pH依赖性活性的检测 大肠杆菌 分子伴侣 HdeB 体外 和 体内

摘要

本研究描述了用于表征分子伴侣活性的生物物理、生物化学和分子技术 大肠杆菌 在酸性pH条件下研究HdeB。这些方法已成功应用于其他酸保护性分子伴侣（如HdeA），并可经修改后用于其他分子伴侣及应激条件。

摘要

细菌经常暴露于各种环境变化中，例如 pH、温度、氧化还原状态、光照或机械力的改变。这些条件中的许多都会导致细胞内蛋白质去折叠，并对生物体的存活产生不利影响。已发现一组彼此无关的、应激特异性的分子伴侣在生物体应对这些应激条件的存活过程中发挥着关键作用。这些蛋白质在未受应激时处于完全折叠且无伴侣活性的状态，但在特定应激条件下会迅速去折叠并转变为具有伴侣活性的形式。一旦被激活，这些条件性无序伴侣蛋白能够结合大量不同的易聚集蛋白，防止其发生聚集，并在恢复至非应激条件时直接或间接促进蛋白质的重新折叠。深入理解其激活机制与客户蛋白识别的主要研究方法是通过纯化这些蛋白质，并随后利用以下手段对其进行表征 体外 分子伴侣实验。后续步骤 体内 应激检测对于独立验证所获得的结果至关重要 体外 结果。

本方案描述了 体外 和 体内 表征分子伴侣活性的方法 E. coli HdeB，一种酸激活的分子伴侣。通过光散射测量来便捷地检测HdeB防止已知模型底物蛋白MDH在酸性条件下发生聚集的能力。 体外分析型超速离心实验被用于揭示HdeB与其底物蛋白LDH之间的复合物形成，以探究底物蛋白在恢复至非应激条件后的命运。对底物蛋白进行酶活性测定，以监测HdeB对pH诱导的底物蛋白失活与再活化的影响。最后，通过存活率研究来评估HdeB分子伴侣功能的影响 体内

引言

微生物病原体经历酸诱导蛋白质去折叠条件的一种常见自然环境是哺乳动物的胃（pH 范围为 1–4），其酸性 pH 值可作为抵御食源性病原体的有效屏障¹。由氨基酸侧链质子化引起的蛋白质去折叠和聚集会影响生物过程，破坏细胞结构，并最终导致细胞死亡^1,2。由于质子可通过多孔的外膜自由扩散，革兰氏阴性菌周质空间的 pH 值几乎会立即与环境 pH 值达到平衡，因此在酸胁迫条件下，周质蛋白和内膜蛋白是细胞中最易受损的组分³。为了保护其周质蛋白质组免受酸介导的快速损伤，革兰氏阴性菌利用酸激活的周质分子伴侣 HdeA 和 HdeB。HdeA 是一种条件性无序分子伴侣^4,5：在中性 pH 下，HdeA 以折叠态、无分子伴侣活性的二聚体形式存在；当 pH 降至 3 以下时，HdeA 的分子伴侣功能迅速被激活^6,7。HdeA 的激活需要发生显著的结构变化，包括解离为单体以及单体的部分去折叠^6–8。一旦被激活，HdeA 即可结合在酸性条件下发生去折叠的蛋白质，有效防止其在低 pH 孵育期间以及 pH 中和过程中发生聚集。当 pH 恢复至 7.0 时，HdeA 以不依赖 ATP 的方式促进其客户蛋白的重折叠，并自身转换回二聚体、无分子伴侣活性的构象⁹。类似地，同源分子伴侣 HdeB 在 pH 7.0 时也无分子伴侣活性。然而与 HdeA 不同的是，HdeB 的分子伴侣活性在 pH 4.0 时达到表观最大值，此时 HdeB 仍主要保持折叠态和二聚体形式¹⁰。此外，进一步降低 pH 会导致 HdeB 失活。这些结果表明，尽管 HdeA 与 HdeB 具有高度同源性，但二者在功能激活模式上存在差异，使其能够在其保护性分子伴侣功能中覆盖更宽的 pH 范围。另一种被认为参与 E. coli 酸抗性的分子伴侣是胞质中的 Hsp31，它似乎可在中性条件恢复前稳定去折叠的客户蛋白。然而，Hsp31 作用的确切机制至今仍不明确¹²。鉴于其他肠致病菌（如 Salmonella）缺乏 hdeAB 操纵子，很可能还存在其他尚未被鉴定的周质分子伴侣参与这些细菌的酸抗性过程¹¹。

