利用转座子系统从小鼠羊水细胞生成多能干细胞

摘要

本研究中，我们利用非病毒型转座子系统，从小鼠羊水细胞生成诱导性多能干细胞。

摘要

诱导性多能干细胞（iPS细胞）可通过不同方法强制表达特定转录因子，由小鼠和人类体细胞生成。本文中，我们利用非病毒转座子系统从小鼠羊水细胞诱导产生iPS细胞。所获得的所有iPS细胞系均表现出多能性细胞的特征，包括向三个胚层衍生物分化的潜能。 体外 和 体内这一策略为利用患病胎儿的细胞开发出生缺陷的新疗法提供了可能。

引言

产前诊断是评估遗传性疾病（例如染色体畸变、单基因或多基因/多因素疾病）和先天性畸形（例如先天性膈疝、囊性肺部病变、腹裂、脐膨出）的重要临床工具。羊水（AF）细胞可通过妊娠中期常规安排的操作（例如羊膜穿刺术、羊水减量术）或剖宫产手术轻松获取^1,2。来自产前或新生儿患者的羊水细胞的可获得性，为将其作为再生医学的来源提供了可能，已有若干研究人员探讨了利用从羊水中分离出的干细胞群体治疗不同组织损伤或疾病的可能性^{3,4,5,6,7,8,9,10,11,12}。在疾病常处于稳定状态的时间窗口内，从患病患者中便捷....

方案

所有操作均符合意大利法律。小鼠羊水（AF）样本取自妊娠13.5天（d.p.c.）的C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J转基因小鼠，该小鼠称为GFP小鼠。

1. 转座子制备

注意：转座子表达载体通过标准克隆程序构建。用于小鼠AF细胞转染的质粒DNA使用商业试剂盒制备。

1. 在1.5 ml微量离心管中，将10 ng质粒DNA与50 µl DH5α细菌混合。将微量离心管置于冰上孵育20分钟。
2. 42 °C热激40秒。
3. 将微量离心管放回冰上放置2分钟。
4. 加入250 µl预热（37 °C）的LB（Lysogeny Broth）培养基，于37 °C以300 rpm振荡培养30分钟。
5. 取每种转化产物30 µl涂布于含0.1 mg/ml氨苄青霉素的LB平板上。待平板干燥后，倒置并在37 °C过夜培养。
6. 次日下午，用无菌的200 µl枪头从每种转化产物中挑取3个单菌落，转移至含0.1 mg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中。
7. 于37 °C以300 rpm振荡培养过夜。
8. 使用商业质粒提取试剂盒进行质粒纯化。将纯化后的质粒于-20 °C保存。

2. 小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）培养

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结果

为评估重编程能力，从小鼠GFP胚胎中收集羊水细胞（AF细胞）。将细胞转染环状转座子质粒PB-tetO2-IRES-OKMS（该质粒以多西环素可诱导的方式表达与mCherry荧光蛋白连接的Yamanaka因子Oct4、Sox2、cMyc和Klf4）以及PB-CAG-rtTA质粒和转座酶表达质粒（mPBase）。在培养1周后，对小鼠AF细胞进行Oct4、Klf4、cMyc和Sox2的转染。 体外 在MEF饲养层上进行扩增。为了表达外源因子，转染后的第二天加入多西环素，浓度为 1.5 µg/mL，如先前所述³⁹mCherry 的表达在添加强力霉素 24 小时后可见，表明转染成功。在强力霉素诱导 20 天后出现首批具有胚胎干细胞样形态的克隆，于转染后 30 天进行挑取。这些克隆被接种至灭活的成纤维细胞饲养层上。挑取后，存活的克隆在添加强力霉素的培养基中继续传代数次，直至在重复孔中确认其不再依赖强力霉素³³.

