本方案描述了使用真空稳定成像窗口，通过多光子显微镜对完整肺组织进行长期、高分辨率、单细胞水平的实时成像技术。
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本文内容
摘要
摘要
转移到肺、肝和骨等继发部位是一种创伤性事件，死亡率约为90% 1在这些部位中，肺部由于位于体内深处、组织脆弱且在维持正常生理功能中起关键作用，因此利用活体光学成像进行评估最为困难。尽管临床成像手段（如正电子发射断层扫描（PET）、磁共振成像（MRI）和计算机断层扫描（CT））能够无创地获取该组织的图像，但其分辨率不足以观察到最早期的定植事件，单个像素所代表的区域几乎包含近一千个细胞。目前关于肺转移定植的模型认为，肿瘤细胞到达肺部后的早期事件对其存活及后续增殖具有决定性作用。这意味着需要具备单细胞分辨率的实时活体成像技术 2 需要对播种细胞的表型进行定义并验证这些模型。尽管已采用多种方法对肺部进行高分辨率光学成像 离体 制备过程中，这些实验通常是单时间点检测，由于环境发生显著改变（温度、灌注、细胞因子），容易产生假象，可能导致错误结论 等等。) 由于从胸腔和循环系统中移除所导致的结果 3最近的研究表明，使用真空稳定成像窗口可实现对完整肺组织进行延时活体光学成像。 2,4,5 然而，典型的成像时间通常被限制在约6小时。本文介绍了一种利用此类窗口进行长达12小时的肺部活体长时程时间序列成像的实验方案。通过该方法获得的时间序列图像序列可实现对肺组织中细胞间相互作用、细胞膜动态变化以及血管灌注情况的可视化与定量分析。此外，我们还描述了一种图像处理技术，可前所未有地清晰呈现肺部微血管结构。
引言
高分辨率活体光学成像已被证明对于理解许多生物学过程至关重要，可实现对单细胞及亚细胞参数的测量与定量。在癌症研究中，对肿瘤细胞和间质细胞的活体成像揭示了多种仅存在于完整动物体内的微环境相互作用6-11。
利用单细胞分辨率光学成像技术揭示乳腺癌肿瘤细胞内渗及播散相关微环境的研究 体内 甚至为乳腺癌患者的预后及治疗反应带来了新的标志物 12-16目前可用于观察完整内部重要器官深部结构的最佳成像技术是临床成像手段（MRI、PET、CT），这些技术能够清晰显示整个器官的结构，并可在病理出现临床症状之前揭示病变。然而，由于缺乏单细胞分辨率，这些技术无法揭示转移的最早阶段以及驱动肿瘤进展的细胞机制。当肺转移灶在这些成像手段中可见时，通常已形成稳定且正在增殖的病灶。据估计，到达肺部的播散性肿瘤细胞中约有90%无法存活 17 或最初保持休眠状态 18，以及观察到它们到达的时间比先前预期的要早得多 19对肿瘤细胞到达远处部位并存活的最初阶段进行成像，对于理解转移性定植及肿瘤复发过程至关重要。
然而，在肺部进行此类观察已被证明极为困难；绝大多数成像研究采用的是离体（ex vivo）或肺组织外植体准备方法20-23，这些方法仅能提供肺部在单一时间点的图像信息。尽管这些样本制备方法....
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方案
本方案中描述的所有操作均遵循脊椎动物使用相关的指南和法规，并已事先获得阿尔伯特·爱因斯坦医学院机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 构建荧光标记的小鼠模型和肿瘤细胞
- 通过将 0.1 g 牛血清白蛋白（BSA）与 100 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）混合，制备 100 ml 的 0.1%（w/v）牛血清白蛋白/磷酸盐缓冲液（BSA/PBS）缓冲液。
- 通过稳定转染制备荧光标记的肿瘤细胞。
注：此处我们使用 E0771-LG 细胞，这是一种高度转移性的 E0771 小鼠乳腺腺癌细胞的衍生株37，该细胞系是从经尾静脉注射亲代 E0771 细胞的 C57BL/6 小鼠肺部转移性肿瘤中分离得到的38。- 转染前 24 小时，将 1 × 105 个 EO771-LG 细胞接种于含 2 ml 无抗生素的 10% 胎牛血清（FBS）DMEM（杜氏改良伊格尔培养基）的 60 mm 组织培养皿中，并在 37 °C、5% CO2 条件下培养。
- 转染时，将 2 µg 荧光蛋白载体与 10 µl 转染试剂在室温下孵育 30 分钟，随后加入 190 µl 低血清培养基。
- 用杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS）洗涤 EO771-LG 细胞一次，然后轻柔加入转染混合物。
- 在 37 °....
