高密度脂蛋白的分离用于非编码小RNA定量

摘要

本方案描述了高密度脂蛋白小RNA的分离与定量方法。

摘要

小非编码RNA（sRNA）的多样性正在迅速扩展，其在包括基因调控在内的多种生物学过程中的作用也逐渐被揭示。尤其引人关注的是，sRNA也存在于细胞外，并稳定地分布于所有生物体液中。因此，细胞外sRNA代表了一类新型的疾病生物标志物，可能参与细胞信号传导和细胞间通讯网络。为了评估其作为生物标志物的潜力，可在血浆、尿液及其他体液中对sRNA进行定量分析。然而，要全面理解细胞外sRNA作为内分泌信号的影响，必须明确在生物体液（例如血浆）中负责运输和保护这些sRNA的载体类型、哪些细胞和组织贡献了细胞外sRNA库，以及哪些细胞和组织能够接收并利用细胞外sRNA。为实现这些目标，关键在于分离出高度纯化的细胞外载体，以用于sRNA的谱型分析和定量。我们先前已证实，脂蛋白（尤其是高密度脂蛋白（HDL））可在细胞间转运具有功能的微小RNA（miRNA），且HDL所携带的miRNA在疾病状态下发生显著改变。本文详细描述了一种新方案，该方案结合密度梯度超速离心法（DGUC）和快速蛋白液相色谱法（FPLC）进行串联HDL分离，从而获得高纯度的HDL，用于后续通过高通量测序和实时PCR技术对包括miRNA在内的所有sRNA进行谱型分析和定量。本方案将为研究HDL上的sRNA提供重要的技术资源。

引言

细胞外非编码小RNA（sRNA）代表了一类新的疾病生物标志物和潜在治疗靶点，可能在细胞间通讯中发挥重要作用¹。其中研究最为广泛的是微小RNA（miRNA），其长度约为22个核苷酸，由较长的前体分子和初级转录本加工而来²。研究表明，miRNA可通过抑制蛋白质翻译和促进mRNA降解，在转录后水平调控基因表达²。然而，miRNA仅是多种sRNA中的一类；sRNA还可来源于前体tRNA（tRNA来源的sRNA，tDR）、小核RNA（sRNA来源的sRNA，sndRNA）、小核仁RNA（snoRNA来源的sRNA，snRNA）、核糖体RNA（rRNA来源的sRNA，rDR）、Y RNA（yDR）以及其他多种RNA¹。已有少数新型sRNA被报道具有类似miRNA的功能；但尽管推测其可能参与基因调控，许多此类sRNA的生物学功能仍有待阐明^3-6。尤为引人注意的是，miRNA及其他sRNA在唾液、血浆、尿液和胆汁等细胞外体液中稳定存在。这些细胞外sRNA可能通过与细胞外囊泡（EV）、脂蛋白和/或细胞外核糖核蛋白复合物结合，从而免受RNase降解。

此前，我们报道过脂蛋白（特别是高密度脂蛋白，HDL）可在血浆中转运miRNA⁷本研究中，高密度脂蛋白（HDL）采用密度梯度超速离心法（DGUC）、快速蛋白液相色谱法（凝胶过滤尺寸排阻色谱，FPLC）以及亲和层析法（抗载脂蛋白A-I（apoA-I）免疫沉淀）依次分离。⁷采用基于实时 PCR 的低密度阵列和单个 miRNA 检测方法，对从健康个体和高胆固醇血症患者分离的高密度脂蛋白（HDL）中的 miRNA 水平进行定量⁷采用这种方法，我们能够对高纯度HDL制备物中的miRNA进行谱型分析，并定量特定miRNA。自2011年以来，我们发现尽管亲和层析可提高HDL的纯度，但抗体饱和会显著限制产量，且成本较高，难以推广。目前，我们的实验方案推荐采用密度梯度超速离心（DGUC）后接FPLC的两步串联方法，该方法同样可获得高质量的HDL样本，适用于后续RNA提取和sRNA定量分析。由于近年来sRNA高通量测序（sRNAseq）技术的进展， 例如，miRNA 以及其他非 miRNA 类小RNA（sRNA）受到越来越多的关注，sRNA测序（sRNAseq）已成为当前 miRNA 和 sRNA 分析的前沿技术。因此，本方案推荐采用 sRNAseq 对高密度脂蛋白（HDL）样本中的 miRNA 及其他 sRNA 进行定量分析。尽管如此，从 HDL 中分离的总 RNA 也可用于通过实时荧光定量 PCR 技术对单个 miRNA 或其他 sRNA 进行定量，或对 sRNAseq 结果进行验证。本文详细描述了一套针对高纯度 HDL-sRNA 的采集、纯化、定量、数据分析及验证的实验方案。

