方法文章

设计微流体装置用于研究细胞反应在单人或共存化工/电气/剪切应力刺激

DOI：

10.3791/54397

⸱

2016年8月13日

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1Department of Agricultural Chemistry, National Taiwan University, 2Department of Physics, Fu-Jen Catholic University, 3Research Center for Applied Sciences, Academia Sinica

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

与流体组件集成的微制造设备为模拟体内微环境的细胞研究提供了一个体外平台。我们开发了基于聚甲基丙烯酸甲酯的微流体芯片，用于研究单个或共存化学/电/剪切应力刺激下的细胞反应。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

微流体设备能够创建pH值，温度，盐浓度，和其它物理或化学刺激的精确和可控的细胞微环境。他们已经通过像环境在体内提供了通常用于体外细胞研究。尤其，细胞如何响应于化学梯度，电场，应力和剪应力引起了许多利益，因为这些现象对理解细胞特性和功能非常重要。这些微流体芯片可以由玻璃基板，硅晶片，聚二甲基硅氧烷（PDMS）聚合物，聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）基片，或聚对苯二甲酸乙酯（PET）衬底。出这些材料，PMMA基底是便宜的，并且可以使用激光烧蚀和书写容易加工。虽然一些微流体装置已被设计和制造用于产生多个共存化学和电刺激，其中没有一个被认为是够在减少实验重复序列，特别是用于筛选目的有效。在这份报告中，我们描述了我们的两个基于PMMA微流控芯片设计和制造用于研究细胞反应，在生产活性氧和迁移，下单或共存化学/电气/剪切应力刺激。第一芯片产生五个相对浓度0，1/8，1/2，7/8，和1在培养的区域，与内部这些领域中产生的剪切应力梯度在一起。第二芯片产生相同的相对浓度，但与各培养区中创建的五个不同的电场强度。这些装置不仅提供细胞与精确，可控的微环境，也大大增加了实验的吞吐量。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

体内细胞通过各种生物分子，包括细胞外基质（ECM），碳水化合物，脂质，细胞和其它细胞的包围。它们官能通过响应微环境刺激如使用ECM相互作用和反应的各种生长因子的化学梯度。传统上， 在体外细胞研究是在细胞培养皿进行，其中细胞和试剂的消耗大，细胞生长在静态（非循环）环境。最近，随着流体部件集成的微制造的器件中的更可控的方式提供了用于细胞的研究的替代的平台。这样的装置能够同时最大限度地减少细胞和试剂的消耗产生的化学和物理刺激的精确微环境。这些微流体芯片可以由玻璃基板，硅晶片，聚二甲基硅氧烷（PDMS）聚合物，聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）基片，或polyethylenetere邻苯二甲酸酯（PET）的基板1-3。基于PDMS的设备是透明的，生物相容的，并能透过气体，使它们适合于长期的细胞培养和研究。 PMMA和PET基材是廉价和易于使用激光烧蚀和写作进行处理。

微流体装置应提供细胞与稳定可控的微环境，其中细胞受到不同的化学和物理刺激。例如，微流体芯片被用来研究细胞的趋化性。而不是雇用Boyden小室和毛细管4,5这些微型流体装置能产生精确的化学梯度用于研究细胞的行为1,6,7传统的方法。另一例子是研究细胞的下电场功率（EFs），一个electrotaxis现象名为定向迁移。据报道细胞Electrotactic行为可能与神经再生8，胚胎发育9和伤口愈合10,11。许多研究已经进行了调查各种细胞类型，包括癌细胞12,13的electrotaxis，淋巴细胞14,15，白血病细胞11，和干细胞16。按照惯例，培养皿和盖玻片用于构建electrotactic室产生的EF 17。这种简单的设置姿势介质蒸发和不精确EF的问题，但是它们可以通过封闭的，明确定义的流体通道12,18,19的微流体装置来克服。