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结果
为了展示该方法可实现的实验结果类型，我们在不同时间点将表达荧光蛋白Clover的E0771-LG肿瘤细胞经尾静脉注射至MacBlue小鼠44体内。手术后，通过静脉注射155 kD罗丹明标记的葡聚糖以标记血管系统，并进行延时成像。
注射后24小时对小鼠进行成像时，可在血管内观察到单个细胞，其与巨噬细胞和单核细胞发生相互作用。图2A（补充视频1）展示了这一现象的实例。该图显示了一个孤立的肿瘤细胞（绿色）嵌顿于肺部血管内约12 µm深度处，连续成像5小时20分钟，期间该细胞与一个常驻巨噬细胞（青色）发生短暂相互作用。血管结构通过高分子量葡聚糖标记。成像稳定性良好，可连续获取该区域的z轴层扫图像，并进行三维重建（图2B，补充视频2）。
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讨论
高分辨率 体内 将光学成像与荧光标记的功能性标签（如蛋白质和抗体）相结合，极大地加深了我们对转移级联过程的理解。该技术实现了对肿瘤细胞、宿主细胞及其微环境中的单细胞和亚细胞参数进行直接可视化与定量分析。在原发性肿瘤内的成像研究已促成例如支持肿瘤生长、侵袭或播散的特定微环境的发现 6,7在发生侵袭的情况下， 体内 成像研究揭示了巨噬细胞与肿瘤细胞共迁移流在内渗过程中的优先作用 7,50.
在肺等继发部位，要了解肿瘤细胞在转移最早阶段（包括单个或少量肿瘤细胞到达并与血管内皮相互作用的微转移前定植阶段）的行为动态，必须借助高分辨率光学成像技术才能实现。常规临床成像方法无法提供足够的分辨率，以观察毛细血管网的精细结构或在单细胞水平上解析细胞的形态及其相互作用。本实验方案中介绍的成像技术能够完成这一具有挑战性的任务。
活体成像窗口，例如下所列 表1 相较于……具有显著优势 离体 通过维持适当的肺部生理状态，.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由NIH-CA100324、爱因斯坦国立癌症研究所癌症中心支持基金P30CA013330、JWP获得的R01CA172451以及综合成像项目资助。该技术在阿尔伯特·爱因斯坦医学院的格鲁斯-利珀生物光子学中心和综合成像项目中开发完成。我们感谢这些中心对本工作的支持。作者感谢爱因斯坦机械车间的Mike Rottenkolber、Ricardo Ibagon和Anthony Leggiadro提供的精湛且及时的工艺支持，感谢Matthew Krummel实验室慷慨分享其窗口设计图纸，感谢Kevin Elicieri和Jeremy Bredfeldt在显微镜技术方面的专业知识及其对放大器的选型建议，同时感谢Allison Harney和Bojana Gligorijevic提供的有益讨论。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 镀镍黄铜真空调节器 1/8 NPT 内螺纹，带压力表，0 - 20" Hg 真空 | McMaster Carr | 4172K12 | 真空调节器 |
| 用于 1/4 英寸的黄铜带刺软管接头适配器" 软管内径 X 1/8" NPTF 雄性管螺纹 | McMaster Carr | 5346K13 | 真空调节器软管接头 |
| Pyrex 品牌带支管抽滤瓶，瓶颈适配 4 号橡胶塞，容量：50 ml | 康宁生命科学玻璃 | 5360-50 | 真空瓶 |
| 圆形玻璃盖玻片，厚度 #1.5，0.16 - 0.19 mm，直径 10 mm | Ted Pella, Inc. | 260368 | 盖玻片 |
| Exel International 一次性安全型静脉导管；22 号 × 1 英寸 | Exel International | 26746 | 气管导管 |
| PERMA-HAND 黑色编织丝线缝合线，ETHICON LIGAPAK 分装卷轴，规格 2-0 | VWR | 95056-992 | 字符串 |
| 液体超级胶水，透明，0.14 盎司 | Hendel Corp. | LOC1647358 | 氰基丙烯酸酯胶水 |
| 四甲基罗丹明异硫氰酸酯–葡聚糖 | Sigma-Aldrich | T1287-500MG | 155 kD 葡聚糖 |
| 实验室透明Tygon PVC管，1/16英寸" ID，1/8" OD，1/32" 管壁厚度，25英尺长度 | McMaster Carr | 5155T12 | 细管 &和鲁尔接头管路 |
| 抗裂聚乙烯管，1/8英寸" 编号，1/4" OD，1/16" 管壁厚度：白色，50英尺长度 | McMaster Carr | 5181K24 | 厚壁管 |
| 脱毛乳液 | Nair | - | |
| 微小医用管路 95 邵氏硬度 LDPE | Scientific Commodities 公司 | BB31695-PE/1 | 尾静脉导管用导管 |
| 30 G × 1 英寸 BD PrecisionGlide 针头 | BD | 305128 | 尾静脉插管用针头 |
| Puritan 非无菌棉签 | Fisher Scientific | 867WCNOGLUE | |
