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方法文章

制备与 在体实验 使用基于活性的探针 N酰基乙醇胺酸性酰胺酶

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DOI：

10.3791/54652

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2016年11月23日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Drug Discovery and Development, Istituto Italiano di Tecnologia, 2Departments of Anatomy and Neurobiology, Pharmacology, and Biological Chemistry, University of California, Irvine School of Medicine

本文内容

摘要

本文介绍了活性依赖性探针（ARN14686，十一碳-10-炔基-N-[(3S)-2-氧杂氮杂环丁烷-3-基]氨基甲酸酯）的制备与使用方法，该探针可用于体外（in vitro）和离体（ex vivo）条件下检测并定量炎症相关酶N-脂肪酸乙醇胺酸性水解酶（NAAA）的活性形式。

摘要

基于活性的蛋白质谱分析（ABPP）是一种利用靶向酶活性位点的化学探针，在复杂蛋白质组中鉴定目标酶的方法。通过在探针中引入报告标签，可借助凝胶内荧光扫描、蛋白质印迹、荧光显微镜或液相色谱-质谱联用技术对标记的酶进行检测。本文描述了化合物ARN14686的制备及其应用，该化合物是一种基于点击化学的活性探针（CC-ABP），可选择性识别N-酰基乙醇胺酸性水解酶（NAAA）。NAAA是一种半胱氨酸水解酶，通过失活内源性过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）-alpha激动剂（如棕榈酰乙醇胺（PEA）和油酰乙醇胺（OEA））促进炎症反应。NAAA最初合成的是无活性的全长前体酶，其在溶酶体的酸性pH环境中通过自蛋白水解被激活。定位研究表明，NAAA主要在巨噬细胞及其他单核细胞来源的细胞以及B淋巴细胞中表达。我们提供了应用ARN14686在啮齿类动物组织中通过蛋白质印迹和荧光显微镜进行ex vivo检测和定量活性NAAA的实例。

引言

常用于研究蛋白质表达模式、相互作用及功能的方法，包括用于鸟枪法分析的液相色谱-质谱联用平台1,2，酵母双杂交方法3,4，以及 体外 检测方法在评估蛋白质天然状态下的活性方面存在局限性。基于活性的蛋白质分析（activity-based protein profiling, ABPP）可用于弥补这一不足。该方法利用能够共价结合目标酶活性位点的小分子探针，并将其与报告基团偶联，从而实现对靶标的检测。通过点击化学（click chemistry, CC），报告基团可被直接整合至探针中，或在探针与靶标结合后引入5,6后者操作需要使用含有适当化学基团（如末端炔烃或叠氮化物）的探针，这些基团可通过生物正交反应（例如Cu(I)催化的Huisgen [3+2]环加成反应）与多种报告分子试剂进行修饰。7-9 或施陶丁格连接反应10,11.

最近，我们公布了化合物 ARN14686 作为首个针对 ABP 的探针 体外 和 体内 NAAA（N-乙酰氨基葡糖苷酶）的半胱氨酸水解酶活性检测12NAAA 催化饱和及单不饱和脂肪酸乙醇酰胺（FAEs）的水解失活，包括油酰乙醇酰胺（OEA）和棕榈酰乙醇酰胺（PEA），后者是抗炎核受体 PPAR-α 的内源性激动剂。13-15NAAA 主要在巨噬细胞和其他单核细胞来源的细胞以及 B 淋巴细胞中表达。14,16，表明其在调控先天免疫反应中具有作用。该酶在粗面内质网中以非活性形式合成，并在细胞的酸性区室中通过自蛋白水解机制被激活17自催化裂解产生一个新的 N末端半胱氨酸（小鼠和大鼠为C131，人类为C126），是负责FAE水解的亲核基团18,19药理学抑制NAAA活性会改变FAE的合成/降解平衡，导致细胞内FAE水平升高16,20,21多种β-内酯和β-内酰胺衍生物已被证明可高效且高选择性地抑制NAAA活性16,22-26这些抑制剂通过以下方式发挥作用 S-催化性半胱氨酸的酰化16,27,28.

化合物 ARN14686 是基于具有全身活性的丝氨酸衍生β-内酰胺类 NAAA 抑制剂 ARN726（4-环己基丁基-N-[(S)-2-氧代氮杂环丁烷-3-基]氨基甲酸酯)16. ARN726中的4-丁基-环己基被替换为带有末端炔基标签的C9饱和脂肪链，以便后续与含叠氮报告标签的分子进行碳-碳偶联反应。我们选择设计两步法的活性探针，以尽可能减少对原始骨架结构的修饰，从而保持探针对NAAA的亲和力。此外，由于避免引入大体积的标记基团，此类探针可能更适用于 体内 治疗效果优于直接的ABP。ARN14686以高活性抑制NAAA（hNAAA IC₅₀）50 = 6 nM，rNAAA IC50 通过与酶的催化半胱氨酸形成共价加合物（= 13 nM）12在活体大鼠实验中发现，该探针能够选择性捕获肺部表达的NAAA。当使用高浓度探针（10 µM）时，另一种与NAAA具有33-34%序列同源性的半胱氨酸酰胺酶——酸性神经酰胺酶，也被鉴定为低亲和力作用靶点。 体外，10 mg/ml 静脉注射，i.v.)12我们还使用 ARN14686 研究了在给予完全弗氏佐剂（CFA）后，炎症大鼠组织中是否存在有活性的 NAAA29.

