制备及在体内使用基于活动的探针对ñ -acylethanolamine酸酰胺酶

Summary

这里，我们描述一个基于活动的探针的制备和使用（ARN14686，十一碳-10- ynyl- -N - [（3 S）-2-代氮杂环丁烷-3-基]氨基甲酸），允许的检测和定量促炎酶ñ-acylethanolamine酸酰胺酶的活性形式（NAAA）， 在体外和离体 。

Abstract

基于活动的蛋白谱（ABPP）是用于通过使用靶向酶的活性位点的化学探针的识别在复杂蛋白质组感兴趣的酶的方法。导入探针A记者标记允许通过在凝胶荧光扫描，蛋白质印迹，荧光显微镜，或液相色谱 - 质谱法检测标记的酶。这里，我们描述了制备和使用所述化合物ARN14686的，基于活动点击化学探针（CC-ABP），其选择性识别酶Ñ-acylethanolamine酸酰胺酶（NAAA）。 NAAA是半胱氨酸水解酶，通过去激活内源性过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）-α激动剂如十六酰胺乙醇（PEA）和油酰乙醇酰胺（OEA）促进炎症。 NAAA被合成为一个无效的全长酶原，由autoproteolysis在溶酶体的酸性pH激活。定位研究ħ表明NAAA在巨噬细胞等单核细胞衍生的细胞在B淋巴细胞中表达，以及AVE。我们提供的ARN14686如何能够被用来检测和通过蛋白质印迹和荧光显微镜量化活性NAAA 离体啮齿动物组织的例子。

Introduction

常用的方法来研究的表达模式，交互和蛋白质的功能，包括用于鸟枪分析^1,2，酵母液相色谱-质谱平台双杂交方法^3,4和体外测定法，是有限的，因为它们是无法评估在其天然状态的蛋白质的活性。基于活动的蛋白谱（ABPP）可以用来填补这一空白。在这种方法中，小分子探针能够共价结合到所关注的酶的活性位点被偶联至一个报告基团，其允许目标检测。使用点击化学（CC），记者可以集成到探针或之后发生^5,6-靶接合可以引入。后者程序需要使用含有适当的化学基团，探针如末端炔或叠氮化物，其可以与许多记者试剂经由SUC生物正交反应改性H作为铜（Ⅰ）催化胡伊斯根[3 + 2]环加成^7-9或Staudinger连接^10,11。

最近，我们公开的化合物ARN14686作为第一ABP为在体外和半胱氨酸水解酶，NAAA ¹²的体内检测。 NAAA催化饱和和单不饱和的FAE，包括油酰乙醇酰胺（OEA）和十六酰胺乙醇（PEA），这是抗炎核受体^PPAR-α13-15的内源性激动剂的水解失活。 NAAA在巨噬细胞等单核细胞衍生的细胞主要表达，以及在B淋巴细胞^14,16，这表明在先天免疫应答的调节作用。所述酶在粗面内质网中合成的非活性形式和通过自我蛋白酶机构¹⁷中....

Protocol

注意:所有的化学反应，应在通风橱和使用实验室工作服，手套和护目镜进行。该反应应在氮气环境中也进行。

伦理声明:我们涉及动物的程序符合有关动物用于实验和其他科学目的（DM 116192）和欧共体法规的保护意大利规定执行（EC的OJ L一分之三百五十八1986年12月18日）。

注:合成[（3 S）-2-代氮杂环丁烷-3-基]乙酸铵是用于大规模收率描述（50克N-CBZ- L-丝氨酸），但是它可以很容易地按比例缩小。

1.合成

注:参见图1的合成反应方案。

1. 2-吡啶基十一碳-10-炔基酯和制备十一碳-10-炔基-2-氧代吡啶-1-甲酸叔丁酯
   1. 在50毫升圆底烧瓶中，溶解350毫克的十一碳10炔-1-醇3.5毫升无水二氯甲烷。
   2. 在1.1.1的溶液中，加入25毫克的4二甲氨基吡啶（DMAP）和530毫克2- dipyridylcarbonate（DPC）的。搅拌在室温下（RT）的混合物16小时。
   3. 加入20毫升二氯甲烷。
   4. 将混合物转移到分液漏斗中。加入15ml水，摇匀，让两相分离。
   5. 打开活塞，收集有机相（底部），然后关闭水龙头。加入15mL饱和_碳酸氢钠溶液中。摇动分液漏斗，并让两相分离。重复此步骤两次。
   6. 用Na ₂ ....

Results

ARN14686是基于NAAA抑制剂ARN726的支架设计。 ARN726的4-丁基环己基用C 9饱和脂族链带有终端炔标签（ 图1）被取代。炔标签是为了允许使用两步标记过程的添加荧光团或通过CC一个生物素分子引入。这一功能使得ARN14686一个非常通用的工具，以探测NAAA 在体外和体内 。

这里，我们显示ARN14686的两个应用程序，这是代表该分子的潜在的; 图2是此处报道的实验步骤的方案。探针的静脉给药后，有两个不同的检测方法可以用于:i）在蛋白印迹活性NAAA表达的分析，和ii）通过fluorescenc细胞内活性NAAA表达和定位的分析显微术。

第一个代表性的结果，最近我们小组^29日

Discussion

酶活性是在不同的层次，包括RNA转录，蛋白质合成，蛋白质易位，翻译后修饰，和蛋白质 - 蛋白质相互作用精细调节。通常，酶表达单独不占它的活性。 ABPP的开发是为了研究在其天然状态的蛋白质的活性。两个特征是必需的:共价地结合到感兴趣的酶和记者标签的活性位点的化学探针来检测探针标记的酶。