本文的总体目标是展示从人血浆中分离的高纯度高密度脂蛋白（HDL）进行小RNA（sRNA）定量的可行性和具体操作流程。

方案

1. 高密度脂蛋白（HDL）纯化（约 5.5 天）

1. 密度梯度超速离心法（DGUC，约 5 天）
   1. 向从新鲜静脉血中分离的 9 mL 血浆中加入 90 μL 的 100 倍抗氧化剂。
   2. 通过向第 1.1.1 步所得 9 mL 血浆中加入 0.251 g KBr，将血浆密度从 1.006 g/mL 调整至 1.025 g/mL（即每毫升血浆含 0.0278 g KBr）。室温下轻轻摇动血浆直至所有盐完全溶解，转移至超速离心管中，并确保所有气泡上升至顶部。
   3. 将 18 号针头尖端距尖 1 cm 处弯成 90°，斜面朝上。使用注射器和该 18 号针头，小心地将 3 mL 上层溶液 #1 加至血浆上方（表 1）。
      注意：弯曲的针头可确保在不与上层溶液混合的情况下移除全部 VLDL/IDL、LDL 和 HDL。
   4. 除去管顶大部分气泡，使弯月面与管顶之间保留 2–3 mm 空隙，然后小心地将离心管放入 SW-40Ti 转子桶中。
   5. 用天平称量每个转子桶（含盖），并与相对位置的转子桶（桶 + 盖）精确配平：#1 与 #4 配对，#2 与 #5 配对，#3 与 #6 配对。
      注意：这些转子桶必须始终配平并成对使用。
   6. 将转子放入超速离心机（见材料清单）。在 4 °C 条件下以 274,400 × g 离心 24 小时，使用 #4 中等刹车档位。
   7. 小心地将转子桶从转子中取出，再将离心管从转子桶中取出。
   8. 使用注射器和弯针小心吸取上层 2 mL 上清液。此即 VLDL/IDL 组分，可储存于 4 °C 或 -80 °C。
   9. 移除 VLDL/IDL 组分后，收集剩余约 7 mL 样品（血浆），转移至一个新的 15 mL 圆锥形离心管中。用上层溶液 #2（表 1）将样品体积补足至 9 mL。
   10. 向 9 mL 样品中加入约 0.746 g KBr（即每毫升样品含 0.0828 g KBr），将样品密度从 1.025 g/mL 调整至 1.080 g/mL。轻轻摇动样品直至 KBr 完全溶解（约 20 分钟），转移至超速离心管中，同时确保气泡上升至顶部。
   11. 使用注射器和针头，小心地将 3 mL 上层溶液 #3 加至样品上方（表 1）。弯月面与管顶之间保留 2–3 mm 空隙。
   12. 除去管顶残留的大部分气泡，小心地将装满的超速离心管放入 SW-40Ti 转子桶中。
   13. 用天平称量每个转子桶（含盖），并与相对位置的转子桶 + 盖精确配平，方法同 1.1.5 步。
   14. 将转子放入超速离心机（见材料清单）。在 4 °C 条件下以 274,400 × g 离心 24 小时，使用 #4 中等刹车档位。
   15. 小心地将转子桶从转子中取出，再将离心管从转子桶中取出。
   16. 使用注射器和弯针小心吸取上层 2 mL 上清液。此即 LDL 组分，可储存于 4 °C 或 -80 °C。
   17. 移除 LDL 组分后，收集剩余约 7 mL 样品（血浆），转移至一个新的 15 mL 圆锥形离心管中。用密度为 1.080 g/mL 的溶液 #4（表 1）将样品（血浆）体积补足至 9 mL。
   18. 向 9 mL 样品（血浆）中加入 3.33 g KBr（即每毫升样品含 0.37 g KBr），将样品密度从 1.080 g/mL 调整至 1.30 g/mL。摇动或轻微振荡样品直至 KBr（盐）完全溶解，然后转移至超速离心管中。
   19. 使用注射器和针头，小心地将 3 mL 上层溶液 #5 加至样品上方（表 1）。
   20. 除去管顶残留的大部分气泡，弯月面与管顶之间保留 2–3 mm 空隙，小心地将装满的超速离心管放入 SW-40Ti 转子桶中。
   21. 用天平称量每个转子桶（含盖），并与相对位置的转子桶 + 盖精确配平，方法同 1.1.5 步。
   22. 将转子放入超速离心机（见材料清单）。在 4 °C 条件下以 274,400 × g 离心 48 小时，使用 #4 刹车档位。
   23. 小心地将转子桶从转子中取出，再将离心管从转子桶中取出。
   24. 使用注射器和弯针小心吸取上层约 2 mL 上清液。此即 HDL 组分，可储存于 4 °C 或 -80 °C。
       注意：DGUC 分离后的 HDL 可进行透析以去除高盐溶液。
   25. 透析时，将收集的 HDL 组分装入密封透析袋（截留分子量 10,000）中，在 1 L 的 1×PBS 缓冲液中透析过夜。在 24 小时内更换透析缓冲液（1×PBS）三次。使用磁力搅拌子轻柔搅动 PBS 可提高透析效率。
   26. 采用 BCA 法测定 DGUC-HDL 的蛋白浓度⁸。
2. 快速蛋白液相色谱法（FPLC）或尺寸排阻色谱法（约 6 小时）
   1. 在进样前立即用 0.22 µm 微型离心滤膜（见材料清单）过滤 500 µL 含 1.2 mg DGUC-HDL（总蛋白）的样品。
      注意：某些样品可能需要在 0.22 µm 滤膜前先用 0.45 µm 微型离心滤膜进行额外过滤。
   2. 收集过滤后的 DGUC-HDL 样品，装入 FPLC（填充）进样注射器，确保注射器内无气泡后再注入 FPLC 系统。
   3. 设置 FPLC 流速为 0.3 mL/min，压力上限为 2.6 MPa。进样前用约 15 mL（相当于 0.2 柱体积）缓冲液平衡色谱柱。将样品与 3 mL 缓冲液一同注入 FPLC（进样环）仪器并开始运行。共收集 72 个组分，每管 1.5 mL。