本文所述方案可用于监测 HdeB 的 pH 依赖性分子伴侣活性 体外 和 体内 ¹⁰ 并可应用于研究其他分子伴侣，如Hsp31。或者，可用于研究调控表达的复杂转录因子网络 hdeAB 可以被潜在研究的 体内 应激检测。用于表征蛋白质的分子伴侣功能 体内可以采用不同的实验设计。一种方法是在蛋白质去折叠的应激条件下，对过表达目标基因或缺失该基因的突变菌株进行表型表征。可通过蛋白质组学研究鉴定在应激条件下，当分子伴侣存在时不再发生聚集的蛋白质；或利用酶活性测定，在应激条件下确定分子伴侣对特定酶的影响。 ^14-16在本研究中，我们选择在 rpoH 缺失热激σ因子32的缺失突变株。RpoH调控所有主要基因的表达 E. coli 分子伴侣，其缺失已知会增加对导致蛋白质去折叠的环境应激条件的敏感性 ¹⁵。该 体内 通过监测HdeB抑制Δ菌株pH敏感性的能力来确定其分子伴侣活性rpoH 菌株。综上所述，本文所介绍的实验方案为表征酸激活分子伴侣的活性提供了一种快速且简便的方法 体外 以及在 体内 背景。

方案

1. 周质HdeB的表达与纯化

注意：HdeB 在含有质粒 pTrc-hdeB¹⁰ 的 E. coli 细胞中表达，并通过多粘菌素裂解后从周质空间纯化获得。

1. 在含有 200 µg/ml 氨苄青霉素（LB_Amp）的 30 ml LB 培养基中培养含有质粒 pTrc-hdeB¹⁰ 的 E. coli 菌株过夜。接种四份 1 L 的 LB_Amp 培养基，在 37 °C、200 rpm 条件下培养至 O.D._600nm 达到 0.7。然后加入 300 µM IPTG 以诱导 HdeB 表达，并将培养温度降至 30 °C。
2. 在 30 °C 下表达蛋白 5 小时后，于 4 °C 下以 8,000 × g 离心 5 分钟收集菌体。
3. 用 100 ml 缓冲液 A（50 mM Tris/HCl，50 mM NaCl，pH 7.5）洗涤菌体沉淀，并在 4 °C 下以 8,000 × g 再次离心 5 分钟。
4. 随后，将菌体沉淀重悬于 80 ml 含 1 mg/ml 多粘菌素硫酸盐的缓冲液 A 中。为有效破坏外膜，于 4 °C 轻柔搅拌 1 小时。
5. 为去除胞质组分和细胞碎片，于 4 °C 以 15,000 × g 离心 20 分钟。获得约 60 ml 含可溶性 HdeB 的上清液。
6. 使用截留分子量为 6 kDa 的透析膜，将含周质提取物的上清液在 150 倍体积的缓冲液 B（20 mM Tris/HCl，0.5 mM EDTA，pH 8.0）中于 4 °C 透析过夜。使用截留分子量为 3 kDa 的离心过滤装置将蛋白浓缩至 15 ml。用孔径为 0.2 µm 的滤膜过滤蛋白溶液。
7. 将蛋白样品上样至已用 5 倍柱体积缓冲液 B 平衡的阴离子交换层析柱（柱体积 5 ml），流速为 2.5 ml/min。蛋白上样后，以 2.5 ml/min 的流速用缓冲液 B 洗脱 10 分钟。随后在 50 分钟内以 2.5 ml/min 的流速，使用缓冲液 B 中 0 至 0.5 M NaCl 的线性梯度洗脱 HdeB⁶。
8. 通过 15% SDS-PAGE 鉴定含 HdeB 的组分。取 20 µl 样品与 5 µl 5× 还原型 SDS 上样缓冲液混合。取 10 µl 上样至凝胶，在 Tris-甘氨酸电泳缓冲液（14.4 g/L 甘氨酸，2.9 g/L Tris，1 g/L 十二烷基硫酸钠，pH 8.3）中以 150 V 电泳，直至溴酚蓝条带迁移至凝胶底部附近（约 45 分钟）。
9. 合并所有含 HdeB 的组分，在 4 °C 下用 4 L HdeB 储存缓冲液（50 mM Tris/HCl，200 mM NaCl，pH 8.0）透析过夜，并使用截留分子量为 3 kDa 的离心过滤装置将蛋白浓缩至约 300 µM。使用摩尔消光系数 ε_280nm = 15,595 M^-1cm^-1 在 280 nm 处测定 HdeB 浓度。分装为 100 µl 每份，用液氮速冻。
   注：HdeB 可在 -70 °C 下保存至少 6 个月。