讨论

选择何种方法诱导多能性，对于细胞在长期移植中的临床安全性具有重要意义。目前，已有多种适用于重编程的方法。在非整合性方法中，仙台病毒（Sendai virus, SeV）载体是一种RNA病毒，可在不整合到感染细胞核基因组的情况下产生大量蛋白质⁴⁰，因此可作为获取诱导性多能干细胞（iPS细胞）的一种策略。SeV载体可能是生成可用于转化研究的iPS细胞的理想候选方法之一，但也存在一些不足之处。该病毒的复制酶对转基因序列的性质较为敏感。由于SeV载体具有持续复制能力，即使采用多种策略来改善这一问题，仍难以从宿主细胞中彻底清除^41,42。该方法需要特殊的操作条件，例如需使用二级生物安全柜。目前仅有单一的商业供应商提供该载体。尚无可用于临床级别的SeV重编程工具，且iPS细胞的生产成本较高。

由于这些优势，与SeV载体相比，转座子系统可被视为一种更优的方法，本文证实该系统是一种适用于重编程小鼠羊水细胞的、具有多种优势的合适方法。该.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 mm 细菌级培养皿	BD Falcon	351029	用于 体外 分化
2-巯基乙醇	Sigma	M6250	用于小鼠羊水细胞、iPS-AF 细胞及分化培养基
Alexa568 标记的山羊抗小鼠 IgM	Thermo Fisher Scientific	A21043	二抗（免疫荧光）
Alexa594 标记的鸡抗山羊 IgG	Thermo Fisher Scientific	A21468	二抗（免疫荧光）
Alexa594 标记的鸡抗兔 IgG	Thermo Fisher Scientific	A21442	二抗（免疫荧光）
Alexa594 标记的山羊抗小鼠 IgG	Thermo Fisher Scientific	A11005	二抗（免疫荧光）
碱性磷酸酶试剂盒	Sigma	85L1	碱性磷酸酶 染色
氨苄青霉素	Sigma	A0166	用于细菌筛选
牛血清白蛋白	Sigma	A7906	BSA，用于封闭液，用 1× PBS 稀释
氯仿	Sigma	C2432	用于 RNA 提取
DH5α 细胞	Thermo Fisher Scientific	18265-017	用于克隆实验的细菌
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）	Thermo Fisher Scientific	41965039	用于 MEF、小鼠羊水细胞、iPS-AF 细胞及分化培养基
强力霉素	Sigma	D9891	用于外源因子表达
微量离心管（1.5 ml）	Sarstedt	72.706	用于 PB 制备
胚胎干细胞级胎牛血清	Thermo Fisher Scientific	10439024	用于小鼠羊水细胞、iPS-AF 细胞及分化培养基
胎牛血清	Thermo Fisher Scientific	10270106	用于 MEF 培养基
精细镊子	F.S.T	Dumont #5	羊水细胞分离
明胶	J.T.Baker	131	使用浓度为 0.1%，用 1× PBS 稀释
甘氨酸	Bio-Rad	161-0718	用于封闭液，用 1× PBS 稀释
哈瑞苏木素 QS	Vector Laboratories	H3404	细胞核染色
HE	Bio-Optica	04-061010	畸胎瘤组织学分析
Hoechst	Thermo Fisher Scientific	H3570	细胞核染色
马血清	Thermo Fisher Scientific	16050-122	用于封闭液
HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG	SantaCruz	sc2005	二抗（免疫过氧化物酶法）
ImmPACT NovaRED	Vector Laboratories	SK4805	过氧化物酶底物
带针头的胰岛素注射器（25 G）	Terumo	SS+01H25161	羊膜穿刺术操作
Klf4	SantaCruz	sc-20691	兔多克隆 IgG
L-谷氨酰胺	Thermo Fisher Scientific	25030	用于小鼠羊水细胞、iPS-AF 细胞及分化培养基
