方法文章

去传入神经小鼠视网膜平铺制备中星形细胞的膜片钳记录

DOI：

10.3791/54608

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2016年10月13日

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1Department of Ophthalmology, Baylor College of Medicine, 2Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Baylor College of Medicine

本文内容

摘要

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本方案演示了如何对平铺制备的视网膜神经元进行全细胞膜片钳记录。

摘要

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哺乳动物的视网膜是一种分层组织，由多种神经元类型构成。为了理解视觉信号在其复杂的突触网络中如何被处理，研究人员常采用电生理记录技术来研究单个神经元之间的连接。我们优化了一种用于小鼠视网膜平铺制备（flat-mount）的方法，以实现对GCL（神经节细胞层）和INL（内核层）中遗传标记神经元的膜片钳记录。与切片相比，平铺制备更有利于记录INL神经元，因为该方法能同时保留垂直和横向连接，从而可研究具有较大横向成分的视网膜神经环路。我们已利用该方法比较了视网膜中镜像配对神经元的反应，例如胆碱能星形无长突细胞（SACs）。

引言

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作为中枢神经系统中易于获取的一部分，视网膜数十年来一直是神经科学研究中的重要模型。通过对神经元进行遗传标记，研究人员得以详细表征视网膜中的突触连接。在众多可用于研究视网膜神经元功能与形态的方法中，膜片钳记录技术对我们当前理解视网膜中垂直传递信号起到了关键作用。这些信号起始于光感受器对光子的吸收，并通过视网膜神经节细胞（RGCs）的放电传递至脑部视觉中枢。尽管迄今为止已积累了大量知识，但血管化哺乳动物视网膜中的神经元多样性问题仍未解决，这阻碍了人们对支持正常视觉功能的视网膜环路的全面理解。部分原因在于，大多数记录是在视网膜切片上进行的，以牺牲横向环路完整性为代价，换取对更靠近中央区域的视网膜神经元的可及性1-3。因此，为了全面了解视网膜如何处理视觉信号，理想的方法是在视网膜平铺标本中记录神经元活动，以便更好地保存各种大小的横向连接。

当由于去极化双极细胞中代谢型谷氨酸受体6（mGluR6）信号通路缺陷4-6，或仅仅由于变性视网膜中光感受器丢失7-10，导致光感受器向双极细胞的突触传递中断时，许多视网膜神经节细胞（RGCs）会表现出振荡性活动。这些振荡来源于多种机制，但其中涉及AII型无长突细胞（AII-ACs）与去极化视锥双极细胞（DCBCs）之间缝隙连接耦合的机制受到最多关注，因而也最为明确1,7,11。我们发现另一种振荡来源，该机制在药理学阻断上述AII-AC/DCBC网络后仍持续存在，并可驱动去传入视网膜的RhoΔCTA和Nob小鼠中OFF型星形无长突细胞（SACs）产生振荡7,8,12。本文详细描述了用于内核层（INL）神经元记录的视网膜平铺制备方案。该方法利用商业化小鼠品系（Jax编号006410和007905），通过荧光蛋白（tdTomato）的表达标记胆碱能视网膜神经元，可在配备对比度增强光学系统的荧光显微镜下清晰识别。部分通过该方法获得的实验结果此前已有报道4,5,7,13。

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方案

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伦理批准——涉及动物受试者的实验程序均依照贝勒医学院机构动物护理和使用委员会批准的美国国立卫生研究院（NIH）关于实验动物研究的规章制度进行。