为了系统地研究下精确，可控化学和电刺激细胞的反应，这将是很有用处的发展能够同时提供多个刺激细胞的微流体装置。例如，Li 等人 。报告基于​​PDMS-微流体装置，用于创建单个或共存化学梯度和EFS 20。 Kao 等 。开发私奔类似微流体芯片由EF文件6调节肺癌细胞的趋化性。此外，为了提高吞吐量，侯等人 。设计和制作基于PMMA-多声道的双电场芯片，提供细胞与8种不同组合的刺激，是（2 EF优势×4化学物浓度）21。为了进一步增加整个并添加剪切应力刺激，我们开发了两个PMMA基微流体装置根据单个或共存化学/电/剪切应力刺激研究细胞应答。

由Lo 等 22,23报道，这些设备包括五个独立的细胞培养渠道受到持续流体流动，模仿体内循环系统。在第一芯片（化学剪切应力芯片或CSS的芯片），五个相对浓度为0，1/8，1/2，7/8，和1在培养区域生成，并剪切应力梯度是机生产线土木工程署内各五个文化领域。在第二芯片（该化学电场芯片或CEF芯片），通过使用一个单组电极和第2注射泵中，除了这些培养区域内五个不同的化学浓度时，产生五个EF强度。数值计算和模拟执行，以便更好地设计和操作这些芯片，而这些设备内培养肺癌细胞受到单个或共存刺激用于相对于观察到的活性氧物种的它们的响应（ROS），迁移率，和运移方向。这些芯片被证明是节省时间，高吞吐量和可靠的器件用于研究细胞对各种微环境刺激的反应。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.芯片设计和制造

  1. 绘制图案被使用商业软件24的PMMA基板和双面胶带消融。
    1. 研究化学浓度和剪切应力的影响，在其每五个培养区（ 图1A和1B）的端绘制具有变化宽度的"圣诞树"的图案。
    2. 研究化学浓度和电场的影响，绘制了"圣诞树"的图案为盐桥两个流体通道（ 图2A和2B）。
  2. 划线上的聚甲基丙烯酸甲酯片材或通过加载相应文件到的 CO 2激光划线双面胶带单个图案。
    1. 打开激光划片机，并检查其与电脑连接。打开模式使用商业软件进行消融。
    2. 将有机玻璃片或双面胶带Ø■首页划片的舞台。如有必要，使用校准杆和可见的He-Ne激光调节的 CO 2激光的焦点。
    3. 加载模式进入划片上PMMA板材或带消融。
    4. 拿起图案片或胶带，删除不需要的部分，并清洗用氮气吹面。
      注:聚甲基丙烯酸甲酯片的厚度为1毫米，并且该双面胶带为0.07毫米或0.22毫米。

2.芯片组装

  1. 与超级胶水，通过对准螺纹和孔在顶部附丙烯酸适配器（长度×宽度×高度= 10毫米×10毫米×5毫米，在中间螺纹）连接到最顶层的芯片 - 大多数层。这些适配器作为介质入口/出口和盐桥连接器。
  2. 组装层流罩内的微流体芯片。
  3. 组装化学剪切应力的微流体芯片（CSS芯片）。
    1. 一个ttach使用2个刻划双面胶带的划线的PMMA片3张。 （ 图1A和1B）。
    2. 多一个片0.07毫米厚的双面胶添加到芯片的底部和芯片连接到一个直径10厘米的培养皿。
    3. 把组件芯片在真空室中过夜。
  4. 为了组装化学电场芯片（CEF芯片），聚甲基丙烯酸甲酯片附着到厚的双面胶带= 0.22毫米（ 图2A和2B）。
    1. 附加划线PMMA板和双面胶带，使用此相同的片带的直径10厘米的培养皿。
  5. 离开罩内组装芯片和其暴露在紫外线下消毒30分钟。
  6. 通过塑料管，并用手指拧紧螺母连接入口，以两个3毫升的注射器。通过塑料管和一个手指拧紧螺母连接插座到废液管。
    注:蒸压对于使用前15分钟所有的管子和螺母在121℃。
  7. 慢慢地压低在注射器素用PBS流体通道的柱塞。推注射器来回去除气泡。
  8. 把芯片培养箱内过夜，在37℃下，5％CO 2。
    注意:这两个步骤的目的是在芯片内洗芯片和除去任何剩余的气泡。
  9. 就拿芯片出来的孵化器。
  10. 准备琼脂盐桥在CEF芯片产生的电场。
    1. 溶解使用微波在1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）缓冲液3％低熔点琼脂糖。
    2. 注射液分阶段琼脂糖放入盐桥通道和插入电极液凝固之前。
    3. 放置银/氯化银电极到管状螺母。
  11. 注射器连接到注射泵，不断流动的培养基（Dulbecco改进的EagleR17;培养基，DMEM）中成20微升的流速为10分钟的流体通道/分钟更换PBS中。

