | Surelock | A-7002 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Corning | 21-040-CV | |
| 冻存管 | Cyroking | C0732901 | |
| 塑料肿瘤切割皿 | Trueline | TR4001 | |
| 剪刀 | Roboz | RS-5881 | |
| 镊子 | Roboz | RS-5135 | |
| Matrigel（胶状蛋白混合物） | Corning | 354234 | 储存于 -20 或 -80 °C，冰上解冻，切勿置于室温 |
| 10% 甲醛杯 | Protocol | 032-059 | |
| 液氮杜瓦罐储存器 | Thermolyne | CY50900 | |
| 便携式液氮杜瓦罐 | Nalgene | 4150-2000 | |
| 二甲基亚砜 | Fischer | 67-68-5 | |
| 冻存容器：Mr Frosty | Nalgene | 5100-0001 | |
| 异丙醇 | Decon | 64-17-5 | |
| 套管针 | Innovative Research of America | MP-182 | |
| 麻醉机 | Patterson Veterinary | ||
| 麻醉箱 | Patterson Veterinary | ||
| 异氟烷 | Vet one | 1038005 | |
| F-Air 气罐 | Bickford Omnicon | 80120 | |
| 美洛昔康 | Vet one | 5182-90C | |
| 游标卡尺 | Fowler | 54-100-167 | |
| 电子天平 | Ohaus | Scout Pro SP601 |
参考文献
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. 2015. CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
- Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer. Nature. 487 (7407), 330-337 (2012).
- Arcaroli, J. J., et al.
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