本方案演示了如何对平铺制备的视网膜神经元进行全细胞膜片钳记录。
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摘要
摘要
哺乳动物的视网膜是一种分层组织，由多种神经元类型构成。为了理解视觉信号在其复杂的突触网络中如何被处理，研究人员常采用电生理记录技术来研究单个神经元之间的连接。我们优化了一种用于小鼠视网膜平铺制备（flat-mount）的方法，以实现对GCL（神经节细胞层）和INL（内核层）中遗传标记神经元的膜片钳记录。与切片相比，平铺制备更有利于记录INL神经元，因为该方法能同时保留垂直和横向连接，从而可研究具有较大横向成分的视网膜神经环路。我们已利用该方法比较了视网膜中镜像配对神经元的反应，例如胆碱能星形无长突细胞（SACs）。
引言
作为中枢神经系统中易于获取的一部分，视网膜数十年来一直是神经科学研究中的重要模型。通过对神经元进行遗传标记，研究人员得以详细表征视网膜中的突触连接。在众多可用于研究视网膜神经元功能与形态的方法中，膜片钳记录技术对我们当前理解视网膜中垂直传递信号起到了关键作用。这些信号起始于光感受器对光子的吸收，并通过视网膜神经节细胞（RGCs）的放电传递至脑部视觉中枢。尽管迄今为止已积累了大量知识，但血管化哺乳动物视网膜中的神经元多样性问题仍未解决，这阻碍了人们对支持正常视觉功能的视网膜环路的全面理解。部分原因在于，大多数记录是在视网膜切片上进行的，以牺牲横向环路完整性为代价，换取对更靠近中央区域的视网膜神经元的可及性1-3。因此，为了全面了解视网膜如何处理视觉信号，理想的方法是在视网膜平铺标本中记录神经元活动，以便更好地保存各种大小的横向连接。
当由于去极化双极细胞中代谢型谷氨酸受体6（mGluR6）信号通路缺陷4-6，或仅仅由于变性视网膜中光感受器丢失7-10，导致光感受器向双极细胞的突触传递中断时，许多视网膜神经节细胞（RGCs）会表现出振荡性活动。这些振荡来源于多种机制，但其中涉及AII型无长突细胞（AII-ACs）与去极化视锥双极细胞（DCBCs）之间缝隙连接耦合的机制受到最多关注，因而也最为明确1,7,11。我们发现另一种振荡来源，该机制在药理学阻断上述AII-AC/DCBC网络后仍持续存在，....
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方案
伦理批准——涉及动物受试者的实验程序均依照贝勒医学院机构动物护理和使用委员会批准的美国国立卫生研究院（NIH）关于实验动物研究的规章制度进行。
1. 外部溶液与内部溶液
- 在视网膜解剖过程中使用哺乳动物林格氏液，并在后续的电生理记录中将其作为胞外溶液。在记录当天，用10倍浓缩液（不含钙）配制哺乳动物林格氏液，并在通入碳酰气（95% O2 和 5% CO2）15分钟后逐滴加入CaCl2。最终的1倍溶液成分如下（单位为 mM）：120 NaCl、5 KCl、25 NaHCO3、0.8 Na2HPO4、0.1 NaH2PO4、2 CaCl2、1 MgSO4 和 10 D-葡萄糖。
- 使用两种胞内溶液来表征SAC振荡。在成年小鼠视网膜神经节细胞的长时间全细胞膜片钳记录中测试所配制溶液的有效性，并将验证合格的溶液分装为500 µl，于-20 °C保存备用。
- 记录膜电位振荡时，使用含钾的胞内溶液，其成分为（单位为 mM）：125 K-葡萄糖酸盐、8 NaCl、4 ATP-Mg、0.5 Li-GTP、5 EGTA、10 HEPES 和 0.2% 生物胞素（w/v）。用KOH调节pH至7.3。
- 记录兴奋性和抑制性突触后电流时，使用含....