1. 外部溶液与内部溶液

  1. 在视网膜解剖过程中使用哺乳动物林格氏液，并在后续的电生理记录中将其作为胞外溶液。在记录当天，用10倍浓缩液（不含钙）配制哺乳动物林格氏液，并在通入碳酰气（95% O2 和 5% CO2）15分钟后逐滴加入CaCl2。最终的1倍溶液成分如下（单位为 mM）：120 NaCl、5 KCl、25 NaHCO3、0.8 Na2HPO4、0.1 NaH2PO4、2 CaCl2、1 MgSO4 和 10 D-葡萄糖。
  2. 使用两种胞内溶液来表征SAC振荡。在成年小鼠视网膜神经节细胞的长时间全细胞膜片钳记录中测试所配制溶液的有效性，并将验证合格的溶液分装为500 µl，于-20 °C保存备用。
    1. 记录膜电位振荡时，使用含钾的胞内溶液，其成分为（单位为 mM）：125 K-葡萄糖酸盐、8 NaCl、4 ATP-Mg、0.5 Li-GTP、5 EGTA、10 HEPES 和 0.2% 生物胞素（w/v）。用KOH调节pH至7.3。
    2. 记录兴奋性和抑制性突触后电流时，使用含铯的胞内溶液，其成分为（单位为 mM）：100 Cs-甲烷磺酸盐、8 NaCl、4 ATP-Mg、0.5 Li-GTP、5 EGTA、10 HEPES 和 0.2% 生物胞素（w/v）。用CsOH调节pH至7.3。

2. 记录当天的准备工作

  1. 为制备带有通孔的硝酸纤维素膜，使用由钝化的16 G注射器针头制成的定制打孔器手动打孔，并将膜置于两块干净的玻璃板之间压平。对于整体染色的视网膜，制作一个直径为0.2 mm的中心孔，并在其周围制作4个直径为1-1.2 mm的较大孔。
  2. 为制备用于向电极中加载内液的定制回填细丝，将10 µl移液器吸头在中部熔化，并轻轻拉长熔化部分直至其冷却并硬化。使用前，用干净的剃刀刀片修剪细丝，使其略长于膜片电极。
  3. 使用程序化拉制仪从带内丝的硼硅酸盐玻璃管中拉制膜片电极。微电极应在实验当天制备并立即使用。
    注意：记录SACs时，我们采用以下拉制仪参数：加热值：484；拉力：0；速度：25；延迟时间：1；压力：400，斜坡值为462。硼硅酸盐玻璃管的外径和内径分别为1.65 mm和1.0 mm。电极电阻为10-14 MΩ。
  4. 组织采集前1小时，将一管内液置于涡旋振荡器上振荡>30分钟以解冻。

3. 视网膜解剖

  1. 使用4%异氟烷与氧气混合气体麻醉动物，直至其对脚趾夹捏无反应。通过颈椎脱位法处死动物。
  2. 用直头虹膜剪在距视神经头1-2 mm处剪断两侧眼球的视神经。
  3. 将眼球在干净的纸巾上轻轻滚动以去除血液，随后浸入通有碳合气的哺乳动物林格液中。用23 G针头在角膜缘处打孔，并用显微剪沿角膜缘将眼球切成两半。用精细镊子移除角膜和晶状体。
    1. 对于视网膜铺片，用精细镊子轻轻将整个视网膜从色素上皮层剥离，并从边缘向视神经头方向做四个1.5-2 mm的正交切口。
  4. 将打孔的硝酸纤维素膜浸入培养皿中，用镊子或毛笔轻轻将视网膜（神经节细胞层朝上）拖过膜面。制备全视网膜铺片时，将视神经头对准膜中央的孔。将带有视网膜的膜转移至另一个干净的培养皿中。用细毛笔轻轻压平视网膜，使其呈马耳他十字状，并将四个边缘均覆盖在孔上。
    1. 若需分批检测视网膜部分区域，可用刀片将第3.3步制备的每个眼杯切成3-4块，保留色素上皮层附着。未使用的组织块应避光保存于通有碳合气的外部溶液中，并在12小时内使用。
  5. 用一片干燥滤纸吸去硝酸纤维素膜表面液体，并用镊子和毛笔小心去除玻璃体和内界膜。
  6. 在将整个装置转移至底部带有密封玻璃盖玻片的记录室之前，确保视网膜所有边缘均牢固贴附于膜上。用真空脂将膜固定在盖玻片上，并用外部溶液重新水化视网膜。注意避免装置下方困住气泡。
  7. 将记录室置于直立显微镜载物台上。以约每分钟3 ml的流速，向记录室灌注温热（34-35 °C）且通有碳合气的外部溶液。
  8. 先用10倍物镜观察视网膜，再使用60倍水浸物镜在微分干涉差（DIC）和/或落射荧光模式下观察神经节细胞层（GCL）和内核层（INL）的神经元。为观察表达tdTomato的星形无长突细胞（SACs），使用白色LED光源，配合554 nm激发滤光片和581 nm发射滤光片。

