快速获取三维图像的高分辨率表面荧光显微技术

摘要

我们介绍了一种利用高分辨率显影显微镜获取小鼠胚胎三维（3D）图像的详细方案。该改进方案采用改良的组织制备方法，以增强荧光染料的渗透性，从而允许对大小不同的样本进行形态计量分析。

摘要

高分辨率表层显微成像（HREM）技术能够快速获取高分辨率的数字化体积数据和三维（3D）形态测量数据。本文中，我们描述了对完整小鼠胚胎进行成像的详细实验方案。该方案主要包括四个主要步骤：样品制备、包埋、图像采集以及最终的三维可视化。该技术要求样品使用荧光染料染色，但对于较大或较致密的样品，染色可能难以渗透。为克服这一限制，我们改进了现有方案，通过在染色前使用含尿素和十二烷基硫酸钠的溶液对样品进行预处理，以增强染料在组织中的渗透能力。本方案仅需常规实验室设备和试剂，易于在标准实验室环境中推广应用。我们证明，所获得的高分辨率三维图像能够真实再现小鼠胚胎内部器官的精细形态特征，从而支持形态测量学分析。综上，我们提供了一种使用常规实验室设备获取小型和大型样品高分辨率三维图像的详细且优化的实验方案。

引言

3D成像技术的出现为系统分析胎儿发育过程中详细的形态学特征提供了可能。目前已有多种3D成像方式可供选择，包括显微磁共振成像（micro-MRI）、显微计算机断层扫描（micro computed tomography）、高频超声、光学相干断层扫描、光学投影断层成像以及表层显微镜技术^1-4。每种成像方式在分辨率、对比度、成像速度、成本、子宫内（in utero）应用能力及可及性方面均具有各自独特的特点。

表面荧光成像（EFIC）和高分辨率表面显微技术（HREM）是两种表面显微成像方法⁴。在此类技术中，高分辨率的连续图像直接从组织块表面持续获取，而非来自切片后的组织样本。所获得的图像能够真实反映精细的形态学特征，且几乎不存在或仅有轻微的组织形变。获取的三维数据可直接转换为适用于精确形态测量分析的高分辨率三维图像。由于成本相对较低且分辨率高，HREM 和 EPIC 已成为系统评估人类出生缺陷小鼠模型的优选替代方法^2,4-8。

EFIC 和 HREM 方法均需要将样本包埋在合适的介质中。EFIC 检测来自包埋组织的自发荧光。因此，该方法仅限于具有较强自发荧光的样本，而不适用于自发荧光较弱的样本，例如早期胚胎⁹。为了克服对自发荧光的依赖，HREM 成像中通常使用荧光染料（如伊红）对样本进行染色。染料和染色方法的选择也使 HREM 更适合在组织结构和形态背景下检测分子信号^4,10。

本文介绍了一种改进的高分辨率表型成像（HREM）方案，适用于晚期小鼠胚胎的全身评估。为了促进染色效果，我们在流程中增加了一个预处理步骤以增强组织通透性，从而实现对较晚期小鼠胚胎的HREM成像。

