制备与 在体实验 使用基于活性的探针 N酰基乙醇胺酸性酰胺酶

摘要

本文介绍了活性依赖性探针（ARN14686，十一碳-10-炔基-N-[(3S)-2-氧杂氮杂环丁烷-3-基]氨基甲酸酯）的制备与使用方法，该探针可用于体外（in vitro）和离体（ex vivo）条件下检测并定量炎症相关酶N-脂肪酸乙醇胺酸性水解酶（NAAA）的活性形式。

摘要

基于活性的蛋白质谱分析（ABPP）是一种利用靶向酶活性位点的化学探针，在复杂蛋白质组中鉴定目标酶的方法。通过在探针中引入报告标签，可借助凝胶内荧光扫描、蛋白质印迹、荧光显微镜或液相色谱-质谱联用技术对标记的酶进行检测。本文描述了化合物ARN14686的制备及其应用，该化合物是一种基于点击化学的活性探针（CC-ABP），可选择性识别N-酰基乙醇胺酸性水解酶（NAAA）。NAAA是一种半胱氨酸水解酶，通过失活内源性过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）-alpha激动剂（如棕榈酰乙醇胺（PEA）和油酰乙醇胺（OEA））促进炎症反应。NAAA最初合成的是无活性的全长前体酶，其在溶酶体的酸性pH环境中通过自蛋白水解被激活。定位研究表明，NAAA主要在巨噬细胞及其他单核细胞来源的细胞以及B淋巴细胞中表达。我们提供了应用ARN14686在啮齿类动物组织中通过蛋白质印迹和荧光显微镜进行ex vivo检测和定量活性NAAA的实例。

引言

常用于研究蛋白质表达模式、相互作用及功能的方法，包括用于鸟枪法分析的液相色谱-质谱联用平台^1,2，酵母双杂交方法^3,4，以及 体外 检测方法在评估蛋白质天然状态下的活性方面存在局限性。基于活性的蛋白质分析（activity-based protein profiling, ABPP）可用于弥补这一不足。该方法利用能够共价结合目标酶活性位点的小分子探针，并将其与报告基团偶联，从而实现对靶标的检测。通过点击化学（click chemistry, CC），报告基团可被直接整合至探针中，或在探针与靶标结合后引入^5,6后者操作需要使用含有适当化学基团（如末端炔烃或叠氮化物）的探针，这些基团可通过生物正交反应（例如Cu(I)催化的Huisgen [3+2]环加成反应）与多种报告分子试剂进行修饰。^7-9 或施陶丁格连接反应^10,11.

最近，我们公布了化合物 ARN14686 作为首个针对 ABP 的探针 体外 和 体内 NAAA（N-乙酰氨基葡糖苷酶）的半胱氨酸水解酶活性检测¹²NAAA 催化饱和及单不饱和脂肪酸乙醇酰胺（FAEs）的水解失活，包括油酰乙醇酰胺（OEA）和棕榈酰乙醇酰胺（PEA），后者是抗炎核受体 PPAR-α 的内源性激动剂。^13-15NAAA 主要在巨噬细胞和其他....

方案

注意：所有化学反应均应在通风橱中进行，并穿戴实验服、手套和防护眼镜。反应还应在氮气环境中进行。

伦理声明：我们涉及动物的实验操作均依照意大利关于实验及其他科学用途动物保护的法规（D.M. 116192）以及欧洲经济共同体法规（O.J. of E.C. L 358/1 12/18/1986）进行。

注意：文中所述[(3S)-2-氧代氮杂环丁烷-3-基]铵乙酸盐的合成适用于大规模制备（使用50 g N-Cbz-L-丝氨酸），但也可轻松缩小规模。

1. 合成

注意：合成反应路线图见图1。

1. 2-吡啶基十一碳-10-炔基碳酸酯和十一碳-10-炔基-2-氧代吡啶-1-羧酸酯的制备
   1. 在50 ml圆底烧瓶中，将350 mg十一碳-10-炔-1-醇溶于3.5 ml干燥的二氯甲烷中。
   2. 向1.1.1中的溶液中加入25 mg 4-二甲氨基吡啶（DMAP）和530 mg 2-联吡啶基碳酸酯（DPC）。室温（RT）下搅拌混合物16小时。
   3. 加入20 ml二氯甲烷。
   4. 将混合物转移至分液漏斗中，加入15 ml水，振荡，静置使两相分离。
   5. 打开活塞，收集有机相（下层），然后关闭活塞。加入15 ml饱和NaHCO₃溶液₃溶液。振荡分液漏斗并静置，使两相分离。....