2. 使用热变性苹果酸脱氢酶（MDH）检测分子伴侣活性

注意：不同 pH 值下纯化的 HdeB 对热变性猪线粒体苹果酸脱氢酶（MDH）聚集的影响监测方法如下所述。所有列出的蛋白质浓度均指单体浓度。

1. 为制备MDH，将MDH在4 °C条件下对4 L缓冲液C（50 mM磷酸钾，50 mM NaCl，pH 7.5）透析过夜，并使用截留分子量为30 kDa的离心过滤装置将蛋白浓缩至约100 µM。
   注意：必须仔细进行MDH的透析，因为MDH通常以硫酸铵溶液形式提供。
2. 为去除聚集体，将蛋白在4 °C下以20,000 × g离心20分钟。通过280 nm处的吸光度测定MDH浓度（ε_{280 nm} = 7,950 M^-1 cm^-1）。将MDH分装为50 µl每份，并迅速冷冻后储存。
3. 将1 ml石英比色皿放入配备温控样品架和搅拌器的荧光分光光度计中。设定激发/发射波长（λ_ex/em）为350 nm。
4. 向比色皿中加入适量预热至43 °C的缓冲液D（150 mM磷酸钾，150 mM NaCl），调节至所需pH值（此处为pH 2.0、pH 3.0、pH 4.0和pH 5.0），并将样品架温度设定为43 °C。总体积为1,000 µl。
5. 向缓冲液中加入12.5 µM HdeB（或作为缓冲对照，加入等体积的HdeB储存缓冲液），随后加入0.5 µM MDH。开始监测光散射信号。孵育反应360秒，以确保MDH充分去折叠。
6. 通过加入0.16–0.34体积的2 M无缓冲K₂HPO₄将pH升至7，并继续记录光散射信号440秒。
7. 将中和后特定时间点（此处为500秒，此时观察到MDH光散射最大值）在无分子伴侣存在时记录的MDH聚集程度设定为100%。在每个指定pH值下，将HdeB的活性归一化为无HdeB时MDH的光散射信号。