方案

所有动物实验均经波士顿儿童医院机构动物照护与使用委员会批准。

1. 样品制备

1. 定时交配
   1. 将一只 C57Bl6 野生型雄鼠与一只雌鼠共同放入同一笼中。
   2. 次日清晨检查是否形成交配栓。交配栓（又称阴道栓或交配栓）是一种硬化凝胶状沉积物，可阻塞阴道。
   3. 将发现交配栓的当天定为胚胎发育第 0.5 天（e0.5）。
2. 小鼠胚胎的分离
   1. 采用 CO₂ 窒息法处死怀孕雌鼠。
   2. 将小鼠仰卧置于吸水垫上，并用 70% 乙醇喷洒腹部区域。
   3. 提起皮肤，使用手术剪在腹部尾侧区域做一约 5 mm 的初始切口。剪开并移除腹部皮肤，充分暴露内脏器官。
   4. 在靠近阴道处剪断，取出整个子宫。
   5. 沿子宫角在着床部位之间进行切割。每个片段或胚体应仅包含一个胚胎。
   6. 将子宫片段置于 1× 冰冷磷酸盐缓冲液（PBS）中保存。
3. 胚胎解剖
   1. 在体视显微镜下，将每个胚体分别置于盛有冰冷 PBS 的培养皿中。
   2. 使用精细解剖镊依次去除子宫组织、胎盘及胎儿膜。
   3. 使用大口径移液器将解剖后的胚胎转移至含有 1× 冰冷 PBS 的 50 ml 离心管中。避免直接用镊子夹取胚胎，以尽量减少组织损伤。
4. 固定
   1. 将解剖后的胚胎置于 10% 中性缓冲福尔马林溶液中，在 4 °C 下固定超过 24 小时，固定液体积至少为样本体积的 10 倍。
5. 预处理
   1. 配制透明溶液：在双蒸水中加入 4 M 尿素、10% 甘油和 4% 十二烷基硫酸钠（SDS）。
   2. 用透明溶液替换固定液。
   3. 将样本置于摇床上，室温下轻柔振荡 1 至 2 周。在第 2 天和第 3 天各更换一次透明溶液。样本将逐渐变得透明且半透明。
   4. 用 10% 福尔马林替换透明溶液，并在摇床上继续振荡 2 天。
6. 脱水
   1. 用 1× PBS 洗涤预处理后的样本，每次 5 分钟，共洗 3 次。
   2. 在温和振荡条件下，于室温下使用递增浓度的乙醇系列进行脱水。对于 E15.5 胚胎，依次使用 50%、60%、70%、80%、85%、90%、95% 和 100% 乙醇，每步 2 小时。对于更晚期的胚胎，需延长孵育时间。
7. 染色
   1. 配制染色液：将 0.1375 克伊红 Y 二钠盐和 0.0275 克吖啶橙半（氯化锌）盐溶于 50 ml 100% 乙醇中，搅拌 2 小时，用滤纸过滤。室温保存，并用铝箔包裹避光。
   2. 将样本转移至染色液中，染色 1 小时。
   3. 更换新鲜染色液，继续染色过夜。
8. 浸透
   1. 配制浸透液：取 100 ml JB-4 包埋试剂盒中的溶液 A，加入 1.25 g 催化剂 C、0.275 g 伊红 Y 二钠盐和 0.055 g 吖啶橙半（氯化锌）盐，于冰浴中搅拌混合（200 rpm）2 小时，然后用滤纸过滤。
   2. 将浸透液储存于 4 °C，用铝箔包裹避光保存。
   3. 将胚胎转移至浸透液与染色液按 1:1 混合的溶液中，在 4 °C 摇床上孵育至少 3 小时。
   4. 将胚胎转移至纯浸透液中，在低温室摇床上继续孵育 3 小时。
   5. 每天更换一次浸透液，并在低温室中于轻柔振荡条件下继续孵育三天。

2. 包埋

1. 将溶液B和渗透溶液置于冰上。
2. 包埋前立即配制包埋溶液（按溶液B与渗透溶液1:25的比例混合）。
3. 将样品在包埋模具中定向，然后轻轻倒入冷的包埋溶液至模具中。如有需要，可用细针重新调整样品方向。
4. 用细针检查包埋溶液是否已完全凝固。推出样品块，必要时进行修整。
5. 使用独立的模具重新定向样品块，以获得横切方向。
6. 将样品块夹持器置于包埋模具上方，轻轻向模具中倒入包埋溶液，直至模具和块夹持器完全浸没于包埋溶液中。
7. 将样品置于次级容器中，在通风橱内冰上静置3–4小时。
8. 将凝固后的样品储存于4 °C环境中。
9. 剥离包埋模具，将样品块置于解剖显微镜下，采用斜射照明观察样品在块中的位置，并在块的表面围绕样品标记网格线。
10. 以标记的网格线为参考，修去多余的包埋材料。

3. 图像采集

1. 将样本块夹紧在切片机上并获得一个新鲜的切削面。设置切片厚度（例如，e9.5-10.5，1.5 µm；e11.5-12.5，2.0 µm；e13.5-15.5，2.5 µm；e16.5及以后，3 µm）。将样本/包埋块保持在切片机的初始位置。
2. 将体视变倍显微镜水平放置，使其镜头朝向样本的包埋面。
3. 打开计算机和显微镜，启动图像采集软件。
4. 在体视显微镜下观察并聚焦至组织块表面 "实时观察" 成像软件的模式
5. 必要时调整显微镜和切片机，使组织块表面位于视野中心。
6. 调整放大倍数，使整个切块表面位于取景器视野范围内。
7. 选择绿色荧光蛋白（GFP）滤光片（激发波长470 ± 20 nm，二向色镜495 nm，发射波长525 ± 25 nm），必要时重新对焦。
8. 手动测量并设置曝光时间（例如， 80 - 400 毫秒
9. 每次新鲜切片后获取切面图像，并在可能的情况下自动保存图像。
10. 记录重要参数，包括分辨率、切片厚度和缩放倍数。
11. 完成整个样本后，如有必要，导出所有图像文件并将其转换为 JPEG 格式。
12. 使用图像处理软件将所有原始图像反转，并调整亮度和对比度。
13. 将所有处理后的图像保存在单独的文件夹中。

4. 三维可视化

1. 按照说明将所有处理后的图像上传至3D可视化软件。
2. 输入分辨率和切片厚度，以将所有图像转换为体数据（即， 体素大小）并保存三维文件。
3. 使用自动模式对齐所有图像。如有需要，可手动调整单个图像。
4. 将对齐后的图像保存为新的文件名。
5. 使用3D可视化软件分析样本的形态计量特征。

