HCN通道与其辅助亚基之间的相互作用已被确定为重度抑郁症的治疗靶点。本文介绍了一种基于荧光偏振的方法，用于筛选该蛋白质-蛋白质相互作用的小分子抑制剂。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
识别HCN1与TRIP8b蛋白-蛋白相互作用的小分子抑制剂的方法
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
超极化激活的环核苷酸门控（HCN）通道在脑内广泛表达，其功能是调节神经元的兴奋性。在海马CA1区锥体神经元中，这些通道的亚细胞分布受到含四肽重复序列的Rab8b相互作用蛋白（TRIP8b）的调控，TRIP8b是一种辅助亚基。遗传学敲除HCN通道孔形成亚基或TRIP8b均会导致抗抑郁样行为增加，提示限制HCN通道功能可能对治疗重度抑郁症（MDD）具有潜在疗效。尽管HCN通道具有重要的治疗价值，但它们也在心脏中表达，并参与节律调节。为避免阻断心脏HCN通道带来的脱靶效应，本实验室近期提出可通过靶向HCN与TRIP8b之间的蛋白-蛋白相互作用，特异性地干扰HCN通道在脑内的功能。TRIP8b通过两个不同的结合位点与HCN孔形成亚基结合，本文重点关注TRIP8b的四肽重复序列（TPR）结构域与HCN1 C末端尾部之间的相互作用。本实验方案详细描述了一种纯化TRIP8b蛋白并开展高通量筛选以鉴定HCN与TRIP8b相互作用小分子抑制剂的方法。该高通量筛选方法基于荧光偏振（FP）检测技术，用于监测一个较大的TRIP8b片段与一段标记荧光基团的十一氨基酸肽（对应于HCN1 C末端尾部）之间的结合情况。该方法通过检测发射光偏振值的变化来识别“命中”化合物。随后进行验证实验，以确保这些“命中”化合物并非假阳性结果。
引言
超极化激活的环核苷酸门控（HCN）通道在心脏和中枢神经系统中表达，在调节膜兴奋性方面发挥重要作用1。研究表明HCN通道参与重度抑郁症（MDD）的发病机制2，因此多个研究团队提出，通过药物手段限制HCN通道功能可能成为治疗MDD的一种新策略3。然而，由于HCN通道在心脏动作电位中具有重要功能，直接靶向HCN通道并不可行4。伊伐布雷定是目前唯一经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的HCN通道拮抗剂，用于治疗心力衰竭，通过产生减慢心率的作用发挥疗效5。因此，亟需开发能够选择性在中枢神经系统中抑制HCN通道功能的药理学试剂。
含四肽重复序列的Rab8b相互作用蛋白（TRIP8b）是HCN通道的一种脑特异性辅助亚基，可调控HCN通道的表面表达与定位6,7。TRIP8b基因敲除会导致脑内HCN通道减少7，但不影响心脏中HCN的表达8。有趣的是，TRIP8b基因敲除小鼠在强迫游泳实验和悬尾实验中静止时间更短7，而这两种实验是常用于评估抗抑郁药效的筛选方法9-11。这些结果提示，与其直接使用小分子拮抗剂靶向HCN通道功能，不如干扰TRIP8b与HCN之间的相互作用，可能就足以产生类似抗抑郁的行为效应。
TRIP8b 在....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. TRIP8b (241-602) 蛋白的纯化
- 根据制造商说明，将含有TRIP8b（241-602）的质粒转入表达载体pGS213中，并转化至感受态E. coli细胞以进行蛋白表达。取300 µl菌液涂布于含5 µg/ml氯霉素和氨苄青霉素的Luria Broth（LB）琼脂平板上，37 °C培养16小时。
- 次日，挑取单菌落接种于50 ml含50 µg/ml氯霉素和氨苄青霉素的LB培养基中，37 °C振荡培养16小时。
- 将50 ml种子培养物加入1 L含50 µg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37 °C振荡培养。
- 当菌液OD600值达到0.8–1.2时，将培养温度调至18 °C，并加入IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）至终浓度1 mM，继续诱导蛋白表达16小时。
- 在4 °C条件下以6,000 × g离心15分钟收集E. coli菌体。离心结束后立即将离心管置于冰上，后续操作均需保持低温 。用36 ml Buffer A缓冲液（含0.25 mM苯甲基磺酰氟PMSF）重悬菌体沉淀。
- 将重悬的菌液置于冰上，使用平头探头进行超声破碎，总时长5–10分钟，高功率下交替进行30秒“开启”与30秒“关闭”。
- 在4 °C条件下以12,000 × g离心15分钟。若上清液仍不澄清，需 再离心15分....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