2. 高通量小RNA测序（sRNAseq，约9天）

1. RNA提取（约1天）
   1. 根据制造商说明，使用比色法试剂盒测定总胆固醇水平，以鉴定对应于 DGUC-HDL 的 FPLC 组分。采用此 FPLC 设置，预计可获得 6–7 个含有 DGUC-HDL 的 FPLC 组分。
   2. 收集所有DGUC-HDL FPLC组分的体积（约8–10 mL，由1.45 mL组分合并而成），使用10 kDa分子量截留的离心过滤装置，在4 °C、4,000 × g条件下离心1小时，或直至HDL浓缩至约100 µL。
   3. 收集高密度脂蛋白（HDL）浓缩液，并使用BCA法测定HDL总蛋白浓度⁸.
   4. 确定每份样本中可分装的最高HDL总蛋白浓度，最高不超过1 mg。例如，从每份样本的相同量HDL总蛋白中提取RNA。
   5. 使用改良方案进行RNA提取 （参见材料列表）.
      1. 加入10倍体积的苯酚裂解试剂（见材料列表）样品，涡旋振荡1分钟。
      2. 室温孵育5分钟。
      3. 加入氯仿（体积为2.1.5.1步骤中所用酚裂解试剂体积的20%），剧烈振荡15秒。
      4. 室温孵育 2 - 3 分钟。
      5. 在4 °C预冷的离心机中，以12,000 x g离心15分钟。
      6. 将上层水相转移至新离心管中，避免触及中间相。
      7. 向水相中加入1.5倍体积的100%乙醇，涡旋混匀1分钟。
      8. 将样品在 -80 °C 条件下储存至少 1 小时或过夜。
      9. 使用提供的微型离心柱继续进行RNA提取实验步骤。
      10. 用30 µL无RNase的H₂O. 首先加入15 µL的H₂直接将样品加至烧结柱上，先以低速（2,000 × g）离心2分钟，再以高速（最大转速）离心1分钟。加入额外的15 µL H，重复此步骤₂O.
   6. 立即进行小RNA文库构建，或于-80 °C保存。
2. 文库构建（约 6 小时）
   1. 使用sRNA文库构建试剂盒，按照制造商说明书制备sRNA cDNA文库，仅对PCR扩增步骤进行如下所述的一项修改。
      1. 在冰上配制PCR预混液，其中包含0.5 µL无DNase/RNase的H₂O，每个样本加入15 µL PCR Mix（PML）和1 µL RNA PCR引物（RP1）（额外增加10%以补偿移液误差）。
      2. 向每个 (cDNA) 样本中加入 16.5 µL 的 PCR 混合液。
      3. 为每个样本分配一个索引/条形码编号用于多重测序，并向样本中加入1 µL对应编号的PCR引物索引。
      4. 使用微量离心机进行短暂离心。
         注意：每份样品的总体积现在应为 30 µL。
      5. 按照所述条件进行PCR扩增的循环程序 表 2 和 3.
3. 大小选择sRNA文库以去除接头：接头（约1.5小时）
   1. 使用自动DNA片段筛选仪，按照制造商说明书进行文库片段大小筛选，参数设置如下：目标长度：156 bp，起始长度：135 bp，终止长度：177 bp，范围标志：宽范围（Broad）。
4. DNA 纯化（约 0.5 小时）
   1. 根据制造商说明书纯化经大小筛选的sRNA cDNA。
   2. 用 2 × 7 µL 无 DNase/RNase 的 H 洗脱纯净且浓缩的 sRNA cDNA₂O.
5. 定量与评估sRNA cDNA文库的产量和质量（约1小时）
   1. 使用生物分析仪（试剂与材料列表）上的高灵敏度DNA芯片，按照制造商说明评估sRNA cDNA文库的质量和片段大小。
   2. 使用高灵敏度DNA检测试剂盒（材料列表），按照制造商说明书定量各个小RNA cDNA文库的浓度。
      注意：如果可能，建议将具有不同索引的所有样本在同一测序芯片通道中进行测序。若需使用多个通道，应适当混合病例样本与对照样本。
6. 高通量小RNA测序（约7天）
   1. 根据等摩尔浓度合并个体索引的小RNA文库。
   2. 使用生物分析仪上的高灵敏度DNA芯片对池化的sRNA文库进行质量筛查，并按照2.5.1 - 2.5.2步骤测定文库DNA浓度。
   3. 使用测序文库qPCR定量试剂盒（参见材料列表），按照制造商说明对文库中的接头含量进行定量PCR（qPCR），以确保获得适当的测序深度。
   4. 按照制造商说明，采用单端读取、50 bp 的测序方案，使测序深度达到约 20 - 25 M reads/样本。