此处，我们概述了一种制备 ARN14686 的方案（图1及其在NAAA激活机制研究中的应用 离体以一个实验为例，我们描述了在大鼠足爪注射CFA后，通过探针标记可视化NAAA的实验流程。该实验中，在静脉注射探针后提取足爪组织中的蛋白质，将探针标记的蛋白质组进行生物素-叠氮化物的点击化学反应（CC）。利用链霉亲和素磁珠富集生物素标记的样品，并进行蛋白质印迹分析。在另一项应用中，我们描述了通过荧光显微镜对经探针处理的小鼠肺组织中具有活性的NAAA进行定位。在此情况下，组织被切片后，切片进行点击化学反应以偶联罗丹明荧光染料。工作流程示意图如图所示。 图2.

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方案

注意：所有化学反应均应在通风橱中进行，并穿戴实验服、手套和防护眼镜。反应还应在氮气环境中进行。

伦理声明：我们涉及动物的实验操作均依照意大利关于实验及其他科学用途动物保护的法规（D.M. 116192）以及欧洲经济共同体法规（O.J. of E.C. L 358/1 12/18/1986）进行。

注意：文中所述[(3S)-2-氧代氮杂环丁烷-3-基]铵乙酸盐的合成适用于大规模制备（使用50 g N-Cbz-L-丝氨酸），但也可轻松缩小规模。

1. 合成

注意：合成反应路线图见图1。

  1. 2-吡啶基十一碳-10-炔基碳酸酯和十一碳-10-炔基-2-氧代吡啶-1-羧酸酯的制备
    1. 在50 ml圆底烧瓶中，将350 mg十一碳-10-炔-1-醇溶于3.5 ml干燥的二氯甲烷中。
    2. 向1.1.1中的溶液中加入25 mg 4-二甲氨基吡啶（DMAP）和530 mg 2-联吡啶基碳酸酯（DPC）。室温（RT）下搅拌混合物16小时。
    3. 加入20 ml二氯甲烷。
    4. 将混合物转移至分液漏斗中，加入15 ml水，振荡，静置使两相分离。
    5. 打开活塞，收集有机相（下层），然后关闭活塞。加入15 ml饱和NaHCO₃溶液3溶液。振荡分液漏斗并静置，使两相分离。重复此步骤两次。
    6. 用 Na 干燥有机相2SO4, 用棉花过滤至已去皮重的圆底烧瓶中，并在减压条件下蒸发至干燥（使用旋转蒸发仪）。
    7. 称量烧瓶，称取600 mg油状物，其为2-吡啶基十一碳-10-炔基碳酸酯与十一碳-10-炔基-2-氧代吡啶-1-羧酸酯按1.7:1比例组成的混合物。
      1H NMR（400 MHz，DMSO-d6) 主要组分 δ = 8.39 (dd, J = 5.0, 2.0, 1H), 7.98 (td, J = 7.9, 2.0, 1H), 7.40 (ddd, J = 7.2, 4.9, 0.9, 1H), 7.30 (d, J = 8.2，1H），4.22（t， J = 6.6, 2H), 2.73 (t, J = 2.4, 1H), 2.18 - 2.11 (m, 2H), 1.76 - 1.62 (m, 2H), 1.50 - 1.23 (m, 12H)
      1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）次要组分 δ = 7.74 （dd， J = 7.2, 1.9, 1H), 7.47 (dd, J = 6.7, 2.3, 1H), 6.44 (d, J = 9.4, 1H), 6.30 - 6.25 (m, 1H), 4.35 (t, J = 6.5，2H），2.72（t， J = 2.4, 1H), 2.18 - 2.11 (m, 2H), 1.77 - 1.60 (m, 2H), 1.52 - 1.20 (m, 12H)
    8. 直接使用该油，无需进一步分离或纯化。
  2. [(3S)-2-氧代氮杂环丁烷-3-基]铵乙酸盐
    1. 苯甲基 N-[(S)-1-(羟甲基)-2-[(4-甲氧基苯基)氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸酯
      1. 在4 L圆底烧瓶中，溶解141.5 g p1.5 L 四氢呋喃和 0.5 L 二氯甲烷中的-茴香胺
      2. 将溶液置于冰浴中冷却至 0 °C。
      3. 加入50.0 g的 N-Cbz-L-丝氨酸和43.9克 N-(3-二甲基氨基丙基)-N′盐酸乙基碳二亚胺
      4. 在0 °C下用磁力搅拌子搅拌混合物30分钟。
      5. 从冰浴中取出溶液，在室温下用磁力搅拌子搅拌16小时。
      6. 在减压条件下蒸发溶剂（使用旋转蒸发仪）。
      7. 加入400 ml 1:1的环己烷/乙酸乙酯，用刮勺搅拌，然后倾析。
      8. 重复步骤1.2.1.7两次。
      9. 将胶状残留物溶于500 ml乙酸乙酯中，依次用400 ml 0.1 M HCl溶液（洗涤10次）和400 ml饱和NaHCO₃溶液洗涤3 溶液（2次），再用400 ml盐水洗涤。
      10. 用 Na 干燥有机相2SO4，将溶液经棉花过滤至已去皮重的圆底烧瓶中，并在减压条件下（使用旋转蒸发仪）蒸发至干燥。
      11. 称量烧瓶，得到61.4 g白色固体。
