小鼠腹腔粘连模型的建立

摘要

术后形成的腹部粘连是导致疼痛、不孕以及因小肠梗阻而需要住院和再次手术的主要原因。我们建立小鼠腹部粘连的手术方法是一种可靠的研究粘连形成机制的工具。

摘要

腹腔粘连是由纤维组织构成的，通常在腹膜腔内因炎症刺激（如手术或腹腔内感染）而形成。目前对粘连形成的精确机制尚不完全清楚。已有多种化合物和物理屏障被用于预防术后粘连，其效果各不相同。小鼠和大鼠是研究腹腔粘连的重要动物模型。文献中已报道了多种在小鼠和大鼠中诱导粘连形成的技术。本文描述了一种通过砂纸摩擦盲肠并在右侧腹壁腹膜上缝合缝线来诱导粘连的实验方案。首先对小鼠实施麻醉并进行腹部消毒准备，然后沿腹中线做剖腹切口，暴露并识别盲肠。用砂纸轻轻摩擦盲肠表面造成损伤，随后在右侧腹壁的腹膜上放置数个“8”字缝合线。之后用生理盐水冲洗腹腔，撒入少量淀粉，最后关闭切口。我们发现，该技术能够产生最稳定的粘连，且动物死亡率最低。

引言

腹腔粘连是一种在腹腔内形成的瘢痕组织，通常在手术或腹腔内感染引发炎症后产生。腹腔粘连是导致慢性腹痛和不孕症的主要原因，也是小肠梗阻最常见的病因¹。腹腔粘连的存在会使再次进行腹部手术更加困难，并增加并发症发生的风险²。

尽管经过多年的研究，粘连形成的机制仍不甚清楚。已知腹膜表面的初始损伤会导致富含纤维蛋白的液体渗出，随后形成血凝块，将肠管表面与腹壁粘连在一起³。随后，成纤维细胞及其他细胞迁入粘连区域并分泌结缔组织⁴。在数月到数年的时间内，粘连通过形成血管和神经而逐渐成熟⁵。

目前已有多种商用产品旨在减少腹部手术后粘连的形成（例如，Seprafilm）。所有这些产品均作为机械屏障，通过阻止肠管与腹壁之间的物理接触，从而抑制粘连形成。^6,7尽管有对照试验证据表明，手术防粘连屏障可减少粘连的形成⁸许多外科医生凭经验发现机械屏障产品的有效性令人失望。

目前尚无基于药物的抗粘连疗法，这反映出人们对粘连形成所涉及的精确过程仍缺乏深入了解。要开发出特异性靶向参与粘连形成过程中的细胞或分子因子的治疗手段，必须首先更深入地理解粘连形成过程中所涉及的各类事件。已有多个研究团队鉴定出可能在粘连形成中起重要作用的分子通路^9-11。动物模型为研究粘连的形成提供了理想的环境。已有大量研究报道了在多种动物（尤其是大鼠和小鼠）中通过外科手术诱导粘连的方法^6,12-14。鉴于我们在小鼠纤维化研究方面的经验，以及转基因小鼠和小鼠源性抗体的广泛可及性，我们选择小鼠作为研究粘连的模型动物。本文中，我们报道了为在小鼠体内可重复且可靠地诱导腹腔粘连而建立的实验技术。

方案

本方案已获得斯坦福大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并符合所有关于实验动物使用的机构伦理指南。