| 透明聚碳酸酯带倒刺管接头，变径直通型，适用于3/32英寸管径" x 1/16" 管编号 | McMaster Carr | 5117k51 | 管路连接件 |
| 单孔橡胶塞 | Fisher Scientific | 14-135F | 真空瓶塞 |
| SHARP 精密屏障吸头，适用于 P-100，100 个装 µl | Denville Scientific Inc. | P1125 | 移液器吸头 |
| 实验室胶带 | Fisher Scientific | 159015R | |
| Puralube | Henry Schein 动物健康 | 008897 | 眼用软膏 |
| Gemini电凝套装 | 哈佛仪器 | 726067 | 电烙笔 |
| Graefe 显微解剖镊；带齿；微弯；0.8 mm 尖端宽度；4" 长度 | Roboz 外科手术器械 | RS-5135 | 镊子 |
| 超细显微解剖剪 4" 直型锐缘/锐缘 24 毫米 | Roboz Surgical | RS-5912 | 锋利的剪刀 |
| 微型解剖剪 4" 直型钝端/钝端 | Roboz 外科手术器械 | RS-5980 | 钝头剪刀 |
| 湿巾 | Fisher Scientific | 06-666-A | 固定装置 |
| PhysioSuite 系统 | Kent Scientific | PhysioSuite | 生命体征监护仪 |
| 1 ml 注射器，结核菌素滑动针头 | BD | 309659 | 注射器 |
| 氰基丙烯酸酯 | 订书钉 | LOC1647358 | 盖玻片粘合剂 |
| 凡士林 | Fisher Scientific | 19-086291 | 防水屏障 |
| 适配器鲁尔接头套管 1.5 - 2.2 毫米 | 哈佛仪器公司 | 734118 | 导管连接器 |
| PhysioSuite MouseSTAT 脉搏血氧仪 | Kent Scientific | 脉搏血氧仪 | |
| 异氟醚（异氟烷） | Henry Schein 动物健康 | 50033 | 250 ml |
| 氧气 | TechAir | OX TM | |
| 1x PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| PVC球阀，推入式连接，1/4英寸 | 格雷格纳 | 3CGJ7 | 真空阀 |
| 小型动物呼吸机 | 哈佛仪器 | 683 | 可选产品来自 Kent Scientific：MouseVent |
| OptiMEM 低血清培养基 | 赛默飞世尔科技 | 31985062 | |
| Lipofectamine 2000 转染试剂 | 赛默飞世尔科技 | 11668019 | |
| MacBlue 转基因小鼠 Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J | 杰克逊实验室 | 026051 | |
| 多光子显微镜 | Olympus | Fluoview FV1000 | 定制显微镜的替代方案 |
| 环境封闭装置 | 精密塑料 | FV1000用腔室 | 定制 enclosure 的替代方案 |
| 磷酸盐缓冲液 | 赛默飞世尔科技 | 14190136 | |
| 激光功率计 | 相干的 | FieldMaxIITOP | |
| 激光功率计探头 | 相干的 | PM10 | |
| pcDNA3-Clover 荧光蛋白载体 | Addgene | 40259 | |
| G418硫酸盐选择性抗生素 | 赛默飞世尔科技 | 10131027 | |
| MoFlo 荧光激活细胞分选仪 | 贝克曼库尔特 | XDP | |
| 胰蛋白酶EDTA 1x | 康宁 | 25-052-Cl | |
| 40 µm 网格 | Falcon | 352235 | |
| 96孔板 | Costar | 3599 | |
| 60 mm 培养皿 | 康宁 | 430196 | |
| 10 cm 培养皿 | 康宁 | 353003 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| 杜氏磷酸盐缓冲液 1× | 康宁 | 21-031-CV | |
| C57BL/6J 小鼠 | 杰克逊实验室 | 000664 | |
| Kim Wipes | Fisher Scientific | 06-666-A |
参考文献
- Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: a question of life or death. Nat Rev Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
- Entenberg, D., et al. Subcellular resolution optical imaging in the lung reveals early metastatic proliferation and motility. Intravital. 4....
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