        1H NMR（400 MHz，DMSO-d6δ = 9.86（宽单峰，1H），7.52（双峰，2H，J = 9.0 Hz），7.42–7.25（多重峰，6H），6.91–6.85（多重峰，2H），5.06（双峰，1H，J = 12.9 Hz），5.02（双峰，1H，J = 12.9 Hz），4.98（三重峰，1H，J = 5.6 Hz），4.24–4.15（多重峰，1H），3.72（单峰，3H），3.70–3.57（多重峰，2H）。
    2. 苯甲基 N-[(S)-1-(4-甲氧基苯基)-2-氧代-氮杂环丁烷-3-基]氨基甲酸酯
      1. 溶解 58.6 g 的 N-[(S)-1-(羟甲基)-2-[(4-甲氧基苯基)氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸酯溶于1.6 L N,N-二甲基甲酰胺
      2. 将溶液用冰浴冷却至 0 °C。
      3. 加入50.6 g 1,1'-磺酰基二咪唑，用磁力搅拌子搅拌30分钟。
      4. 将溶液用冰/氯化钠浴冷却至 -20 °C，分批加入 10.2 g 氢化钠（60% 矿物油分散液）。
      5. 在 -20 °C 下搅拌混合物 1 小时，然后加入 2 ml 甲醇和 1 L 水终止反应。
      6. 真空过滤沉淀物，用200 ml水洗涤，并在真空条件下干燥。
      7. 获得 42.2 g 白色固体。
        1H NMR（400 MHz，DMSO-d6δ = 8.08（d，1H，J = 8.5 Hz），7.42–7.28（m，5H），7.30（d，2H，J = 8.9 Hz），6.95（d，2H，J = 8.9 Hz），5.06（s，2H），4.86（ddd，1H，J = 8.5，5.6，2.6 Hz），3.90（t，1H，J = 5.6 Hz），3.73（s，3H），3.55（dd，1H，J = 5.6，2.6 Hz）。
    3. 苯甲基的制备 N-[(S)-2-氧代氮杂环丁烷-3-基]氨基甲酸酯
      1. 将9.0 g苯甲基悬浮 N-[(S)-1-(4-甲氧基苯基)-2-氧代氮杂环丁烷-3-基]氨基甲酸酯溶于500 ml乙腈和400 ml水中的溶液。
      2. 将溶液置于冰浴中冷却至 0 °C。
      3. 分批加入45.4 g硝酸铈铵，用时45分钟，于0 °C下用磁力搅拌子搅拌15分钟。
      4. 加入500 ml饱和NaHCO₃溶液3 小心加入溶液，然后加入500 ml乙酸乙酯。
      5. 过滤沉淀物，并用200 ml乙酸乙酯洗涤。
      6. 分离双相溶液，并用200 ml乙酸乙酯洗涤水相（3次）。
      7. 用 Na 干燥有机相2SO4加入5 g活性炭，通过硅藻土硅胶垫过滤，并在减压条件下（旋转蒸发仪）蒸发至干燥。
      8. 加入乙醚，用刮刀搅拌。
      9. 过滤固体，得到4.85 g白色至浅黄色固体。
        1H NMR（400 MHz，DMSO-d6δ = 7.97（d，1H，J = 8.7 Hz），7.94（bs，1H），7.42–7.30（m，5H），5.05（s，2H），4.67（ddd，1H，J = 8.7，5.4，2.7 Hz），3.40（t，1H，J = 5.4 Hz），3.09（dd，1H，J = 5.4，2.7 Hz）。
    4. [(的制备S)-2-氧代氮杂环丁烷-3-基]-铵乙酸盐
      1. 将0.93 ml乙酸溶解于245 ml乙酸乙酯中。标记此溶液为 "捕获溶液"
      2. 溶解 3.28 g 苄基-N-[(R)-2-氧代氮杂环丁烷-3-基]氨基甲酸酯溶于298 ml乙醇中。
      3. 加入14.1 ml环己二烯和3.27 g 10% 负载型钯碳催化剂。
      4. 室温下搅拌悬浮液12小时，然后通过一层短柱硅藻土过滤。将洗脱液直接倒入捕集溶液中。
      5. 在减压条件下（旋转蒸发仪）蒸除溶剂，温度保持在35 °C以下。
      6. 用四氢呋喃洗涤所得固体，得到1.72 g白色固体。
        1H NMR（400 MHz，DMSO-d6δ = 7.68（宽单峰，1H），3.99（双二重峰，1H，J = 5.2，2.4，1.2 Hz），3.32（三重峰，1H，J = 5.2 Hz），2.79（双二重峰，1H，J = 5.2，2.4 Hz），1.90（单峰，3H）。
  3. 十一碳-10-炔基的制备N-[(3S)-2-氧代氮杂环丁烷-3-基]氨基甲酸酯
    1. 在10 ml圆底烧瓶中，溶解60 mg的[(3S)-2-氧代氮杂环丁烷-3-基]铵乙酸盐溶于2 ml干燥的二氯甲烷中。
    2. 将溶液在冰浴中冷却至 0 °C，然后加入 81 µl 的 N,N二异丙基乙胺逐滴加入。
    3. 将含有十一碳-10-炔基-2-氧代吡啶-1-甲酸酯的粗混合物350 mg溶于2 ml干燥的二氯甲烷中，加入溶液，室温下搅拌15小时。减压下（旋转蒸发仪）蒸干溶剂。
    4. 使用自动柱色谱仪，通过柱色谱法（硅胶）进行纯化：
      1. 将样品吸附于硅胶上，用环己烷平衡色谱柱，然后将样品加载至层析柱中。
      2. 用环己烷/乙酸乙酯（比例从100:0到0:100）进行洗脱，并将洗脱峰收集至试管中。
      3. 在减压条件下（旋转蒸发仪）将对应于该化合物的馏分溶剂蒸干，得到40 mg白色固体。