1. 腹腔粘连的建立

1. 手术前一周开始让小鼠食用抗生素饲料。
2. 对手术器械进行高压灭菌，并预热生理盐水灌洗液。
3. 使用2%吸入式异氟烷对小鼠进行麻醉。
4. 先用毛发剪，再快速涂抹脱毛剂（5–10秒），去除腹部大部分区域的毛发。用湿纱布轻轻擦拭，彻底清除脱毛剂；也可选择将小鼠下半身小心浸入温水中。彻底擦干动物体表。
5. 将小鼠鼻部放入麻醉鼻罩中。在整个手术过程中，密切监测动物的呼吸频率，并根据需要调整麻醉气体流速。
6. 使用加热装置（如加热垫或保温灯）以防止低体温。
7. 在准备腹部手术区域前，用胶带条将小鼠固定在腹部上下方，防止术中移动。先用碘伏消毒腹部，再用70%乙醇擦拭。消毒范围应尽可能大，包括剃毛区域边缘的毛发。将无菌手术巾覆盖于小鼠身上。（图1）
8. 皮下注射0.1 mg/kg的丁丙诺啡，或对30 g小鼠注射3 µg。
9. 进行皮肤切口。
   1. 从下腹部正中线开始，用镊子夹住皮肤，使用锐利剪刀在皮肤上做一浅层垂直切口。
   2. 用剪刀将切口向上延伸至剑突，注意仅切开皮肤层。
10. 当腹壁肌肉层显露并覆盖内脏时，用镊子夹住肌肉正中线，使用锐利剪刀非常小心地在肌肉层上做一小切口。务必避免意外损伤腹腔器官。
11. 在肌肉层上做一小切口进入腹膜腔，观察到肌肉层与腹腔器官分离后，将剪刀插入切口，小心向上下方向延伸切口。切口应从上方的剑突延伸至下方膀胱以上。（图2）
12. 暴露肠管后，找到盲肠并轻柔地将其外置。避免使用带齿或锐利的镊子夹持盲肠，建议使用无创镊，如Adson锯齿镊。
13. 用砂纸摩擦盲肠。
    1. 用100目砂纸轻柔摩擦盲肠两侧表面30–60秒，直至表面光泽消失并出现点状出血。若术者为右利手，可将盲肠尖端朝右摆放，并将其搭在术者左手食指上，有助于操作。（图3）
    2. 摩擦操作应轻柔，因盲肠壁较薄，易发生穿孔。摩擦时应能感受到轻微的粗糙感。若砂纸反复卡住组织，可能造成盲肠壁撕裂。需密切观察，防止砂纸颗粒脱落并残留在腹腔内，以免引发过度异物反应。
    3. 若发生盲肠壁撕裂，应立即终止手术并对动物实施安乐死。
    4. 若砂纸摩擦导致盲肠血管断裂出血，可用纱布压迫止血最多两分钟。若仍持续出血，则在出血点处使用7-0单股缝线做“8”字缝合，此方法几乎总能有效止血。缝合时注意避免缝入过多盲肠壁组织，以防造成局部壁组织坏死。
14. 损伤右侧腹壁。
    1. 用砂纸摩擦右侧腹壁肌肉的腹膜面。此处摩擦力度可比盲肠更强，持续摩擦直至整个右侧腹壁表面呈现粗糙状态。注意避免过度摩擦导致肌层出现破口而显露皮下组织。（图4）
    2. 使用Castro-Viejo持针器，在右侧腹壁肌肉层内缝入2至4针4-0丝线“8”字缝合，线尾保留约5 mm。缝合时注意避免误缝入肠壁。（图5）
15. 使用装有预热生理盐水的10 ml注射器多次冲洗肠管。将盐水直接冲入腹腔，以充分冲洗内部。若小鼠下方接触面被浸湿，应及时移动小鼠或更换接触面，以防低体温。
16. 用无菌纱布覆盖切口，吸除多余灌洗液。
17. 取少量淀粉，均匀撒在右侧腹壁表面及盲肠两侧。（图6）
18. 确认无活动性出血。若有出血，用纱布直接压迫出血点直至止血。若压迫后仍无法止血，按前述方法放置止血缝线。
19. 用镊子钝端和手指轻柔地将肠管推回腹腔。将盲肠置于右侧腹壁缝线旁，以最大程度促进粘连形成。
20. 关闭腹部切口。
    1. 使用6-0可吸收编织缝线，在切口顶端肌肉层做连续缝合。
    2. 沿切口向下连续缝合，闭合肌肉层。每次进针间隔约3 mm，每针缝合深度为3 mm。缝合时注意避免误缝入肠管。
    3. 在切口底部，保留上一针的线环，用于器械打结。剪线时留出5 mm线尾。
    4. 重复上述三步，使用6-0尼龙单股缝线缝合皮肤。
21. 皮下注射20 ml/kg生理盐水（约30 g小鼠注射0.5 ml）。
22. 用干纱布彻底擦干整个动物体表，因灌洗过程中背部毛发容易被打湿。
23. 用粘性敷料松散包裹腹部，覆盖切口。注意不要束缚动物四肢或影响其呼吸运动。
24. 密切监测动物从麻醉中恢复的过程。 术后2–3天内每12小时给予一次丁丙诺啡，以控制疼痛。

2. 收集粘附组织

1. 初次手术后至少等待七天。再次对手术器械进行高压灭菌，并使用异氟烷对小鼠进行麻醉。
2. 用聚维酮碘对腹部进行消毒，随后使用70%乙醇。剃除腹部右侧额外的毛发，以确保包含皮肤的粘连样本不被毛发覆盖，从而避免增加组织学制备的难度。
3. 采用左侧旁正中切口，因为肠管常与原切口处粘连。从腹部下端开始，在原切口底部左侧约5 mm处，用有齿小镊夹住皮肤，以锐性剪刀切开皮肤。将切口向上延伸至肋缘。图7)
4. 使用剪刀切开肌层，进入腹膜腔后，将切口向上下方向延伸。可见粘连组织导致盲肠和小肠与腹腔右侧壁粘连，可能还与原切口部位粘连。图8)
5. 使用剪刀，从切口边缘开始，在盲肠水平以上，围绕肠管粘连区域，沿环形方向剪开腹壁。
6. 在盲肠水平上下交替，逐渐环绕切断粘连组织，完成环形切开，得到一个 "岛" 肠管与腹壁及皮肤粘连。图9)
7. 再次使用剪刀剪开肠管，将粘连部分与其余肠管分离，从而获得一个组织“三明治”结构：一侧为皮肤和腹壁，另一侧为肠管，中间由粘连组织连接。图10)
8. 可选地，使用尖头剪刀将皮肤与腹壁肌肉彻底分离。若用于组织学分析，可考虑保留皮肤；若用于消化和细胞分离，则可去除皮肤。如果组织将用于组织学分析，应尽可能去除缝合材料，同时避免过度干扰黏附界面。对于消化和细胞分离，只要后续对组织消化液进行过滤，允许保留缝合线。
9. 切除粘连组织后，采用经机构动物使用委员会批准的人道方法处死小鼠。 