探针设计与合成的过程的关键点。探针必须具有对其靶足够亲和力和选择性。此外，记者标签的存在必须不影响目标交战。这个问题主要是由一个两步ABP，其中，所述目标已经陷入后引入记者标签的设计克服。无标签的探针特别适用于在体内研究，在这种蛋白质活性可以在活细胞或生物体，以最少的外部改变进行评估。该NAAA探头ARN14686旨在满足上述要求。的β内酰胺是基于与β内酰胺类NAAA抑制剂^16,26的事先得到的结果选择反应弹头。这些化合物通过共价键结合到酶的催化半胱氨酸抑制NAAA以有效和选择性的方式。此外，被证明是全身性活性¹⁶的化合物。我们介绍了C9饱和脂族链，考虑到NAAA的增加的亲和力的长脂肪链。添加了一个末端炔允许两步标记。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,1'-磺酰基二咪唑	Sigma Aldrich	367818	有害
2-二吡啶基碳酸酯	氟化学	11331	有害
2-甲基丁烷	Sigma Aldrich	M32631	易燃、有毒、对水生环境有害
4-（二甲氨基）吡啶	Sigma Aldrich	107700	有毒
乙酸	Sigma Aldrich	695092	易燃、腐蚀性
乙腈	Sigma Aldrich	34998	易燃、有毒
活性炭	Sigma Aldrich	161551
氯化铵	Sigma Aldrich	A9434	有害
叠氮化物-PEG3-生物素	Jena Biosciences	CLK-AZ104P4
叠氮化物-PEG3-Fluor 545	Jena Biosciences	CLK-AZ109
BCA 蛋白检测试剂盒	ThermoFisher Scientific	23227
生物离心柱	Biorad	732-6204
生物素	Sigma Aldrich	B4501
封闭缓冲液	Li-Cor Biosciences	927-40000
β-巯基乙醇	Sigma Aldrich	M6250	毒性
强牛文血清白蛋白 （BSA）	Sigma Aldrich	A7030
溴酚蓝	Sigma Aldrich	B0126
Bruker Avance III 400	Bruker
Celite	Sigma Aldrich	419931	健康危害
Ceric 硝酸铵	Sigma Aldrich	22249	氧化性、有害
的水合氯醛	Sigma Aldrich	C8383	剧毒
CuSO4.5H2O	Sigma Aldrich	209198	有毒
环己二烯	Sigma Aldrich	125415	易燃，对健康有害
己烷	Sigma Aldrich	34855	易燃，有害，健康危害，环境危害
二氯甲烷	Sigma Aldrich	34856	有害，健康危害
二乙醚	Sigma Aldrich	296082	易燃，有害
的二甲基亚砜 （DMSO）	Acros 有机物	348441000
二甲基亚砜 d6 （DMSO-d6）	Sigma Aldrich	175943
乙醇	Sigma Aldrich	2860	易燃，有害
乙酸乙酯	Sigma Aldrich	34858	易燃，有害
甘油	Sigma Aldrich	G5516
Irdye 680-LT 链霉亲和素	Li-Cor Biosciences	925-68031
IRDye680-LT 链霉亲和素	Licor	925-68031	使用前短暂离心以沉淀蛋白质复合物
甲醇	Sigma Aldrich	34966	剧毒
甲醇	Sigma Aldrich	34860	易燃、有毒、健康危害
N-（3-二甲氨基丙基）-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐	Sigma Aldrich	E7750	有害、腐蚀性
N<>-二异丙基乙胺	Sigma Aldrich	D125806	易燃、腐蚀性、有毒
N-二甲基甲酰胺	Sigma Aldrich	227056	易燃、有害、健康危害
N-Cbz-L-丝氨酸	荧光化学	M03053	有害
Nikon A1 共聚焦显微镜	Nikon		阅读用户手册
NuPAGE 4-12% Bis-Tris 凝胶	Thermo Fisher Scientific	NP0335BOX
碳上钯	Sigma Aldrich	330108
p-茴香胺	Sigma Aldrich	A88255	毒性、健康危害、环境危害
多聚甲醛	sigma Aldrich	441244	有毒、对呼吸道有害、腐蚀性、易伪造
聚乙二醇	含 DAPI 的 Sigma Aldrich	P3265
ProLong Gold 抗淬灭封片剂	Thermo Fisher Scientific	P36931	避免气泡形成
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma Aldrich	P8340
碳酸氢钠	Sigma Aldrich	S6014
十二烷基硫酸钠 （SDS）	Sigma Aldrich	L3771	有毒、腐蚀性、易伪造
的氢化钠	Sigma Aldrich	452912	易燃
硫酸钠	Sigma Aldrich	239313
Starion FLA-9000 免疫扫描仪	FUJIFILM		阅读  用户手册
链霉亲和素琼脂糖	Thermo Fisher Scientific	20349
蔗糖	Sigma Aldrich	S7903
叔丁醇	Sigma Aldrich	360538	有毒，易燃
四氢呋喃	Sigma Aldrich	186562	易燃，有害，对健康有害
Thiourea	Acros 有机物	424542500	有毒，温度在50°C;C 溶解
Tris	Sigma Aldrich	RDD008
三（2-羧乙基）膦 （TCEP）	Sigma Aldrich	C4706
Tris[（1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基）甲基]胺 （TBTA）	Sigma Aldrich	678937
Triton-x100	Sigma Aldrich	X100	有毒
吐温-20	Sigma Aldrich	P9416
Tween-80	Sigma Aldrich	P1754
Ultra turrax IKA T18 碱性组织匀浆器	IKA
Undec-10-yn-1-ol	Fluorochem	13739	有害
尿素	Sigma Aldrich	U5378	有毒，在 50 °C 下温暖;C 溶解