RGD功能化水凝胶的合成及其在治疗应用中的工具作用

摘要

我们介绍一种用于细胞和药物递送装置的RGD功能化水凝胶的合成方案。该方法涉及炔基修饰的聚丙烯酸（PAA）与RGD-叠氮衍生物之间通过铜催化炔-叠氮环加成反应（CuAAC）进行反应。水凝胶通过微波辅助缩聚反应形成，并对其理化性质进行研究。

摘要

聚合物作为生物材料的使用在治疗应用中提供了显著优势。特别是，通过修饰和功能化聚合物链，引入能够改善生物相容性、机械性能或细胞活力的化合物，使得设计出应对生物医学领域新挑战的新型材料成为可能。在聚合物功能化策略中，点击化学是一种强大的工具，可提高聚合物器件的细胞相容性和药物递送性能。同样，生物医学领域对使用无菌工具的基本需求，以避免潜在的不良副作用（如毒性或生物环境的污染），促使人们对微波辅助策略的兴趣日益增加。

点击化学与微波辅助方法相结合，适用于制备具有理想功能性和更优性能的生物相容性水凝胶，可用于生物医学领域。本研究旨在合成RGD功能化的水凝胶。RGD（精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸）是一种三肽，可模拟细胞黏附蛋白并结合细胞表面受体，从而在水凝胶的三维聚合物网络内为细胞创造有利的微环境。RGD的功能化通过Huisgen 1,3-偶极环加成反应实现。部分聚丙烯酸（PAA）的羧基被修饰为炔基，而RGD肽序列的末端残基则被修饰为叠氮酸。最后，将上述两种产物用于铜催化的点击反应，使肽段永久连接至PAA。该改性聚合物与卡波姆、琼脂糖和聚乙二醇（PEG）共同用于合成水凝胶基质。三维结构的形成源于微波辅助聚缩合反应，其中PAA和卡波姆的羧基与琼脂糖和PEG的羟基之间发生酯化反应。该凝胶化机制的高效性确保了RGD的高程度功能化。此外，在此功能化网络中载入治疗性化合物或生物工具的操作过程极为简便且可重复。

引言

水凝胶是由亲水性交联聚合物形成的三维网络结构，这些聚合物可以是天然的或合成的，并具有独特的三维结构特征。这类材料在药物递送、组织工程、基因载体和智能传感器等生物医学领域中日益受到关注^1,2。事实上，由于其高含水量以及流变学和机械性能，水凝胶能够模拟软组织的微环境，成为递送水溶性细胞因子或生长因子的有效工具。其中最具前景的应用之一是作为可注射的生物材料，用于携带细胞和生物活性化合物。水凝胶可通过稳定并精确递送干细胞调控信号，以生理相关的方式调控干细胞命运并提高细胞存活率，这一点已在体外（in vitro）和体内（in vivo）实验中得到证实^3,4。其主要优势在于能够将注射的细胞保留在接种区域（原位，in situ），最大限度减少细胞从目标区域流失并进入血液循环系统，从而避免细胞在体内广泛迁移而失去治疗靶向性⁵。三维水凝胶网络的稳定性依赖于其交联位点，这些交联结构由聚合物链之间的共价键或内聚力形成⁶。

在此框架中，应用于聚合物链的正交选择性化学是一种多功能工具，能够提升水凝胶的性能⁷。事实上，通过引入合适的化学基团对聚合物进行修饰，可赋予其适当的化学、物理和力学性能，从而提高细胞存活率，并促进其在组织形成中的应用。同样，在将细胞或生长因子载入凝胶基质的技术中，使用RGD肽可显著改善细胞的黏附性与存活率。RGD是一种由....