2. CC试剂的制备

  1. 叠氮标记分子5 mM储备液的制备
    1. 将1.5 mg的叠氮-PEG3-Fluor 545溶解于0.5 ml二甲基亚砜（DMSO）中。分装至0.5 ml微量离心管中，于-20 °C保存。
    2. 将1.1 mg的叠氮-PEG3-生物素（Biotin）溶解于0.5 ml DMSO中。分装至0.5 ml微量离心管中，于-20 °C保存。
  2. 三(2-羧乙基)膦（TCEP）50 mM储备液的制备
    1. 将14.3 mg TCEP溶解于1 ml水中，每次使用前新鲜配制。
  3. 五水合硫酸铜（CuSO4·5H2O）50 mM溶液的制备
    1. 在玻璃小瓶中，将12.48 mg CuSO4·5H2O溶解于1 ml水中。室温保存，可稳定存放长达一个月。
  4. 三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺（TBTA）83.5 mM储备液的制备
    1. 在玻璃小瓶中，将8.85 mg TBTA溶解于200 µl DMSO中。室温保存，可稳定存放长达一个月。
  5. TBTA工作液（1.7 mM）的制备（使用前立即配制）
    1. 取20 µl 83.5 mM TBTA加入玻璃小瓶中，用DMSO稀释至总体积180 ml。
    2. 加入800 µl 叔丁醇，涡旋混匀。

3. CFA处理大鼠足垫组织中NAAA表达分析

注意：使用雄性Sprague-Dawley大鼠，体重175–200 g，并按照动物伦理使用指南进行所有操作。将大鼠饲养在通风良好的笼具中，保持12小时光照/12小时黑暗循环，自由摄食和饮水。关于CFA处理方案，请参考Bonezzi等et al.29发表的文章。在给予CFA后第7天使用动物。