3. 数据分析（约1天）

1. 按照用户指南说明，使用 bcl2fastq2 对已解复用样本的原始 fastq 文件进行预处理（材料列表）。
2. 使用 Cutadapt 去除接头序列⁹ 并去除读段 < 长度为16个核苷酸（nts），具体操作请参见用户指南说明（材料列表）。
3. 使用 NGSPERL 框架中的 removeSequenceInFastq 函数，根据用户指南说明（材料列表），去除小 RNA 文库中存在的污染序列，包括终止液序列（STP：CCACGTTCCCGTGG）和接头残留序列（CTACAGTCCGACGATC）。
4. 使用定量科学中心（CQS）工具，按照用户指南说明（材料列表）通过 FastQC 执行质量控制指标分析。
5. 生成非冗余列表 "相同的" 使用CQSTools根据用户指南说明（材料清单）对读段进行去重（合并冗余读段）并记录拷贝数。
6. 使用Bowtie1.1.2将测序读段比对至人类基因组，允许1个错配（参数：-a -m 100 --best --strata -v 1），具体操作参照用户指南说明（材料列表）。
7. 使用NGSPERL按照用户指南中的说明执行读段比对、计数和结果汇总任务。
8. 将导出的计数表转换为电子表格文件。
9. 标准化特定类别序列的读数（Normalize reads of a specific class）例如， miRNA 的读段数与该类别总读段数的比值例如， miRNA 读段总数）并将信号报告为每百万比对 miRNA 读段数（RPMM）。例如，RPMM =（miR-X / miRNA 读段总数）× 1,000,000。
10. 按照用户指南说明（材料列表），将标准化计数表作为通用单色技术数据输入软件，用于低水平和高水平差异分析。
    注意：目前尚无针对HDL-sRNA的特征明确的看家基因/sRNA。虽然可以使用外源添加对照（spike-in control），但可能存在一定问题。建议根据HDL的总蛋白投入量或体积进行标准化处理。最重要的是，推荐采用实时PCR或定量PCR的多种策略之一，对测序结果进行miRNA和sRNA的定量验证。

结果

本方案是一系列已建立方法的组合，旨在通过高通量测序或实时PCR对高纯度高密度脂蛋白（HDL）上的小RNA（sRNA）进行定量分析（图1）。为验证该方案的可行性与应用价值，采用梯度密度超速离心联合快速蛋白液相色谱法（tandem DGUC和FPLC）从人血浆中纯化HDL。根据胆固醇分布确定对应HDL的FPLC组分，将其浓缩后从1 mg HDL（总蛋白）中提取总RNA。sRNA文库使用来自n = 4名健康人类受试者的HDL样本构建。所有人血/血浆样本均在活跃的机构审查委员会方案（# 070416）下采集，并经范德堡大学医学院批准，受试者均签署知情同意书。制备的sRNA文库在范德堡先进基因组技术（VANTAGE）DNA测序中心进行测序，数据分析采用内部流程完成，数据可视化由图形软件生成。

在密度梯度超速离心法（DGUC）后必须采用第二种方法（FPLC）进行高密度脂蛋白（HDL）分离，其关键原因在于可能伴随外泌体（EVs）的共...