4. 来自平铺视网膜的全细胞膜片钳记录

  1. 通过注射器滤器将内液过滤至定制的后填充细管中。
  2. 将细丝插入新拉制的微移液管中，并在尖端附近注入内液，直至溶液覆盖银电极丝 >5 mm。将微移液管固定在带有吸力杆的电极夹持器上，通过推动或拉动与管道相连的10 ml塑料注射器的活塞，调节电极内部压力。
  3. 在物镜下找到移液管，并将其下降至距视网膜约100 µm的位置。在电流跟随模式（I = 0）下，使用直流偏移将静息直流电压信号调零。在电流钳模式下测量移液管电阻（I夹钳通过移液管向浴液中注入固定振幅的方波电流，以确定接入电阻（Raccess）模式，然后旋转Raccess旋钮以抵消差值。根据欧姆定律，利用Raccess旋钮上的读数计算移液管电阻。
  4. 缓慢将电极移至视网膜上方约10 µm处。对电极施加正压。观察当电极接近视网膜时，移液管尖端附近反射光的变化。迅速但轻柔地将移液管推入神经节细胞层（GCL），并立即降低正压。
  5. 将移液管移向标记的神经元，避免接触其他神经元、血管以及Muller细胞的终足。如需防止电极堵塞，可施加更大的正压。
  6. 将移液管尖端置于标记神经元的中线附近，直至观察到凹陷。释放正压，使细胞膜回弹至移液管尖端。
  7. 向移液管施加20至120 pA的负电流，以促进吉欧姆封接的形成。必要时施加轻柔负压，使细胞膜吸入移液管内。封接形成后等待5分钟，再破裂细胞膜，以便通过灌流清除溢出的胞内溶液。通过轻柔抽吸破裂膜片。
  8. 膜破裂后，在电流钳模式下，打开桥式平衡，并使用 Raccess 旋钮进行调节。
    注意：对于SAC这类较小的细胞，只需进行轻微调整（如有必要）。或者，可在电压钳模式下记录兴奋性和抑制性突触后电流（V夹钳）分别将细胞钳制在氯离子的反转电位（约 -75 mV）和谷氨酸的反转电位（约 0 mV）下。如需要，检查并调整移液管位置，以应对视网膜和/或显微操作器偶尔发生的漂移。
  9. 为记录药理学处理前、处理中和处理后的膜电位或电流变化，准备突触阻断剂（例如， CNQX、AP5、荷包牡丹碱、筒箭毒碱 等等。）和通道调节剂（例如， 氟吡汀、多巴胺、甲氯芬那酸等药物在实验当天从冷冻储备液中新鲜配制，使用含碳合气的任氏液（Ringer's solution）稀释，并通过灌流方式以批次给药。
  10. 记录完成后，轻柔地将移液管从细胞体上移开。将组装结构从记录室转移至一个干净的培养皿中。将视网膜从原硝酸纤维素膜上剥离，并重新贴附于另一张无打孔的展平硝酸纤维素膜上，以确保固定过程中视网膜的平整性。
  11. 将视网膜浸入4%多聚甲醛中，在室温下固定30分钟。从硝酸纤维素膜上取下视网膜，并用1×PBS充分漂洗。在4 °C条件下，用含0.4% Triton X-100的1×PBS稀释的染料标记链霉亲和素对记录的细胞进行过夜染色，以显示其形态。14将视网膜组织置于抗荧光淬灭剂中封片，并使用扫描共聚焦显微镜观察记录的细胞。
    注意：涉及挥发性且有毒的多聚甲醛的操作应在通风橱中进行，以确保安全。