  1. ARN14686的静脉给药
    1. 将 ARN14686 溶于载体溶液（15% PEG 和 15% Tween 生理盐水）中。根据大鼠体重计算溶液浓度（剂量为 3 mg/kg，注射体积为 5 ml/kg）。
    2. 对三只未处理大鼠和三只CFA处理大鼠进行尾静脉注射。将每只大鼠放入合适的塑料固定装置中，随后将大鼠尾部浸入温水中2–4分钟以促进血管扩张，通过尾静脉静脉注射化合物。
    3. 对三只大鼠（未处理和CFA处理的大鼠）仅通过静脉注射给予溶剂。
  2. 爪子采集与解剖
    1. 通过 CO 处死大鼠2 在给予探针或对照物4小时后进行吸入处理，并使用手术刀在膝关节上方0.5 cm处切断收集足部样本。
    2. 使用剪刀辅助解剖仔细去除皮肤，并通过刮除法将软组织从骨骼上分离。弃去骨骼，收集足部的软组织。将样品在液氮中速冻后于 -80 °C 保存。
  3. 爪组织匀浆及溶酶体蛋白制备
    注意：避免使用去垢剂和含胺缓冲液，因为它们可能抑制CC反应。
    1. 将3只大鼠的足部组织（按3.2.1节所述方法获取）合并，并在含有蛋白酶抑制剂混合物的4 ml 320 mM蔗糖磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中进行匀浆处理（参见 材料/试剂表）；使用高性能分散仪器（参见 材料/试剂表).
    2. 在 4 °C 条件下，以 1,000 x g 离心 20 分钟，离心组织匀浆；保留上清液。
    3. 加入2 ml PBS中的320 mM蔗糖溶液和蛋白酶抑制剂混合物至组织沉淀中，再次匀浆。
    4. 在 4 °C 条件下以 1,000 x g 离心 20 分钟，将上清液收集至步骤 3.3.2 所得的上清液中。
    5. 在4 °C、12,000 x g条件下离心收集的上清液30分钟。
    6. 称取沉淀物重量，并用两倍体积的PBS重悬即， 每100 mg沉淀使用200 µl。转移至1.5 ml收集管中，在-80 °C冷冻1小时。
    7. 将样品解冻后，在 -80 °C 再次冷冻 1 小时。
    8. 再重复冻融循环两次。
      注意：此步骤旨在使蛋白质溶解。如有必要，可冷冻过夜。
    9. 在 4 °C 条件下以 100,000 x g 离心 1 小时。收集含有可溶性溶酶体蛋白的上清液，弃去沉淀。样品可于 -80 °C 保存，或立即进行蛋白定量。
    10. 使用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白含量30 商用试剂盒（参见 材料/试剂表），按照制造商的说明进行操作。
    11. 将样品储存于 -80 °C，直至使用。
  4. 含叠氮-PEG3-生物素的CC
    注意：CC 和链霉亲和素磁珠富集的实验步骤（3.4–3.6）在 Speers 与 Cravatt 发表的方案基础上略作修改31.
    1. 从探针处理和载体处理的大鼠（未处理和CFA处理的大鼠）中制备500 µl溶酶体蛋白（1 mg/ml，溶于PBS中）。
    2. 用40 µl 50%链霉亲和素琼脂糖悬液（使用前用1 ml PBS洗涤3次）在4 °C预清除样品1小时。在4 °C下以1,000 × g离心4分钟，收集上清液。
    3. 加入11.3 µl浓度为5 mM的Azide-PEG3-Biotin储备液，涡旋混匀。
    4. 加入11.3 µl新配制的50 mM TCEP储备液，涡旋混匀。
    5. 将 34 µl 新鲜配制的 1.7 mM TBTA 工作溶液与 11.3 µl 的 50 mM CuSO₄ 混合4·5H2O型血
    6. 加入45.3 ml预混的TBTA/CuSO₄溶液4·5H2O溶液并涡旋。
    7. 在 25 °C 下孵育反应体系 2 小时（延长孵育时间不会影响反应结果）。此步骤中可观察到蛋白质沉淀。孵育 1 小时后混匀。
  5. 去除过量的交联剂
    1. 在 4 °C 条件下以 6,500 × g 离心 4 分钟，弃上清液。
    2. 加入750 µl预冷的甲醇，通过超声处理（使用探头式超声仪，超声5秒）重悬。
    3. 在 4 °C 条件下以 6,500 x g 离心 4 分钟，使用注射器和针头弃去上清液。
    4. 重复步骤 3.5.2 两次（无需超声处理）。
    5. 最后一次洗涤后，向蛋白质沉淀中加入 325 µl 含 2.5% 十二烷基硫酸钠（SDS）的 PBS 溶液，并超声处理 3 次 5 秒
    6. 将样品在 65 °C 下加热 5 分钟，再次进行超声处理。
    7. 在室温下以6,500 × g离心5分钟，保留上清液。
    8. 加入 1.4 ml PBS，将 SDS 浓度稀释至 0.5%。置于 -20 °C 保存，或继续进行链霉亲和素富集。
  6. 链霉亲和素富集
    1. 用 PBS 将 3.5.8 步骤中获得的样品体积调至 4.2 ml。使用剪去末端的枪头加入 40 µl 50% 链霉亲和素琼脂糖悬液（使用前用 1 ml PBS 洗涤三次）。
    2. 室温下旋转孵育2小时，然后在1,400 × g离心2分钟。
    3. 去除上清液时不要干燥磁珠沉淀，并利用残留的上清液将磁珠转移至1 ml离心柱中（参见 材料/试剂表).
    4. 用1 ml 1% SDS（溶于PBS）重悬沉淀，静置洗涤3次，每次1 ml；再用1 ml 6 M尿素（溶于PBS）重悬，静置洗涤3次，每次1 ml；最后用PBS重悬，静置洗涤4次，每次1 ml。
    5. 使用500 µl PBS重复洗涤磁珠两次，每次转移至1.5 ml离心管中，在室温下以1,400 × g离心2分钟。用注射器和针头小心吸除上清液。
    6. 加入25 µl洗脱缓冲液（6 M尿素、2 M硫脲、2% SDS和6 mM生物素，均溶于PBS中），室温孵育15分钟，随后95 °C孵育15分钟，以洗脱树脂结合的蛋白质32.
  7. 蛋白质印迹
    1. 加入5 µl 6x Laemmli缓冲液（配制9 ml：0.5 ml 1 M Tris-HCl pH 6.8，5 ml 20% SDS，5 mg 溴酚蓝，3 ml 甘油，以及H2最多9 ml）并在使用前立即加入5% β-巯基乙醇。将样品在2,000 × g条件下短暂离心以沉淀树脂，取25 µl上清液加入4–12%聚丙烯酰胺凝胶中。
    2. 根据制造商说明书进行凝胶电泳及蛋白质转膜至印迹膜33.
    3. 用 10 ml 封闭缓冲液将印迹膜饱和处理 1 小时（参见 材料/试剂表) 含 0.1% Tween-20。避免使用脱脂奶粉，因其可能增加背景信号。
    4. 用 10 ml 含 0.05% Tween-20 的 PBS 洗涤膜，并加入 10 µl 荧光标记链霉亲和素（参见 材料/试剂表) 溶于 10 ml 封闭缓冲液（含 0.1% Tween-20）中，室温孵育 1 小时。
    5. 用含0.05% Tween-20的PBS洗涤4次，每次10分钟，再用PBS单独洗涤1次，10分钟。
    6. 使用图像扫描仪（参见 材料/试剂表开启仪器及连接的计算机，等待至就绪状态。
    7. 启动采集程序并选择荧光模式。选择膜区域，并选择保存文件的目标文件夹。
    8. 设置以下采集参数：680 nm 激发波长，BPFR700 滤光片，1,000 V 光电倍增管（PMT）电压（通道 2），像素大小为 25 µm。采集图像。