讨论

本方案旨在通过对高纯度高密度脂蛋白（HDL）进行高通量测序或实时PCR，定量微小RNA（miRNA）及其他小RNA（sRNA）。与任何实验方法一样，在HDL和RNA的纯化以及sRNA定量的每一步骤中，均需特别注意。本方案适用于起始血浆体积≥2 mL的研究项目。尽管如此，使用亲和层析法从低至80 µL的人或小鼠血浆中纯化的HDL，仍可成功完成高质量的RNA分析；然而，采用本方案所述方法时，较大的起始血浆体积可获得更佳的数据。样品处理和提取方法会显著影响miRNA/sRNA的质量和得率。抗凝剂的使用虽对血浆采集至关重要，但可能影响后续提取效果。例如，肝素在RNA提取过程中难以完全去除^14,15，并可能抑制PCR中所用的下游酶活性^16-18。此外，有报道称枸橼酸钠也可能干扰qPCR检测，与EDTA抗凝样本相比，枸橼酸钠抗凝样本中的miRNA表现出较差的表达谱^16,19,20。这些研究提示在选择抗凝剂时需谨慎考虑。此外，由于凝固过程中细胞裂解的风险增加，不建议使用血清样本，因为裂解细胞释放的miRNA可能人为地与脂蛋白结合。同样，血浆应尽可能在全血采集后立即分离，以避免其他外周血...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
超速离心机	Beckman Coulter	A99839	Optima XPN-80
超速离心机转子	Beckman Coulter	331362	SW-41Ti
AKTA Pure FPLC 系统	GE Healthcare	29018224
串联三根 FPLC Superdex 200 Increase 色谱柱	GE Healthcare	28990944	10/300 gl
SynergyMx	BioTek Instruments	7191000
台式离心机	Thermo Scientific	75004525	Sorvall ST40R
冷冻离心机	Eppendorf	22629867	5417R (通过 USA Scientific 购买)
微量离心机	USA Scientific	2631-0006
PippenPrep	Sage Science	PIP0001
2100 生物分析仪	Agilent	G2938B
高灵敏度 DNA 检测试剂盒	Agilent	5067-4626
测序文库 qPCR 定量试剂盒	Illumina	SY-930-1010
ProFlex 热循环仪	Applied Biosystems	4484073
QuantStudio 12k Flex	Applied Biosystems	4471134
EpMotion 机器人	Eppendorf	960000111	5070
超透明离心管	Beckman Coulter	344059
溴化钾	Fisher Chemicals	P205-500
15 mL 锥形管	Thermo Scientific	339650
0.45 µm 微型离心滤膜	Millipore	UFC30HV00
0.22 µm 微型离心滤膜	Millipore	UFC30GV00
miRNAEasy 总 RNA 提取试剂盒	Qiagen	217004
总胆固醇比色法检测试剂盒	Cliniqa (Raichem)	R80035
10,000 分子量截断离心过滤器	Amicon	UFC801024	通过 Millipore 购买
PCR 条形管	Axygen	PCR-0208-C	通过 Fisher 购买
microRNA 反转录试剂盒	Life Technologies	4366597	适用于 1000 次反应
PCR 预混液	Life Technologies	4440041	50 mL 瓶装
Pierce BCA 蛋白定量试剂盒	Thermo Scientific	23225
核酸纯化与浓缩试剂盒	Zymo	D4014
透析袋	Spectrum Labs	132118	通过 Fisher 购买
bcl2fastq2	Illumina	n/a	软件
Cutadapt	https://github.com/marcelm/cutadapt	n/a	软件
NGSPERL	github.com/shengqh/ngsperl	n/a	软件
CQSTools	github.com/shengqh/CQS.Tools	n/a	软件
Bowtie 1.1.2	http://bowtie-bio.sourceforge.net	n/a	软件
GeneSpringGX13.1.1	Agilent	n/a	软件