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结果
去传入小鼠视网膜中ON型和OFF型星形无长突细胞（SACs）的代表性记录如图1所示。通过tdTomato荧光可可靠地识别GCL和INL中的胆碱能细胞，并在微分干涉差（DIC）显微镜下对其进行全细胞膜片钳记录（图1A），从而揭示其膜电位的振荡（上部迹线）以及驱动该振荡的突触电流（下部迹线，图1B）。在电压钳制条件下，分别将细胞钳制在0 mV和-75 mV，可分别揭示抑制性和兴奋性突触电流（图1B，下部迹线）。通过细胞内灌注生物胞素后进行post hoc链霉亲和素染色，可观察到SAC典型的树突分支形态及其在内丛状层（IPL）中的分层分布（图1C）。通过计算功率谱密度，可对膜电位波动和突触后电流变化的节律性及频率进行量化。利用药理学阻断或无阻断条件，可区分膜电位振荡背后的不同的突触机制7。
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讨论
许多实验室已采用视网膜平铺制备法对颗粒层（GCL）神经元进行过记录15-18，而我们的实验流程可实现对内核层（INL）神经元的记录。在此我们强调几个对成功实现常规记录至关重要的步骤。
视网膜的新鲜程度和平整度对于记录电极的穿刺至关重要。在这一方面，视网膜与打孔硝酸纤维素膜的牢固贴附尤为关键，可通过短暂吸收溶液后及时再水化实现（步骤3.4–3.6）。在此短暂时间内（通常少于30秒），玻璃体表现为松软的凝胶状，可被剥离。与已发表的多种需在溶液中手动去除玻璃体的方法相比，本技术效率更高。17,19 或通过酶的作用18,20另一种常用的方法是使用空的膜片电极尖端，逐个细胞地撕除内界膜21,22我们未采用撕裂法，以免造成视网膜脱落。然而，在剥离略呈透明且具有凝胶状特性的玻璃体时，有时仍可能导致视网膜从硝酸纤维素膜上移位。因此，该步骤需要熟练操作，因为视网膜在硝酸纤维素膜上的稳定附着对于记录内核层（INL）神经元至关重要。一个良好的操作实践是使用充分展平且完全水化的硝酸纤维素膜。此处值得注意的是可记录区域面.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Joung Jang 和 Xin Guan 提供的技术支持。感谢弗吉尼亚联邦大学的 Rory McQuiston 博士帮助我们搭建首个膜片钳装置，并对实验流程提供了建议。感谢 Samuel Wu 博士在电压钳记录方面的建议。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为 EY013811、EY022228，以及一项视力核心资助 EY002520。C-KC 是贝勒医学院 Alice R. McPherson 视网膜研究基金会设立的冠名讲席教授。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 带微分干涉相衬（DIC）的固定式显微镜 | Olympus | BX51-WI | |
| 微操纵器 | Sutter | MP-225 | |
| 膜片钳放大器 | A-M System | AM2400 | |
| 模数转换器 | National Instrument | NI-USB-6221 | |
| 加热控制器 | Warner Instrument | TC-324B | |
| 串联加热器 | Warner Instrument | SC-20 | |
| 蠕动泵 | Rainin | Dynamax | |
| 移液管拉制仪 | Sutter Instrument | P-1000 | |
| 带灯丝玻璃管 | King Precision Glass | 定制 | |
| 刺激器 | A.M.P.I. | Master-8 | |
| 生物胞素 | Sigma | B4261 | |
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| NaHCO3 | Fisher | BP328-1 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S0876 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S5011 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| MgSO4 | Sigma | M1880 | |
| D-葡萄糖 | Sigma | G6152 | |
| K-葡糖酸盐 | Sigma | G4500 | |
| ATP-Mg | Sigma | A9187 | |
| Li-GTP | Sigma | G5884 | |
| EGTA | Sigma | E0396 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| 甲磺酸铯 | Sigma | C1426 | |
| CsOH | Sigma | 232041 | |
| 注射器滤器 | Nalgene | 171 | |
| 1 ml 注射器 | Rainin | 17013002 | |
| 10 μl 移液器吸头 | Genesee Scientific | 24-130RL | |
| 链霉亲和素-488 | ThermoFisher | S-11223 | |
| 10x PBS | Lonza | 17-517Q |
参考文献
- Choi, H., et al. Intrinsic bursting of AII amacrine cells underlies oscillations in the rd1 mouse retina. J Neurophysiol. 112 (6), 1491-1504 (2014).
- Gregg, R. G., et al.
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重印与许可