4. 通过荧光显微镜定位小鼠肺组织中具有催化活性的NAAA

注意：使用8至10周龄的雄性小鼠，并按照动物伦理使用指南进行所有操作。将小鼠饲养在通风良好的笼子中，保持12小时光照/12小时黑暗的循环，自由摄食和饮水。

  1. 小鼠静脉注射 ARN14686
    1. 将 ARN14686 溶解于载体溶液中：15% PEG 和 15% Tween-20 生理盐水溶液。根据小鼠体重计算溶液浓度（剂量为 3 mg/kg，注射体积为 5 ml/kg）。
    2. 对 3 只小鼠进行静脉注射。将每只小鼠放入合适的塑料固定装置中，然后将其尾巴浸入温水中 2–4 分钟以促进血管扩张，并通过尾静脉注射化合物。
    3. 对另外 3 只小鼠仅注射载体溶液（不含药物）。
  2. 肺组织采集与切片制备
    警告：请在通风橱中小心操作多聚甲醛，并佩戴手套！
    1. 使用水合氯醛（400 mg/kg）麻醉小鼠，通过脚趾夹捏法确认麻醉效果。随后进行心脏灌注，步骤如下：
      1. 用剪刀浅层剪开腹部皮肤，暴露胸腔和腹膜表面。
      2. 在剑突下方用剪刀浅层剪开腹膜，暴露膈肌和内脏器官。注意避免损伤重要血管。
      3. 从一侧向另一侧剪开膈肌，打开胸腔。
      4. 将连接至自动注射泵的 25 G 针头插入，先灌注 20 ml 0.9% 生理盐水，随后灌注 60 ml 4% 多聚甲醛磷酸盐缓冲液（0.1 M，pH 7.4）。
    2. 灌注完成后，用镊子夹住心脏并小心将其取出。用镊子夹住气管，用剪刀完全切断，轻轻向上拉出气管，将肺组织从胸腔中完整取出。解剖分离右肺与左肺。
    3. 将组织在 4% 多聚甲醛中后固定 1 小时，置于冷的 2-甲基丁烷中速冻，并在 -80 °C 下保存。
    4. 使用冷冻切片机切取 40 µm 厚的组织切片，立即贴附于载玻片上（每隔五片取一片），并按以下说明进行免疫组织化学处理。
  3. 组织切片通透与封闭
    1. 用 PBS 洗涤（每次 5 分钟，共 2 次），在室温下用含 0.1% Triton X-100 的 PBS 处理 15 分钟以实现通透。
    2. 用 PBS 洗涤（每次 5 分钟，共 2 次），在室温下用含 3% 牛血清白蛋白（BSA）的 PBS 封闭 30 分钟。
    3. 用 PBS 洗涤（每次 5 分钟，共 2 次），随后进行下一步铜催化的叠氮-炔环加成反应（CC）。
  4. 在组织切片上进行叠氮-PEG3-Fluor 545 的铜催化环加成反应（CC）
    1. 按第 2 节所述方法配制反应试剂，混合成反应液。配制 1 ml 溶液时，加入：Azide-PEG3-Fluor 545（5 mM 储液）2 µl、TCEP（新鲜配制的 50 mM 储液）20 µl、TBTA（新鲜配制的 1.7 mM 工作液）58.8 µl、CuSO4·5H2O（50 mM 储液）20 µl，以及 PBS 900 µl。
    2. 取约 400 µl 上述 CC 反应混合液滴加至按第 4.2 节制备的组织切片上。注意所用体积应足以完全覆盖切片。在避光条件下室温孵育 1 小时。
    3. 依次用 PBS 洗涤（1 次 ，每次 5 分钟）、冷甲醇洗涤（1 次 ，每次 5 分钟）、含 1% Tween-20 和 0.5 mM EDTA 的 PBS 溶液洗涤（3 次 ，每次 2 分钟），最后再用 PBS 洗涤（1 次 ，每次 5 分钟）。
    4. 自然晾干后，滴加含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂（见 材料/试剂表），加盖盖玻片（避免产生气泡），用封片剂密封。4 °C 保存至分析前。
  5. 图像采集
    1. 按照仪器用户指南，使用配备 546 nm 和 450 nm 激光激发光源的共聚焦显微镜进行成像（见 材料/试剂表）。
    2. 选择数值孔径 NA = 1.40 的 60X 物镜，通过目镜预览载玻片，聚焦于目标区域。
    3. 根据样本特性和设备参数设定图像采集条件。

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结果

ARN14686 是基于 NAAA 抑制剂 ARN726 的骨架设计而成。ARN726 中的 4-丁基-环己基被一条带有末端炔基标签的 C9 饱和脂肪链取代（图1）。引入炔基标签旨在通过碳-碳键（CC）实现两步标记程序，从而添加荧光团或生物素分子。这一特性使 ARN14686 成为研究 NAAA 的一种极为通用的工具 体外 和 体内.

此处展示了 ARN14686 的两种应用，代表了该分子的潜在用途。图2 为本研究中所述实验流程的示意图。探针经静脉给药后，可采用两种不同的检测方法：i）通过蛋白质印迹法分析 NAAA 活性表达；ii）通过荧光显微镜分析 NAAA 活性表达及其在细胞内的定位。

首个代表性结果由我们课题组近期发表

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讨论

酶活性在多个水平上受到精细调控，包括RNA转录、蛋白质合成、蛋白质转运、翻译后修饰以及蛋白质-蛋白质相互作用。通常，仅酶的表达水平并不能反映其实际活性。为研究蛋白质在其天然状态下的活性，人们开发了活性为基础的蛋白质组分析（ABPP）技术。该技术需要两个关键要素：一种能够共价结合目标酶活性位点的化学探针，以及一种用于检测探针标记酶的报告标签。

