pH依赖性活性的检测 大肠杆菌 分子伴侣 HdeB 体外 和 体内

摘要

本研究描述了用于表征分子伴侣活性的生物物理、生物化学和分子技术 大肠杆菌 在酸性pH条件下研究HdeB。这些方法已成功应用于其他酸保护性分子伴侣（如HdeA），并可经修改后用于其他分子伴侣及应激条件。

摘要

细菌经常暴露于各种环境变化中，例如 pH、温度、氧化还原状态、光照或机械力的改变。这些条件中的许多都会导致细胞内蛋白质去折叠，并对生物体的存活产生不利影响。已发现一组彼此无关的、应激特异性的分子伴侣在生物体应对这些应激条件的存活过程中发挥着关键作用。这些蛋白质在未受应激时处于完全折叠且无伴侣活性的状态，但在特定应激条件下会迅速去折叠并转变为具有伴侣活性的形式。一旦被激活，这些条件性无序伴侣蛋白能够结合大量不同的易聚集蛋白，防止其发生聚集，并在恢复至非应激条件时直接或间接促进蛋白质的重新折叠。深入理解其激活机制与客户蛋白识别的主要研究方法是通过纯化这些蛋白质，并随后利用以下手段对其进行表征 体外 分子伴侣实验。后续步骤 体内 应激检测对于独立验证所获得的结果至关重要 体外 结果。

本方案描述了 体外 和 体内 表征分子伴侣活性的方法 E. coli HdeB，一种酸激活的分子伴侣。通过光散射测量来便捷地检测HdeB防止已知模型底物蛋白MDH在酸性条件下发生聚集的能力。 体外分析型超速离心实验被用于揭示HdeB与其底物蛋白LDH之间的复合物形成，以探究底物蛋白在恢复至非应激条件后的命运。对底物蛋白进行酶活性测定，以监测HdeB对pH诱导的底物蛋白失活与再活化的影响。最后，通过存活率研究来评估HdeB分子伴侣功能的影响 体内

引言

微生物病原体经历酸诱导蛋白质去折叠条件的一种常见自然环境是哺乳动物的胃（pH 范围为 1–4），其酸性 pH 值可作为抵御食源性病原体的有效屏障¹。由氨基酸侧链质子化引起的蛋白质去折叠和聚集会影响生物过程，破坏细胞结构，并最终导致细胞死亡^1,2。由于质子可通过多孔的外膜自由扩散，革兰氏阴性菌周质空间的 pH 值几乎会立即与环境 pH 值达到平衡，因此在酸胁迫条件下，周质蛋白和内膜蛋白是细胞中最易受损的组分³。为了保护其周质蛋白质组免受酸介导的快速损伤，革兰氏阴性菌利用酸激活的周质分子伴侣 HdeA 和 HdeB。HdeA 是一种条件性无序分子伴侣^4,5：在中性 pH 下，HdeA 以折叠态、无分子伴侣活性的二聚体形式存在；当 pH 降至 3 以下时，HdeA 的分子伴侣功能迅速被激活^6,7。HdeA 的激活需要发生显著的结构变化，包括解离为单体以及单体的部分去折叠^6–8。一旦被激活，HdeA 即可结合在酸性条件下发生去折叠的蛋白质，有效防止其在低 pH 孵育期间以及 pH 中和过程中发生聚集。当 pH 恢复至 7.0 时，HdeA 以不依赖 ATP 的方式促进其客户蛋白的重折叠，并自身转换回二聚体、无分子伴侣活性的构象⁹。类似地，同源分子伴侣 HdeB 在 pH 7.0 时也无分子伴侣活性。然而与 HdeA 不同的是，HdeB 的分子伴侣活性在 pH 4.0 时达到表观最大值，此....

方案

1. 周质HdeB的表达与纯化

注意：HdeB 在含有质粒 pTrc-hdeB¹⁰ 的 E. coli 细胞中表达，并通过多粘菌素裂解后从周质空间纯化获得。

1. 在含有 200 µg/ml 氨苄青霉素（LB_Amp）的 30 ml LB 培养基中培养含有质粒 pTrc-hdeB¹⁰ 的 E. coli 菌株过夜。接种四份 1 L 的 LB_Amp 培养基，在 37 °C、200 rpm 条件下培养至 O.D._600nm 达到 0.7。然后加入 300 µM IPTG 以诱导 HdeB 表达，并将培养温度降至 30 °C。
2. 在 30 °C 下表达蛋白 5 小时后，于 4 °C 下以 8,000 × g 离心 5 分钟收集菌体。
3. 用 100 ml 缓冲液 A（50 mM Tris/HCl，50 mM NaCl，pH 7.5）洗涤菌体沉淀，并在 4 °C 下以 8,000 × g 再次离心 5 分钟。
4. 随后，将菌体沉淀重悬于 80 ml 含 1 mg/ml 多粘菌素硫酸盐的缓冲液 A 中。为有效破坏外膜，于 4 °C 轻柔搅拌 1 小时。
5. 为去除胞质组分和细胞碎片，于 4 °C 以 15,000 × g 离心 20 分钟。获得约 60 ml 含可溶性....