3. 通过分析型超速离心法（aUC）检测 HdeB-LDH 复合物的形成

注意：单独的 HdeB 或其与热变性乳酸脱氢酶（LDH）形成的复合物的沉降速度实验均使用分析型超速离心机进行。

1. 为制备乳酸脱氢酶（LDH），将LDH在4 °C下于4 L缓冲液C（50 mM磷酸钾，50 mM NaCl，pH 7.5）中透析过夜，并使用截留分子量为30 kDa的离心过滤装置将蛋白浓缩至约200 µM。
   注意：必须小心进行LDH的透析，因为LDH通常以硫酸铵溶液形式提供。
2. 为去除聚集体，将LDH在4 °C下以20,000 × g离心20分钟。通过280 nm处的吸光度测定LDH浓度（ε_{280 nm} = 43,680 M^-1 cm^-1）。将LDH分装为每份50 µl，并迅速冷冻后储存。
3. 在缓冲液D中（pH分别为4和7），将3 µM LDH与或不与30 µM HdeB在41 °C下孵育15分钟。
   注意：在更高温度下孵育LDH会导致其完全聚集，从而无法观察到HdeB的分子伴侣效应。
4. 让样品冷却至室温。然后将样品加载至含有标准扇形双通道中心部件（光程1.2 cm）的样品池中。将样品池装入超速离心机，并在沉降前于22 °C平衡至少1小时。
5. 在22 °C和167,000 × g条件下，使用相应的转子离心12小时，并在280 nm处连续监测蛋白的沉降过程。如先前研究所示，测量每个通道的透射光强度而非吸光度可提高信噪比，同时也有助于提升后续数据拟合的质量。
6. 使用SEDFIT软件（版本15.01b，2015年12月）进行数据分析，采用连续c(s)分布模型¹⁷。有关如何使用SEDFIT的教程见参考文献¹⁸。
   1. 将最大熵（ME）正则化的置信水平设为0.7。
7. 使用SEDNTERP¹⁹计算缓冲液的密度和黏度。为估算聚集的底物蛋白量，将pH 4条件下沉降的LDH积分值与pH 7条件下的积分值进行比较作为参考。
   注意：沉降分布图的积分可直接在SEDFIT中完成。其他可用于分析沉降速度数据的软件可在近期的一篇综述中找到²⁰。

4. 在 HdeB 存在下监测 MDH 的失活与再激活

注意：通过监测中和后MDH活性的变化，确定纯化的HdeB对pH展开的MDH复性的影响。

1. 在所需的 pH 值（此处为 pH 2.0、pH 3.0、pH 4.0 和 pH 5.0）下，将 1 µM MDH 在缓冲液 D 中于 37 °C 孵育 1 小时，孵育体系中不含或含有 25 µM HdeB。随后，将温度转移至 20 °C 持续 10 分钟。
   注意：即使存在 HdeB，当 MDH 在高于 37 °C 的温度下孵育时，也未观察到 MDH 的重折叠。
2. 为启动酸变性 MDH 的重折叠，通过加入 0.13–0.42 体积的 0.5 M 磷酸钠缓冲液（pH 8.0），将样品中和至 pH 7.0。
3. 在 20 °C 孵育 2 小时后，通过监测 340 nm 处 NADH 吸光度的降低来测定 MDH 活性⁹。
   注意：MDH 催化依赖 NADH 将草酰乙酸还原为 L-苹果酸的反应。
   1. 将 50 µl 孵育反应液与 950 µl 测定缓冲液（50 mM 磷酸钠，pH 8.0，1 mM 草酰乙酸和 150 µM NADH）混合。
      注意：测定缓冲液中 MDH 的终浓度应为 44 nM。
   2. 使用配备帕尔贴温控模块（设定为 20 °C）的分光光度计监测吸光度变化。
   3. 以保持在 pH 7.0 条件下的 44 nM 天然 MDH 的活性为参照，报告 MDH 活性。