探针的设计与合成是该实验流程中的关键环节。探针必须对其靶标具有足够的亲和力和选择性。此外，报告基团的存在不应影响探针对靶标的结合能力。这一问题可通过设计两步法活性探针（ABP）在很大程度上得以解决，即在探针捕获靶标之后再引入报告基团。无标签探针特别适用于活体（in vivo）研究，在此类研究中可于活细胞或活体生物内评估蛋白质活性，同时将外界干扰降至最低。NAAA探针ARN14686的设计正是为了满足上述要求。其β-内酰胺反应性弹头的选择基于先前在β-内酰胺类NAAA抑制剂研究中获得的结果16,26。这类化合物通过共价结合于酶的催化半胱氨酸残基，以高效且高选择性的方式抑制NAAA活性。此外，这些化合物已被证...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢位于意大利热那亚的意大利技术研究院 Nikon 成像中心（NIC@IIT）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,1’-亚磺酰基二咪唑 Sigma Aldrich367818有害的
2-二吡啶基碳酸酯Fluorochem11331有害的
2-甲基丁烷Sigma AldrichM32631易燃，有毒，对水生环境有害
4-二甲氨基吡啶Sigma Aldrich107700有毒
乙酸Sigma Aldrich695092易燃，腐蚀性
乙腈 Sigma Aldrich34998易燃，有毒
活性炭Sigma Aldrich161551
氯化铵Sigma AldrichA9434有害的
叠氮-PEG3-生物素Jena BiosciencesCLK-AZ104P4
叠氮-PEG3-Fluor 545Jena BiosciencesCLK-AZ109
BCA蛋白检测试剂盒Thermo Fisher Scientific23227
离心柱伯乐（Biorad）732-6204
生物素Sigma AldrichB4501
封闭缓冲液Li-Cor Biosciences927-40000
β-巯基乙醇Sigma AldrichM6250剧毒
牛血清白蛋白（BSA）Sigma AldrichA7030
溴酚蓝Sigma AldrichB0126
Bruker Avance III 400Bruker
硅藻土Sigma Aldrich419931健康危害
硝酸铈铵 Sigma Aldrich22249氧化性，有害
水合氯醛Sigma AldrichC8383剧毒
CuSO₄40.5H2O Sigma Aldrich209198有毒的
环己二烯Sigma Aldrich125415易燃，健康危害
环己烷Sigma Aldrich34855易燃，有害，健康危害，环境危害
二氯甲烷Sigma Aldrich34856有害，健康危害
乙醚Sigma Aldrich296082易燃，有害
二甲基亚砜（DMSO）Acros Organics348441000
二甲基亚砜 d6 （DMSO-d6)Sigma Aldrich175943
乙醇Sigma Aldrich2860易燃，有害
乙酸乙酯Sigma Aldrich34858易燃，有害
甘油Sigma AldrichG5516
Irdye 680-LT 链霉亲和素Li-Cor 生物科学925-68031
IRDye680-LT Streptavidin Licor925-68031使用前短暂离心以沉淀蛋白质复合物
甲醇Sigma Aldrich34966剧毒
甲醇Sigma Aldrich34860易燃，有毒，危害健康
N-(3-二甲氨基丙基)-N′盐酸乙基碳二亚胺Sigma AldrichE7750有害，腐蚀性
N,N二异丙基乙胺Sigma AldrichD125806易燃，腐蚀性，有毒
N,N-二甲基甲酰胺Sigma Aldrich227056易燃，有害，健康危害
NCbz-L-丝氨酸FluorochemM03053有害的
尼康A1共聚焦显微镜Nikon阅读用户手册
NuPAGE 4-12% Bis-Tris 凝胶Thermo Fisher ScientificNP0335BOX
碳载钯Sigma Aldrich330108
p-茴香胺Sigma AldrichA88255有毒，健康危害，环境危害
多聚甲醛sigma Aldrich441244有毒、吸入有害、腐蚀性、易燃
聚乙二醇 Sigma AldrichP3265
含DAPI的ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂 Thermo Fisher ScientificP36931避免气泡产生
蛋白酶抑制剂混合物Sigma AldrichP8340
碳酸氢钠Sigma AldrichS6014
十二烷基硫酸钠（SDS） Sigma AldrichL3771有毒、腐蚀性、易燃
氢化钠 Sigma Aldrich452912易燃
硫酸钠Sigma Aldrich239313
Starion FLA-9000 成像扫描仪FUJIFILM阅读  用户手册
链霉亲和素琼脂糖Thermo Fisher Scientific20349
蔗糖Sigma AldrichS7903
叔丁醇Sigma Aldrich360538有毒，易燃
四氢呋喃Sigma Aldrich186562易燃，有害，健康危害
硫脲Acros Organics424542500有毒，于50℃温育 °C 溶解
TrisSigma AldrichRDD008
三(2-羧乙基)膦（TCEP）Sigma AldrichC4706
Tris[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺（TBTA）Sigma Aldrich678937
Triton X-100Sigma AldrichX100有毒的
Tween-20Sigma AldrichP9416
吐温-80Sigma AldrichP1754
Ultra turrax IKA T18 basic 组织匀浆机IKA
十一碳-10-炔-1-醇Fluorochem13739有害的
尿素Sigma AldrichU5378有毒，于 50 °C 保温 °C以溶解