为避免与我们之前发表的文章产生版权问题，使用了 TAMRA 标记的探针 HCN1TAMRA 生成图 2和图 3。需要注意的是，这种替换对实验结果没有明显影响，且实验方案与上述使用 HCN1FITC 的方案完全相同。为评估与 HCN1TAMRA 的相互作用，按照步骤 2 中所述方案，将 TRIP8b (241-602) 逐步滴加至固定浓度的 HCN1TAMRA 中（图 2）。接着，进行步骤 3 中所述实验，将未标记的 HCN1 肽段逐步滴加至固定浓度的 TRIP8b (241-602) 和 HCN1TAMRA 混合物中（图 3）。
为验证该检测方法是否适用于高通量筛选，随后按照步骤4中的方案对其性能进行了考察，得.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
由于HCN通道在重度抑郁症（MDD）中具有作为治疗靶点的潜力24，针对中枢神经系统中HCN通道功能的拮抗性药物研究引起了广泛关注4。然而，由于HCN通道在心脏起搏中的重要作用以及引发心律失常的风险，相关研究进展受到阻碍25。我们推测，破坏HCN通道与其脑特异性辅助亚基TRIP8b之间的相互作用8，可能足以产生类似抗抑郁的效果，同时不影响心脏中的HCN通道功能3。这一假说得到了以下观察结果的支持：缺乏TRIP8b的小鼠表现出类似抗抑郁的行为7。因此，靶向该相互作用可能成为治疗MDD的一种新范式。
上述内容详细介绍了鉴定TRIP8b的TPR结构域与HCN1的C端三肽之间相互作用的小分子抑制剂的实验方案。为了促进该方法的广泛应用，本文进一步阐述了我们开发此检测方法背后的科学依据。尽管TRIP8b在两个位点与HCN亚基结合，我们的研究重点集中在TRIP8b的TPR结构域与HCN的C端尾部之间的相互作用。通过X射线晶体学对该相互作用的结构解析发现，TRIP8b的.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究工作得到了美国国立卫生研究院资助 R21MH104471 和 R01MH106511（D.M.C.）、脑科学研究基金会 SG 2012-01（D.M.C.）、西北大学临床与转化科学研究所 8UL1TR000150（Y.H.）、芝加哥生物医学联盟 HTS-004（Y.H. 和 D.M.C.）以及美国国立卫生研究院资助 2T32MH067564（K.L.）的支持。本研究的部分工作由西北大学药物与合成化学核心实验室（ChemCore）在分子创新与药物发现中心（CMIDD）完成，该中心由芝加哥生物医学联盟资助，并获得芝加哥社区信托基金的 Searle 基金以及美国国家癌症研究所授予的癌症中心支持基金 P30 CA060553（授予罗伯特·H·卢里综合癌症中心）的支持。高通量筛选工作在高通量分析实验室完成，该实验室也是罗伯特·H·卢里综合癌症中心的核心设施之一。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Ni-NTA 琼脂糖 | Qiagen | 30210 | |
| 透析盒 | ThermoFisher | 66456 | |
| 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 | Sigma-Aldrich | I5502 - 1 gr | |
| 384孔黑色板 | Corning | 3820 | |
| Proxiplate | Perkin-Elmer | 6008289 | |
| 抗GST受体珠 | Perkin-Elmer | 6760603C | |
| NiChelate | Perkin-Elmer | AS101D | |
| pGS21-a | Genscript | SD0121 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 10837091001 | |
| 考马斯亮蓝试剂盒 | ThermoFisher | 23200 | |
| 蛋白质浓缩器 | ThermoFisher | 88527 | |
| Perkin Elmer Enspire 多功能酶标仪 | Perkin-Elmer | #2300-001M | |
| BL21 (DE3) 感受态细胞 | Agilent | 200131 |
参考文献
- Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. Hyperpolarization-activated cation channels: from genes to function. Physiol Rev. 89 (3), 847-885 (2009).
- Shah, M. M. HCN1 channels: a new therapeutic target for depressive disorders? Sci Signal. 5 (2....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