结果

术后7天，盲肠以及可能的升结肠、肝脏和小肠袢应与右侧腹壁粘连。（图8）切除的组织可进行包埋和切片，可获得优良的组织学切片。（图11、12）

若操作正确，小鼠在术后7天时应有100%出现显著粘连，死亡率应低于5%。

图 1：手术准备。 (a) 动物已用胶带固定，腹部已用碘伏消毒。 ...

讨论

该操作中的关键步骤包括：充分摩擦盲肠但避免穿孔、在腹壁侧放置缝线，以及使用适量的淀粉。仅对盲肠或肠管的特定小范围区域使用砂纸。在大段小肠上广泛使用砂纸容易导致明显的肠麻痹。摩擦盲肠时需施加足够力度，使表面变得粗糙，但又不能过度摩擦导致肠壁撕裂。掌握这一平衡可能需要一定练习。操作肠道时务必轻柔，避免使用尖锐或带齿的镊子夹持肠管。使用镊子夹住小肠系膜或过度牵拉肠管均容易意外引起出血。

如果盲肠壁发生撕裂，应终止操作并对动物实施安乐死。根据我们的经验，即使对撕裂部位进行了良好修复，盲肠撕裂仍会导致动物在数天后死亡。此外，盲肠壁撕裂会引起粪便溢出，从而以不可预测的方式影响炎症反应。

手术结束时必须彻底止血。部分出血血管可能在看似已停止出血后再次开放并重新出血。若有疑问，应在出血点周围放置可吸收单丝缝线行“8”字缝合。这种缝线相较于丝线或编织可吸收缝线更优，因其穿过组织时阻力最小。然而我们发现，在腹侧壁诱导粘连时，丝线或编织可吸收缝线效果更佳，因为单丝缝线的炎症反应较轻。

在操作结...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
费舍品牌吸水垫，20" x 24"	费舍科学公司	14-206-62
带衬里无菌手术巾，18" x 24"	布塞医院一次性用品公司	696	裁剪出适当尺寸的矩形孔
异氟烷麻醉剂（Isothesia isoflurane）	亨利·谢恩公司	050033
费舍品牌无菌棉纱垫，4" x 4"	费舍科学公司	22-415-469
普拉露眼用凡士林软膏，1/8盎司管装	德克拉兽用产品公司	NDC 17033-211-38
Nair脱毛膏	Church & Dwight 公司	22339-05
布托啡诺（Buprenex buprenorphine ）0.3 mg/ml	利洁时本克塞尔制药公司	NDC 12496-0757-5
1 cc 胰岛素注射器，27 G	贝克顿·迪金森公司	329412
聚维酮碘消毒液	麦德林公司	MDS093944H
Webcol 酒精消毒棉片	柯惠医疗公司	6818
通用实验室标签胶带	VWR公司	89097-912
BioGel PI 外科手套	Mölnlycke 医疗保健公司	ALA42675Z
带齿微型镊子	Roboz公司	RS-5150
精细剪刀—锋利型	精细科学工具公司	14060-09
直齿镊	精细科学工具公司	11050-10
Castro-Viejo 持针器	精细科学工具公司	12565-14
100目 1/4张砂纸	ACE五金公司	1010446	裁成条状
4-0 丝线缝合线，30"，SH针	爱惜康公司	K831
7-0 PDS II 可吸收单股缝合线，30"，BV-1针	爱惜康公司	Z135	通常为双针配置。在中间位置剪断缝线，可得到两条可用缝线。
大米淀粉	MP生物医学公司	102955
0.9% 氯化钠冲洗液	百特公司	BHL2F7121	使用前预热至 37 °C
10 ml 注射器	贝克顿·迪金森公司	309604
6-0 Vicryl 可吸收编织缝合线，18"，RB-1 圆锥形针	爱惜康公司	J212H
6-0 Ethilon 尼龙单股 缝合线，18"，P-3针	爱惜康公司	1698G
3M Tegaderm 透明薄膜敷料（框架式），6 cm x 7 cm	3M公司	1624W	沿长度方向对半裁剪