参考文献

  1. Gygi, S. P., Han, D. K., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Aebersold, R. Protein analysis by mass spectrometry and sequence database searching: tools for cancer research in the post-genomic era. Electrophoresis. 20, 310-319 (1999).
  2. Washburn, M. P., Wolters, D., Yates, J. R. Large-scale analysis of the yeast proteome by multidimensional protein identification technology. Nat Biotechnol. 19, 242-247 (2001).
  3. Zhu, H., Bilgin, M., Snyder, M. Proteomics. Annu Rev Biochem. 72, 783-812 (2003).
  4. Ito, T., et al. Roles for the two-hybrid system in exploration of the yeast protein interactome. Mol Cell Proteomics. 1, 561-566 (2002).
  5. Evans, M. J., Cravatt, B. F. Mechanism-based profiling of enzyme families. Chem Rev. 106, 3279-3301 (2006).
  6. Cravatt, B. F., Wright, A. T., Kozarich, J. W. Activity-based protein profiling: from enzyme chemistry to proteomic chemistry. Annu Rev Biochem. 77, 383-414 (2008).
  7. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem Int Ed Engl. 41, 2596-2599 (2002).
  8. Meldal, M., Tornoe, C. W. Cu-catalyzed azide-alkyne cycloaddition. Chem Rev. 108, 2952-3015 (2008).
  9. Speers, A. E., Adam, G. C., Cravatt, B. F. Activity-based protein profiling in vivo using a copper(i)-catalyzed azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition. J Am Chem Soc. 125, 4686-4687 (2003).
  10. Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287, 2007-2010 (2000).
  11. Kohn, M., Breinbauer, R. The Staudinger ligation-a gift to chemical biology. Angew Chem Int Ed Engl. 43, 3106-3116 (2004).
  12. Romeo, E., et al. Activity-Based Probe for N-Acylethanolamine Acid Amidase. ACS Chem Biol. 10, 2057-2064 (2015).
  13. Ueda, N., Yamanaka, K., Yamamoto, S. Purification and characterization of an acid amidase selective for N-palmitoylethanolamine, a putative endogenous anti-inflammatory substance. J Biol Chem. 276, 35552-35557 (2001).
  14. Tsuboi, K., et al. Molecular characterization of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a novel member of the choloylglycine hydrolase family with structural and functional similarity to acid ceramidase. J Biol Chem. 280, 11082-11092 (2005).
  15. Tsuboi, K., Takezaki, N., Ueda, N. The N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase (NAAA). Chem Biodivers. 4, 1914-1925 (2007).
  16. Ribeiro, A., et al. A Potent Systemically Active N-Acylethanolamine Acid Amidase Inhibitor that Suppresses Inflammation and Human Macrophage Activation. ACS Chem Biol. 10, 1838-1846 (2015).
  17. Zhao, L. Y., Tsuboi, K., Okamoto, Y., Nagahata, S., Ueda, N. Proteolytic activation and glycosylation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a lysosomal enzyme involved in the endocannabinoid metabolism. Biochim Biophys Acta. 1771, 1397-1405 (2007).
  18. Wang, J., et al. Amino acid residues crucial in pH regulation and proteolytic activation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase. Biochim Biophys Acta. 1781, 710-717 (2008).
  19. West, J. M., Zvonok, N., Whitten, K. M., Wood, J. T., Makriyannis, A. Mass spectrometric characterization of human N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase. J Proteome Res. 11, 972-981 (2012).
  20. Bandiera, T., Ponzano, S., Piomelli, D. Advances in the discovery of N-acylethanolamine acid amidase inhibitors. Pharmacol Res. 86, 11-17 (2014).
  21. Sasso, O., et al. Antinociceptive effects of the N-acylethanolamine acid amidase inhibitor ARN077 in rodent pain models. Pain. 154, 350-360 (2013).
  22. Duranti, A., et al. N-(2-oxo-3-oxetanyl)carbamic acid esters as N-acylethanolamine acid amidase inhibitors: synthesis and structure-activity and structure-property relationships. J Med Chem. 55, 4824-4836 (2012).
  23. Ponzano, S., et al. Synthesis and structure-activity relationship (SAR) of 2-methyl-4-oxo-3-oxetanylcarbamic acid esters, a class of potent N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors. J Med Chem. 56, 6917-6934 (2013).
  24. Solorzano, C., et al. Synthesis and structure-activity relationships of N-(2-oxo-3-oxetanyl)amides as N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase inhibitors. J Med Chem. 53, 5770-5781 (2010).
  25. Vitale, R., et al. Synthesis, structure-activity, and structure-stability relationships of 2-substituted-N-(4-oxo-3-oxetanyl) N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors. ChemMedChem 9. 9, 323-336 (2014).
  26. Fiasella, A., et al. 3-Aminoazetidin-2-one derivatives as N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors suitable for systemic administration. ChemMedChem 9. 9, 1602-1614 (2014).
  27. Armirotti, A., et al. beta-Lactones Inhibit N-acylethanolamine Acid Amidase by S-Acylation of the Catalytic N-Terminal Cysteine. ACS Med Chem Lett. 3, 422-426 (2012).
  28. Nuzzi, A., et al. Potent alpha-amino-beta-lactam carbamic acid ester as NAAA inhibitors. Synthesis and structure-activity relationship (SAR) studies. Eur J Med Chem. 111, 138-159 (2016).
  29. Bonezzi, F. T., et al. An Important Role for N-Acylethanolamine Acid Amidase in the Complete Freund's Adjuvant Rat Model of Arthritis. J Pharmacol Exp Ther. 356, 656-663 (2016).
  30. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
  31. Speers, A. E., Cravatt, B. F. Activity-Based Protein Profiling (ABPP) and Click Chemistry (CC)-ABPP by MudPIT Mass Spectrometry. Curr Protoc Chem Biol. 1, 29-41 (2009).
  32. Rybak, J. N., Scheurer, S. B., Neri, D., Elia, G. Purification of biotinylated proteins on streptavidin resin: a protocol for quantitative elution. Proteomics. 4, 2296-2299 (2004).
  33. Penna, A., Cahalan, M. Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J Vis Exp. (264), (2007).
  34. Giuffrida, A., Piomelli, D. Isotope dilution GC/MS determination of anandamide and other fatty acylethanolamides in rat blood plasma. FEBS Lett. 422, 373-376 (1998).
  35. Buczynski, M. W., Parsons, L. H. Quantification of brain endocannabinoid levels: methods, interpretations and pitfalls. Br J Pharmacol. 160, 423-442 (2010).

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