5. HdeB 过表达的影响 E. coli 酸胁迫条件下的存活

注意：E. coli MG1655 基因组 DNA 采用已发表的方案进行分离²¹。

1. 使用引物 hdeB-BamHI-rev GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT CGG CAA GTC ATT 和 hdeB-EcoRI-fw GGT GCC GAA TTC AGG AGG CGC ATG AAT ATT TCA TCT CTC C，通过 PCR 从 E. coli MG1655 中扩增 hdeB 基因。
2. 按如下组分在 50 µl 体系中配制 PCR 反应：10 µl 5x 聚合酶缓冲液，200 µM dNTPs，0.5 µM 引物 JUD2，0.5 µM 引物 JUD5，150 ng MG1655 基因组 DNA，0.5 µl DNA 聚合酶，用 ddH₂O 补足至 50 µl。
3. 按以下程序扩增 hdeB：第一步：95 °C 预变性 5 分钟，1 个循环；第二步：95 °C 变性 30 秒，55 °C 退火 30 秒，72 °C 延伸 30 秒，共 40 个循环；第三步：72 °C 延伸 10 分钟。
4. 将 PCR 扩增产物通过标准限制性克隆方法连接至 pBAD18 质粒的 EcoRI 和 BamHI 位点。使用质粒提取试剂盒按照制造商说明纯化质粒，并通过测序验证构建的质粒¹⁰。
5. 将表达 HdeB 的质粒或空载体对照 pBAD18 转化至菌株 BB7224 (ΔrpoH)（基因型：F^-, λ^-, e14^-, [araD139]_B/r Δ(argF-lac)169 flhD5301 Δ(fruK-yeiR)725(fruA25) relA1 rpsL150(Sm^R) rbsR22 Δ(fimB-fimE)632(::IS1) ptsF25 zhf::Tn10(Tc^S) suhX401 deoC1 araD⁺ rpoH::kan⁺;¹⁶）的化学感受态细胞中。
   注意：该菌株具有温度敏感性。
6. 在 42 °C 热激 45 秒后，于涂板前将细胞在 30 °C、200 rpm 条件下孵育。对阳性克隆进行单菌落划线，并在 30 °C 培养过夜。接种 50 ml LB_Amp 培养基培养过夜，于 200 rpm、30 °C 条件下培养。
7. 将过夜培养物按 40 倍稀释至 25 ml LB_Amp 培养基中，加入 0.5% 阿拉伯糖（Ara），在 30 °C、200 rpm 条件下培养至 O.D._600nm = 1.0，以诱导 HdeB 蛋白表达。
8. 进行 pH 转移实验时，使用 LB_Amp+Ara 培养基将细胞稀释至 O.D._600nm = 0.5，并通过加入适量 5 M HCl 调节至相应 pH 值（此处为 pH 2.0、pH 3.0 和 pH 4.0）。
9. 在指定时间点（pH 2.0 处理 1 分钟，pH 3.0 处理 2.5 分钟，pH 4.0 处理 30 分钟）后，加入适量 5 M NaOH 中和培养物。
10. 在 30 °C 条件下，通过 O.D. 测定监测中和后培养物在液体培养中 12 小时内的生长情况。

结果

HdeA 和 HdeB 是同源蛋白 E. coli 已知可保护周质蛋白免受酸性应激条件影响的蛋白质 ¹⁰我们的研究发现，与HdeA类似，HdeB也作为一种酸激活的分子伴侣发挥作用。然而，与HdeA不同的是，HdeB在仍具有潜在杀菌性的pH条件下发挥作用，但该pH值显著高于HdeA的最适pH ^6,9,10,22. 为研究HdeB分子伴侣活性的最适pH值 体外，天然MDH被稀释至预热的（43 °C) 缓冲液中，有或无 HdeB 存在的情况下进行。孵育 360 秒后，中和孵育反应。该中和作用会触发 MDH 的聚集 43 °C ⁹代表性结果表明，MDH在缺乏HdeB的情况下，其中和后由于MDH发生聚集，光散射信号显著增强（图1，每种pH条件下的黑线）。在HdeB存在的情况下，当pH从4或5中和至中性时，光散射信号显著降低，表明HdeB可防止MDH发生聚集（图1，pH 4 和 pH 5）。然而相...