3.细胞制备及实验装置

注意:预暖1×PBS中，培养培养基（DMEM加FBS）和胰蛋白酶在使用前37℃水浴中。

  1. 板2×10 5个肺癌CL1-5细胞25,26中用DMEM加10％胎牛血清（FBS）的供给的10cm培养皿。孵育培养箱内的细胞在5％ 的 CO 2，在37℃直至90％汇合。
  2. 吸出培养基并用预热1×PBS中洗一次细胞。 2毫升0.05％胰蛋白酶缓冲液添加至细胞中并等待2至3分钟，在37℃下分离的细胞。
  3. 转移细胞到15毫升的无菌离心管中，加6 ml培养介质的进入管。轻轻颠倒试管混合并取出5微升含细胞培养基用于在hemocytomete计数细胞数河
  4. 离心300×管 克5分钟。暂停10 6个细胞于1ml培养基中，然后将含有细胞的培养基中，在1毫升注射器。
  5. 注入含有细胞的介质进入从出口的微流控芯片，并确保该溶液通过五个培养区域分配的所有。孵育培养箱内的芯片下，5％CO 2在37℃下2小时。

4.实验装置

  1. 取芯片出保育箱，将其放在一个透明的氧化铟锡（ITO）的玻璃加热器的顶部。
    注:ITO玻璃被连接到比例 - 积分 - 微分（PID）控制器，用于通过反馈从热耦合器37±0.5℃，将温度保持在ITO加热器和芯片之间紧紧夹住。
  2. 把芯片加热器组件上倒置显微镜的电动XY载物台的顶部，用于跟踪细胞迁移或固定XY台倒置荧光显微镜测定ROS的产生。
  3. 产生不同的化学物质浓度，填充两个注射器用5ml相对浓度0和1（溶解于培养基中）的化学溶液和它们泵入芯片在所需流率:在CSS芯片，以0.3ml的流速/分钟1小时;在CEF芯片，以20微升/分钟的流速在第20分钟，20微升/小时的另一个120分钟（总时间= 2小时）的流速。
  4. 在CEF芯片，用于跟踪细胞迁移，程序显微镜的XY阶段重复拍照，通过数字单镜头反光文化领域，每15分钟2内（视场）的意见某个字段（DSLR）相机，小时。
  5. 为了测量产生活性氧的，使用基于荧光的指示器2'- -7'- dichlorodihydrofluoresce二乙酸酯（2'- 7'- DCFDA）。
    1. 准备2'-7'- DCFDA的股票在10毫米分子生物学级迪甲基亚砜（DMSO）中。稀DCFDA在DMEM只无血清（5微米的DMEM）。潜在的脱乙酰酶可以增加背景信号，并在细胞减少的信号。
    2. 在CSS芯片或之后的CEF的芯片的EF刺激的2小时的剪切应力刺激1小时后，泵2'- -7'- DCFDA（5μM在DMEM）到芯片在20μL/分钟的流速为前20分钟和20微升/小时的另外20分钟的流速。用于洗涤，泵的DMEM到芯片在20微升/小时的流速进行20分钟。
    3. 拍照，通过电荷耦合器件（CCD）照相机，培养区域内的某些视场的，用于分析荧光强度。