结果

HdeA 和 HdeB 是同源蛋白 E. coli 已知可保护周质蛋白免受酸性应激条件影响的蛋白质 ¹⁰我们的研究发现，与HdeA类似，HdeB也作为一种酸激活的分子伴侣发挥作用。然而，与HdeA不同的是，HdeB在仍具潜在杀菌性的pH条件下发挥作用，但该pH显著高于HdeA的最适pH ^6,9,10,22. 为研究HdeB分子伴侣活性的最适pH值 体外，天然MDH被稀释至预热的（43 °C) 缓冲液中，有或无 HdeB 存在的情况下进行。孵育 360 秒后，中和孵育反应。该中和作用会触发 MDH 的聚集 43 °C ⁹代表性结果表明，MDH在缺乏HdeB的情况下，其中和后由于MDH发生聚集，光散射信号显著增强（图1，每种pH条件下的黑线）。在HdeB存在的情况下，当pH从4或5中和至中性时，光散射信号显著降低，表明HdeB可防止MDH发生聚集（图1，pH 4 和 pH 5）。然而相反的是，在从 pH 2 .......

讨论

为了研究 HdeB 的激活机制及其分子伴侣功能，必须表达并纯化大量 HdeB 蛋白。目前已有多种表达载体系统可用于高效表达目标蛋白，包括 pTrc 和 pBAD 载体，本研究中均采用了这两种载体。这些载体的启动子可被 E. coli RNA 聚合酶高效识别，因而能够在任何 E. coli 菌株中实现 HdeB 的强烈上调表达。这一特性在研究酸性应激条件下 HdeB 的 体内 过表达时尤为重要，本研究中使用了 rpoH 缺失菌株。该菌株缺乏大多数分子伴侣，因此对多种应激因素（包括高温、低 pH 值和氧化应激）更为敏感¹⁵。作为替代方案，也可在缺失目标基因的突变菌株中开展与本文类似的存活率研究。

在设计任何分子伴侣活性或复性实验时，必须仔细考虑底物蛋白的类型、底物蛋白的浓度以及缓冲液条件。在典型的分子伴侣实验中，通常使用柠檬酸合酶、荧光素酶或苹果酸脱氢酶等模型底物蛋白，将其置于高浓度尿素或盐酸胍中变性，然后稀释至不含变性剂的缓冲液中以诱导其发生聚集^23,13。通过检测在分.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NEB10-beta E. coli 细胞	新英格兰生物实验室	C3019I
氨苄青霉素	Gold Biotechnology	A-301-3
LB 肉汤混合物，Lennox	LAB Express	3003
IPTG	Gold Biotechnology	I2481C50
氯化钠	赛默飞世尔科技	S271-10
Tris	Amresco	0826-5kg
EDTA	赛默飞世尔科技	BP120-500
多粘菌素 B 硫酸盐	ICN Biomedicals Inc.	100565
0.2 µm 孔径无菌注射器滤器	Corning	431218
HiTrap Q HP（柱体积 5 ml）	GE Healthcare Life Sciences	17-1153-01
Mini-Protean TGX，15%	Bio-Rad	4561046
苹果酸脱氢酶（MDH）	罗氏	10127914001
磷酸二氢钾（一碱）	赛默飞世尔科技	BP362-500
磷酸氢二钾（二碱）	赛默飞世尔科技	BP363-1
F-4500 荧光分光光度计	日立	FL25
草酰乙酸	Sigma	O4126-5G
NADH	Sigma	N8129-100MG
磷酸二氢钠	Sigma	S9390-2.5KG
磷酸氢二钠	Sigma	S397-500
乳酸脱氢酶（LDH）	罗氏	10127230001
Beckman Proteome Lab XL-I 分析型超速离心机	贝克曼库尔特	392764
中心部件，12 mm，环氧树脂炭粉填充	贝克曼库尔特	306493
AN-50 Ti 转子，分析型，8 孔位	贝克曼库尔特	363782
Wizard Plus 质粒小提试剂盒	普洛麦格	A1470	用于质粒纯化（方案 5.1）
L-阿拉伯糖	Gold Biotechnology	A-300-500
甘氨酸	DOT Scientific Inc	DSG36050-1000
荧光比色皿	Hellma Analytics	119004F-10-40
寡核苷酸	英潍捷基
Phusion 高保真 DNA 聚合酶	新英格兰生物实验室	M0530S
dNTP 混合物	英潍捷基	10297018
盐酸	赛默飞世尔科技	A144-212
氢氧化钠	赛默飞世尔科技	BP359-500
Amicon Ultra 15 ml 3K NMWL	默克密理博	UFC900324
Avanti J-26XPI 离心机	贝克曼库尔特	393127
Varian Cary 50 分光光度计	安捷伦科技
Spectra/Por 1 透析膜，截留分子量：6 kDa	Spectrum Laboratories	132650
Amicon Ultra 离心滤膜装置 30K	默克密理博	UFC803024
SDS	赛默飞世尔科技	bp166-500
Veriti 96 孔 PCR 仪	赛默飞世尔科技	4375786