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结果

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去传入小鼠视网膜中ON型和OFF型星形无长突细胞（SACs）的代表性记录如图1所示。通过tdTomato荧光可可靠地识别位于内核层（INL）和节细胞层（GCL）的胆碱能细胞，并在微分干涉差（DIC）显微镜下对其进行全细胞膜片钳记录（图1A），以揭示其膜电位的振荡（上排迹线）以及驱动该振荡的突触电流（下排迹线，图1B）。在电压钳制条件下，分别将细胞钳制在0 mV和-75 mV时，可分别记录到抑制性和兴奋性突触电流（图1B，下排迹线）。通过事后（post hoc）对细胞内透析的生物胞素进行链霉亲和素染色，可观察到SAC典型的树突分支形态及其在内丛状层（IPL）中的分层分布（图1C）。通过计算功率谱密度，可对膜电位波动和突触后电流变化的节律性及频率进行量化分析。利用药理学阻断或无阻断条件，可区分介导膜电位振荡的不同突触机制7。

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讨论

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许多实验室已采用视网膜平铺制备法对颗粒层（GCL）神经元进行过记录15-18，而我们的实验流程可实现对内核层（INL）神经元的记录。在此我们强调几个对成功实现常规记录至关重要的步骤。

视网膜的新鲜程度和平整度对于记录电极的穿刺至关重要。在这一方面，视网膜与打孔硝酸纤维素膜的牢固贴附尤为关键，可通过短暂吸收溶液后及时再水化实现（步骤3.4–3.6）。在此短暂时间内（通常少于30秒），玻璃体表现为松软的凝胶状，可被剥离。与已发表的多种需在溶液中手动去除玻璃体的方法相比，本技术效率更高。17,19 或通过酶的作用18,20另一种常用的方法是使用空的膜片电极尖端，逐个细胞地撕除内界膜21,22我们未采用撕裂法，以免造成视网膜脱落。然而，在剥离略呈透明且具有凝胶状特性的玻璃体时，有时仍可能导致视网膜从硝酸纤维素膜上移位。因此，该步骤需要熟练操作，因为视网膜在硝酸纤维素膜上的稳定附着对于记录内核层（INL）神经元至关重要。一个良好的操作实践是使用充分展平且完全水化的硝酸纤维素膜。此处值得注意的是可记录区域面...

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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感谢 Joung Jang 和 Xin Guan 提供的技术支持。感谢弗吉尼亚联邦大学的 Rory McQuiston 博士帮助我们搭建首个膜片钳装置，并对实验流程提供了建议。感谢 Samuel Wu 博士在电压钳记录方面的建议。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为 EY013811、EY022228，以及一项视力核心资助 EY002520。C-KC 是贝勒医学院 Alice R. McPherson 视网膜研究基金会设立的冠名讲席教授。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
带微分干涉相衬（DIC）的固定式显微镜OlympusBX51-WI
微操纵器SutterMP-225
膜片钳放大器A-M SystemAM2400
模数转换器National InstrumentNI-USB-6221
加热控制器Warner InstrumentTC-324B
串联加热器Warner InstrumentSC-20
蠕动泵RaininDynamax
移液管拉制仪Sutter InstrumentP-1000
带灯丝玻璃管King Precision Glass定制
刺激器A.M.P.I.Master-8
生物胞素SigmaB4261
NaClSigmaS6191
KClSigmaP5405
NaHCO3FisherBP328-1
Na2HPO4SigmaS0876
Na2HPO4SigmaS5011
CaCl2SigmaC5670
MgSO4SigmaM1880
D-葡萄糖SigmaG6152
K-葡糖酸盐SigmaG4500
ATP-MgSigmaA9187
Li-GTPSigmaG5884
EGTASigmaE0396
HEPESSigmaH4034
KOHSigmaP5958
甲磺酸铯SigmaC1426
CsOHSigma232041
注射器滤器Nalgene171
1 ml 注射器Rainin17013002
10 μl 移液器吸头Genesee Scientific24-130RL
链霉亲和素-488ThermoFisherS-11223
10x PBSLonza17-517Q

参考文献

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tdTomato

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