5.化学品浓度，剪切应力和电场的计算

  1. 在这两个CSS芯片和芯片CEF，计算在五个养殖区域的化学浓度。例如，通过注入精矿的H 2 O 2的ations 0并从两个入口200μM，0，25，则产生100，175和200μM的浓度。
    注意:通过假定所有的液体分流顺畅，同样左右叉，相对浓度中的五个培养区域分别是0，1/8，1/2，7/8和1。
  2. 在CSS芯片，采用在每个培养区域的计算的剪切应力（τ） figure-protocol-1 27，其中Q是体积流量，η是流体粘度，h是信道的高度，w是所述信道的宽度。
    注:通过设定Q = 0.3ml /分钟在每个入口（Q f = 0.12毫升/分钟在各培养区） 中，η= 0.0008帕·秒为培养基中，h = 1毫米，以及w = 1〜4毫米，在剪切应力的计算从0.0048帕（4毫米宽的区域），以0.0192帕（1毫米宽的区域）范围内。
  3. 在在CEF芯片，计算EF强度中的每个使用E = I /（σAEFF）（欧姆定律），其中I是穿过流体通道中流动的电流的文化区域，σ是培养基的电导率，和A eff是信道的有效横截面面积。
    注意:使用σ= 1.38Ω-1 M -1为培养基和A EFF = 0.22毫米2（宽= 1毫米，高度= 0.22毫米）时，EF强度计算为E（毫伏/毫米）= I（ A）×3.3×10 6。
    1. 如图2D所示，治疗的等效电路五C形截面电路用四个（8 + 35 + 8）段和一个（5 + 35 + 5）段。
      注:通过分析，根据基尔霍夫电压定律和欧姆定律这一并联电路，在五个文化流动的电流如，I 1到I 5从底部到顶部，被计算为围绕0.49 I（区域1），0.25 I（区域2），0.13 I（区域3），0.08 I（区域4），和0.05 我 （区5），分别，其中I是总的直流（dc）。与0.157毫安，254的EF，130，67，41，和26毫伏/毫米的施加直流被五个培养领域内产生。
      注:对于微流体网络的简化电分析中，所有的流体段被认为是与电阻正比于其长度电阻。

6.数据分析

注意:使用ImageJ的软件进行数据分析。

  1. 分析ROS的生产。
    1. 运行该软件的ImageJ。进入"文件"→打开加载一个荧光图像进行分析。
    2. 转到"图像"→"类型"→"16位"改变了IM年龄为灰度。
    3. 绘制多边形附上一个单元格。去"分析"→"测量"来测量细胞的平均荧光强度。
    4. 重复6.1.3从三个独立实验的至少50个细胞收集强度，并计算与平均值的标准误差（SEM）的平均强度。
    5. 重复6.1.1-6.1.4每个实验条件。
  2. 分析细胞迁移。
    1. 运行该软件的ImageJ。进入"文件"→打开加载时间= 0时拍摄的图像进行分析。
    2. 绘制多边形附上一个单元格。去"分析"→"测量"，测量细胞的质量中心为（x 1，Y 1）。
    3. 重复6.2.1- 6.2.2测量相同的小区的质量的其它图像的中心为（X 2，Y 2）取在时间= 吨 。
    4. 计算的迁移速率（以微米/小时）该小区作为figure-protocol-2 。
    5. 重复6.2.1-6.2.4收集来自三个独立实验的至少50个细胞的迁移率，并计算与平均值的标准误差（SEM）的平均迁移率。
    6. 从6.2.2和6.2.3，计算该细胞的迁移指向性余弦或θ figure-protocol-3 ，其中θ是施加的EF的矢量之间，并从开始到小区（ 图2G）的端部位置的矢量的角度（从正到负）。
    7. 重复6.2.6从三个独立实验的至少50个细胞收集迁移指向性，并计算与平均值的标准误差（SEM）的平均迁移指向性。
    8. 计算用SEM的平均迁移率和用SEM的平均迁移指向性为每个实验条件。
      注:指向性+1表示所有细胞向阴极迁移，和-1值表示所有单元向阳极迁移。一组随机移动的细胞的指向性是接近0。
  3. 分析单元格对齐。
    1. 运行该软件的ImageJ。进入"文件"→"打开"加载图像进行分析。
    2. 治疗细胞为椭圆和画一条线，以指示一个单元的长轴线。转到"分析"→"办法"来衡量β线和水平EF方向之间的角度。
    3. 重复6.3.2从三个独立实验的至少50个细胞收集β，计算平均余弦β与（SEM）平均值的标准误差。
    4. 重复6.3.1-6.3.3每个实验条件。
      注:余弦为+1β表示所有的细胞在平行于所施加的EF对齐，和一个0值指示所有单元对齐perpendicularly以施加EF。