方案

注意：化学品直接使用，无需进一步处理。线性 RGD 可购买获得，也可通过标准的 Fmoc 固相肽合成法制备^16,19。溶剂均为分析纯级别。透析过程需使用截留分子量（M_w）为 3,500 Da 的透析膜。所合成的化合物通过 400 MHz 核磁共振波谱仪测定 ¹H NMR 谱进行表征，溶剂为氯仿（CDCl₃）或重水（D₂O），化学位移以 δ 值表示，单位为百万分之一（ppm）。此外，水凝胶采用 KBr 压片法进行傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析；其物理表征包括在 37 °C 下通过倒置试管法评估凝胶化行为。

1. 4-叠氮丁酰氯 1 的合成

1. 将500 mg的4-叠氮丁酸（3.90 mmol）溶于10 ml二氯甲烷和0.5 ml二甲基甲酰胺中。
2. 使用冰浴将溶液冷却至0 °C。
3. 将505 µl草酰氯（5.85 mmol）加入5 ml二氯甲烷中，然后在搅拌下缓慢滴加至反应体系中。
4. 在冰浴条件下于0 °C反应1小时后，恢复至室温。
5. 使用旋转蒸发仪在减压条件下除去溶剂。
6. 通过¹H-NMR波谱法对所得产物进行表征，将样品溶于CDCl₃¹⁶中。

结果

聚丙烯酸炔烃衍生物由聚丙烯酸与丙炔胺高效合成，如图1所示，其中n标记了其羧基与胺发生反应的单体。产物的结构通过¹H-NMR波谱法确认。图5展示了带有三键修饰的PAA的¹H-NMR谱图。

图 5： ¹H-NMR 谱图：PAA 修饰的炔烃。 与炔基部分相关的信号已被标出。

讨论

PAA 通过炔基进行聚合后修饰，并利用叠氮基团对 RGD 进行功能化，从而确保聚合物与多肽之间形成稳定的化学键。实际上，三唑环的1,4位连接碳原子，作为刚性连接单元存在于两者之间，且该结构无法通过水解或其他方式断裂。此外，与其他环状结构（如苯系物及相关芳香杂环）不同，三唑极难被氧化或还原²⁴。因此，在水凝胶合成的实验条件下，PAA-RGD 产物的化学不稳定性几乎可以忽略。由于化学键的本质，该多肽被共价接枝至三维聚合物网络中，而非物理包埋（因此不会从体系中释放）。

在水溶液中，使用丙炔胺在EDC和HOBt存在下制备炔基化PAA，以获得胺衍生物。实验结果表明，三键与PAA连接的百分比与所用胺的量成正比。根据核磁共振（NMR）分析，当PAA与丙炔胺的摩尔比为1:1时，聚合物的功能化程度在90%至100%之间；当摩尔比为1:0.5时，功能化程度约为50%。由于凝胶网络的形成涉及酯化反应，因此有必要保留部分PAA羧基，使其能够与PEG和琼脂糖的羟基发生反应。将一半PAA羧基进行修饰即可满足此要求，但当聚合物功能化程度为10%（PAA与丙炔胺的分子比为1:0.1）时，可获.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚丙烯酸溶液，平均 Mw ~100,000，H2O 中 35 wt%	Sigma Aldrich	523925	CAS 9003-01-4
聚乙二醇 2,000	Sigma Aldrich	84797	CAS 25322-68-3
卡波姆 974P	Fagron	1387083
琼脂糖	Invitrogen Corp.	16500-500	UltraPure 琼脂糖
RGD 肽	abcam	ab142698
4-叠氮丁酸	Aurum Pharmatech	Z-2421	CAS 54447-68-6
草酰氯	Sigma Aldrich	O8801	CAS 79-37-8
丙炔胺盐酸盐，95%	Sigma Aldrich	P50919	CAS 15430-52-1
碘化亚铜	Sigma Aldrich	3140	CAS 7681-65-4
抗坏血酸钠	Sigma Aldrich	Y0000039	CAS 134-03-2
磷酸盐缓冲液	Sigma Aldrich	P4417
透析膜	Spectrum Laboratories, Inc.	132725	Spectra/Por 3 透析膜  标准再生纤维素管 截留分子量：3.5 kD