LB 肉汤（Lennox）	Sigma	L3022	用于细菌培养
LIF	Sigma	L5158	用于小鼠羊水细胞和 iPS-AF 细胞培养基
Matrigel	BD	354234	用于 体外 分化，用 DMEM 稀释至 1:10
甲醇	Sigma	32213	过氧化物酶封闭
MULTIWELL 24 孔板	BD Falcon	353047	用于 体外 分化
MULTIWELL 6 孔板	BD Falcon	353046	用于 MEF、小鼠羊水细胞和 iPS-AF 细胞培养
Nanog	ReproCELL	RCAB0002P-F	兔多克隆 IgG
非必需氨基酸	Sigma	M7145	用于小鼠羊水细胞、iPS-AF 细胞及分化培养基
正常山羊血清	Vector Laboratories	S2000	用于封闭液，用 1× PBS 稀释
NP-40	Sigma	12087-87-0	用于细胞通透化，用 1× PBS 稀释
Oct4	SantaCruz	sc-5279	小鼠单克隆 IgG2b
寡聚脱氧胸苷酸 [Oligo (dT)]	Thermo Fisher Scientific	18418012	用于 RT-PCR
多聚甲醛（溶液）	Sigma	441244	PFA，固定剂，用 PBS 稀释
PBS 10×	Thermo Fisher Scientific	14200-067	D-PBS，不含 Ca2+/Mg2+，用无菌水稀释至 PBS 1×
青霉素-链霉素	Thermo Fisher Scientific	15070063	用于 MEF、小鼠羊水细胞、iPS-AF 细胞及分化培养基
培养皿（150 mm）	BD Falcon	353025	用于 MEF 培养、组织培养
PiggyBac 转座酶表达质粒	由 Andras Nagy 教授实验室提供	-	mPBase
PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS 转座子质粒	由 Andras Nagy 教授实验室提供	-	PB-tetO2-IRES-OKMS
QIAprep Spin Maxiprep 试剂盒	Qiagen	12663	用于质粒纯化
QIAprep Spin Miniprep 试剂盒	Qiagen	27106	用于质粒纯化
反向四环素转录激活因子转座子质粒	由 Andras Nagy 教授实验室提供	-	rtTA
RNeasy Mini 试剂盒	Qiagen	74134	用于 RNA 提取
Sox2	SantaCruz	sc-17320	山羊多克隆 IgG
SSEA1	Abcam	ab16285	小鼠单克隆 IgM
SuperScript II 逆转录酶	Thermo Fisher Scientific	18064-014	用于 RT-PCR
T	Abcam	ab20680	兔多克隆 IgG
Taq DNA 聚合酶	Thermo Fisher Scientific	10342020	PCR
胰蛋白酶	Thermo Fisher Scientific	25300-054	细胞传代
吐温 X-100	Bio-Rad	161-047	用于细胞通透化，用 1× PBS 稀释
TRIzol 试剂	Thermo Fisher Scientific	15596-026	用于 RNA 提取
Tubb3	Promega	G712A	小鼠单克隆 IgG1
TWEEN-20	Sigma	P1379	用于细胞通透化，用 1× PBS 稀释
αfp	R&D Systems	MAB1368	小鼠单克隆 IgG1
αSMA	Abcam	ab7817	小鼠单克隆 IgG2a
转染试剂（FuGENE HD）	Promega	E2311	用于羊水细胞转染
体视显微镜	Nikon	SM2645	用于进行羊膜穿刺术
200 μl 吸头	Sarstedt	70.760012	用于挑取细菌菌落
剪刀	F.S.T	14094-11 不锈钢 25U	用于进行羊膜穿刺术
乙醇	Sigma	2860	用于清洁妊娠母鼠腹壁
组织培养用培养皿（150 mm）	BD Falcon	353025	用于 MEF 扩增
丝裂霉素 C	Sigma	M4287-2MG	用于 MEF 失活
MULTIWELL 96 孔板	BD Falcon	353071	用于 iPS-AF 细胞培养