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结果

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化学 - 剪切应力（CSS）芯片

CSS的芯片进行了三次PMMA板，每个的厚度为1毫米，经由两个双面胶带连接在一起，每一个的厚度0.07毫米（ 图1A和1B）的。的"圣诞树"结构产生的0 5相对浓度，1/8，1/2，7/8和1中的五个培养领域。由培养面积设计为三角形，剪切应力梯度，与相关的体积流速，流体粘度和流体通道的尺寸大小，则在每个区域的创建。然后，该芯片被安装，经由另一0.07毫米厚双面胶带，至培养皿培养肺癌CL1-5细胞以及响应于不同的化学浓度和剪切应力，观察到产生活性氧的。在肺癌细胞中ROS的产生是高度相关的路NG癌细胞转移和发展，以及某些化学品和剪切应力被证明参与ROS的产生23。

首先，要研究的H 2 O <...

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讨论

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PMMA基芯片使用激光烧蚀和写入与基于PDMS芯片，从而需要更复杂的软光刻当它们是便宜和更容易的方法制造。设计的微流体芯片之后，在制造和装配可以只在5分钟内完成。有迹象表明，应注意在执行实验中支付给一些关键的步骤。首先是"组装"的问题。适配器应适当粘在最上面的层的芯片。如果施加太大胶可能泄漏进入流体通道，并且如果使用太少的胶液可能泄漏出来的芯片。另外，在组装的PMMA基板和双面胶带，其将压力施加到压紧整个芯片，以防止任何液体泄漏是很重要的。第二个是"泡沫"的问题。以除去气泡，1×PBS中连续流入1或2分钟的流体通道以20微升/分钟的流速，然后在芯片为p在37℃下被系带培养箱内过夜，5％ 的 CO 2。如果在流体通道内剩余的气泡，该流程将是不均匀的，导致不均匀的化学浓度和EF分布。第三个是"小区负载"的问题。装入培养区域的细胞的数量应被很好地控制。如果细胞数量太少，不少实验运行应当进行收集足够的数据作统计用途。如果细胞数太高，这将是很难区分各个单元和量化其迁移。

在CSS芯片，"圣诞树"结构具有三角形培养面积的总和在五个方面产生不同的化学...

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作由台湾科学技术部根据合同编号提供财政支持。MOST 104-2311-B-002-026 （K. Y. Lo）， 编号MOST 104-2112-M-030-002 （孙玉祥） 和国立台湾大学职业发展计划 （103R7888） （K. Y. Lo）。作者还感谢国立台湾大学新兴材料与先进器件中心对细胞培养室的使用。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM）Gibco11965-092细胞培养基
胰蛋白酶Gibco25300-054从培养皿中分离细胞
胎牛血清 （FBS）Gibco10082147细胞培养基
10 cm 细胞培养培养皿Nunc150350细胞培养
Bright-Line 血细胞计数器SigmaZ359629细胞计数设备
PMMA定制定制流控芯片
适配器定制定制微流控芯片
0.07/0.22 mm 双面胶带 3M8018/9088微流控芯片
低熔点琼脂糖SigmaA9414盐桥
2'-7'-二氯二氢荧光二乙酸SigmaD6883细胞内 ROS 测量
氧化铟锡 （ITO） 玻璃默克300739加热器
比例-积分-微分控制器 捷泰电子有限公司TTM-J4-R-AB温度控制器
热耦合器TECPELTPK-02A温度控制器
CO2 激光划线器激光工具和Technics 公司ILS2微流控芯片制造
注射泵New EraNE-300将介质和化学品泵入芯片
电源主要科学 MP-300V提供直流
倒置显微镜奥林巴斯CKX41监测细胞迁移
倒置荧光显微镜尼康TS-100监测细胞迁移和荧光信号
数码单反相机佳能60D记录明场图像 
CCD 相机尼康DS-Qi1录制荧光图像 
强力胶3M Scotch7004将适配器连接到 PMMA 基材
AutoCADAutodesk Inc.设计微流控芯片
DMSOSigmaD8418溶解 DCFDA
ImageJ美国国立卫生量化荧光强度和细胞迁移
微酯 电 研究院

参考文献

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