结果

我们已报道了小鼠胚胎在 e9.5 至 e13.5 期间的高质量 HREM 图像⁸。然而，由于荧光染料伊红的组织穿透能力有限，晚期胚胎的图像质量显著下降。为了提高染色效率，我们测试了多种适用于荧光成像的预处理方法¹¹。具体而言，对 e15.5 小鼠胚胎分别采用 Sca/e A2¹² 或全组织 CUBIC¹³ 进行处理。我们还测试了简化配方——透明化溶液（4 M 尿素、10% 甘油和 4% 十二烷基硫酸钠）。所有预处理方法均提高了染色效率。经透明化溶液处理 1 周后，胚胎变得半透明，且未检测到明显的组织损伤。预处理后的胚胎经过脱水、染色和浸润等步骤，随后包埋于塑料包埋介质中。按照上文第 3 节（图像采集）所述方法，对包埋样本进行 HREM 图像采集，并使用三维可视化软件进行显示。e15.5 胚胎整体封片表面观的一个示例展示了皮肤的精细形态特征，包括胡须垫和正在发育的毛囊（图 1）。虚拟切片视图的分辨率与组织学切片相当（图 2

讨论

本文介绍了一种改进的实验方案，利用常规实验室设备获取连续的高分辨率显微光学切片断层成像（HREM）图像，适用于复杂结构的快速三维可视化与形态计量分析。由于高分辨率图像是直接从组织块表面获取，而非来自单个切片，因此精细的形态学特征得以保留，并可在三维可视化软件中快速进行数字化重建。

三维成像在可视化和理解复杂形态特征方面具有显著优势。大多数三维成像技术依赖于专用设备^1-4。相比之下，EFIC和HREM成像仅使用常规实验室设备，包括配备数码相机的体视显微镜和切片机¹⁴。显微镜与切片机的功能耦合可实现整个图像采集过程的自动化。然而，我们已证明功能耦合并非必需⁸。取而代之的是，我们将体视显微镜水平安装，使其镜头正对标准切片机在静止限位位置时的组织块断面。这种简单装置的主要局限在于HREM图像必须手动采集。据估算，平均每张图像采集耗时约5秒。另一局限是单幅图像可能从一个位置偏移至另一位置，但在三维重建过程中可轻松重新对齐，因此该问题并不显著。

利用HREM技术，我们分析了...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小鼠	杰克逊实验室	C57BL/6
乙醇	Pharmco-Aaper	111000200	200 证明，无水，ACS/USP/犹太认证级
甲醛溶液	Sigma	HT501128-4L
尿素	Sigma	U5128	澄清液
甘油	Fisher Scientific	G33-4	澄清溶液
十二烷基硫酸钠	Invitrogen	15525-017	澄清溶液
伊红Y二钠盐	Fisher Scientific	BP241925	渗透溶液
吖啶橙半（氯化锌）盐	Sigma	A6014	渗透溶液
沃特曼滤纸	通用电气	3030-153
JB-4 包埋试剂盒 - A 液	Polysciences, Inc.	0226A-800	渗透溶液
JB-4 包埋试剂盒 - 溶液 B	Polysciences, Inc.	0226B-30	包埋剂
JB-4 嵌入试剂盒 - 催化剂	Polysciences, Inc.	02618-12	渗透溶液
包埋模具	Polysciences, Inc.	23185-1	16 x 8 毫米
Peel-A-Way 快速包埋模具	Polysciences, Inc.	18986-1	22 mm × 22 mm 方形，截角为 12 mm × 12 mm
JB-4 塑料块状样品架	Polysciences, Inc.	15899
一次性刻度移液管	VWR	414004-014
培养皿	VWR	25384-088	胚胎解剖
不锈钢镊尖	ROBOZ	RS-5015	胚胎解剖
格劳弗组织镊	ROBOZ	RS-5153	胚胎解剖
精细手术剪	ROBOZ	RS-6700	胚胎解剖
14 ml 聚丙烯圆底管	Falcon	352059
50 ml 聚丙烯锥形管	Falcon	352098
冰桶	Magic Touch Iceware International Corp.	R19-343
100 ml（3.4 oz.）防静电聚苯乙烯称量皿	VWR	89106-766
330 ml（11.2 盎司）防静电聚苯乙烯称量皿	VWR	89106-770
氯化钠	MP Biomedicals	102892	PBS 溶液
氯化钾	Sigma	P0662	PBS 溶液
磷酸二氢钾	Sigma	P5405	PBS 溶液
七水合磷酸氢二钠	Sigma-Aldrich	S9390	PBS 溶液
数码相机	滨松光子学	C11440-10C
切片机	Leica	RM2265
照明器	卡尔·蔡司	HXP 200C
荧光体视变倍显微镜	卡尔·蔡司	Axio Zoom.V16
体视显微镜	Olympus	SZX16
光纤光源	Leica	KL 1500 LCD
一次性切片刀	VWR	95057-832
单边分配器	Personna	62-0330-0000
ZEN	卡尔·蔡司	pro 2012
Photoshop	Adobe	CS6 v13.0
Amira 3D 软件	Visage Imaging	5.4
计算机	Dell T7600，2 块 900 GB SAS 硬盘和 64 GB DDR3 RDIMM 内存
摇床平台振荡器	VWR	40000-304
标准加热板搅拌器	VWR	12365-382
分析天平	梅特勒-托利多	AB54-S