讨论

为了研究 HdeB 的激活机制及其分子伴侣功能，必须表达并纯化大量 HdeB 蛋白。目前已有多种表达载体系统可用于高效表达目标蛋白，包括 pTrc 和 pBAD 载体，本研究中均采用了这两种载体。这些载体的启动子可被 E. coli RNA 聚合酶高效识别，因而能够在任何 E. coli 菌株中实现 HdeB 的强烈上调表达。这一特性在研究酸性应激条件下 HdeB 的 体内 过表达时尤为重要，本研究中使用了 rpoH 缺失菌株。该菌株缺乏大多数分子伴侣，因此对多种应激因素（包括高温、低 pH 值和氧化应激）更为敏感¹⁵。作为替代方案，也可在缺失目标基因的突变菌株中开展与本文类似的存活率研究。

在设计任何分子伴侣活性或复性实验时，必须仔细考虑底物蛋白的类型、底物蛋白的浓度以及缓冲液条件。在典型的分子伴侣实验中，通常使用柠檬酸合酶、荧光素酶或苹果酸脱氢酶等模型底物蛋白，将其置于高浓度尿素或盐酸胍中变性，然后稀释至不含变性剂的缓冲液中以诱导其发生聚集^23,13。通过检测在分...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NEB10-beta E. coli 细胞	新英格兰生物实验室	C3019I
氨苄青霉素	Gold Biotechnology	A-301-3
LB 肉汤混合物，Lennox	LAB Express	3003
IPTG	Gold Biotechnology	I2481C50
氯化钠	赛默飞世尔科技	S271-10
Tris	Amresco	0826-5kg
EDTA	赛默飞世尔科技	BP120-500
多粘菌素 B 硫酸盐	ICN Biomedicals Inc.	100565
0.2 µm 孔径无菌注射器滤器	Corning	431218
HiTrap Q HP（柱体积 5 ml）	GE Healthcare Life Sciences	17-1153-01
Mini-Protean TGX，15%	Bio-Rad	4561046
苹果酸脱氢酶（MDH）	罗氏	10127914001
磷酸二氢钾（一碱）	赛默飞世尔科技	BP362-500
磷酸氢二钾（二碱）	赛默飞世尔科技	BP363-1
F-4500 荧光分光光度计	日立	FL25
草酰乙酸	Sigma	O4126-5G
NADH	Sigma	N8129-100MG
磷酸二氢钠	Sigma	S9390-2.5KG
磷酸氢二钠	Sigma	S397-500
乳酸脱氢酶（LDH）	罗氏	10127230001
Beckman Proteome Lab XL-I 分析型超速离心机	贝克曼库尔特	392764
中心部件，12 mm，环氧树脂炭粉填充	贝克曼库尔特	306493
AN-50 Ti 转子，分析型，8 孔位	贝克曼库尔特	363782
Wizard Plus 质粒小提试剂盒	普洛麦格	A1470	用于质粒纯化（方案 5.1）
L-阿拉伯糖	Gold Biotechnology	A-300-500
甘氨酸	DOT Scientific Inc	DSG36050-1000
荧光比色皿	Hellma Analytics	119004F-10-40
寡核苷酸	英潍捷基
Phusion 高保真 DNA 聚合酶	新英格兰生物实验室	M0530S
dNTP 混合物	英潍捷基	10297018
盐酸	赛默飞世尔科技	A144-212
氢氧化钠	赛默飞世尔科技	BP359-500
Amicon Ultra 15 ml 3K NMWL	默克密理博	UFC900324
Avanti J-26XPI 离心机	贝克曼库尔特	393127
Varian Cary 50 分光光度计	安捷伦科技
Spectra/Por 1 透析膜，截留分子量：6 kDa	Spectrum Laboratories	132650
Amicon Ultra 离心滤膜装置 30K	默克密理博	UFC803024
SDS	赛默飞世尔科技	bp166-500
Veriti 96 孔 PCR 仪	赛默飞世尔科技	4375786