结果

ARN14686 是基于 NAAA 抑制剂 ARN726 的骨架设计而成。ARN726 中的 4-丁基-环己基被一条带有末端炔基标签的 C9 饱和脂肪链取代（图1）。引入炔基标签旨在通过碳-碳键（CC）实现两步标记程序，从而添加荧光团或生物素分子。这一特性使 ARN14686 成为研究 NAAA 的一种极为通用的工具 体外 和 体内.

此处展示了 ARN14686 的两种应用，代表了该分子的潜在用途。图2 为本研究中所述实验流程的示意图。探针经静脉给药后，可采用两种不同的检测方法：i）通过蛋白质印迹法分析 NAAA 活性表达；ii）通过荧光显微镜分析 NAAA 活性表达及其在细胞内的定位。

首个代表性结果由我们课题组近期发表

讨论

酶活性在多个水平上受到精细调控，包括RNA转录、蛋白质合成、蛋白质转运、翻译后修饰以及蛋白质-蛋白质相互作用。通常，仅酶的表达水平并不能反映其实际活性。为研究蛋白质在其天然状态下的活性，人们开发了活性为基础的蛋白质组分析（ABPP）技术。该技术需要两个关键要素：一种能够共价结合目标酶活性位点的化学探针，以及一种用于检测探针标记酶的报告标签。

探针的设计与合成是该实验流程中的关键环节。探针必须对其靶标具有足够的亲和力和选择性。此外，报告基团的存在不应影响探针对靶标的结合能力。这一问题可通过设计两步法活性探针（ABP）在很大程度上得以解决，即在探针捕获靶标之后再引入报告基团。无标签探针特别适用于活体（in vivo）研究，在此类研究中可于活细胞或活体生物内评估蛋白质活性，同时将外界干扰降至最低。NAAA探针ARN14686的设计正是为了满足上述要求。其β-内酰胺反应性弹头的选择基于先前在β-内酰胺类NAAA抑制剂研究中获得的结果^16,26。这类化合物通过共价结合于酶的催化半胱氨酸残基，以高效且高选择性的方式抑制NAAA活性。此外，这些化合物已被证.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1,1’-亚磺酰基二咪唑	Sigma Aldrich	367818	有害的
2-二吡啶基碳酸酯	Fluorochem	11331	有害的
2-甲基丁烷	Sigma Aldrich	M32631	易燃，有毒，对水生环境有害
4-二甲氨基吡啶	Sigma Aldrich	107700	有毒
乙酸	Sigma Aldrich	695092	易燃，腐蚀性
乙腈	Sigma Aldrich	34998	易燃，有毒
活性炭	Sigma Aldrich	161551
氯化铵	Sigma Aldrich	A9434	有害的
叠氮-PEG3-生物素	Jena Biosciences	CLK-AZ104P4
叠氮-PEG3-Fluor 545	Jena Biosciences	CLK-AZ109
BCA蛋白检测试剂盒	Thermo Fisher Scientific	23227
离心柱	伯乐（Biorad）	732-6204
生物素	Sigma Aldrich	B4501
封闭缓冲液	Li-Cor Biosciences	927-40000
β-巯基乙醇	Sigma Aldrich	M6250	剧毒
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma Aldrich	A7030
溴酚蓝	Sigma Aldrich	B0126
Bruker Avance III 400	Bruker
硅藻土	Sigma Aldrich	419931	健康危害
硝酸铈铵	Sigma Aldrich	22249	氧化性，有害
水合氯醛	Sigma Aldrich	C8383	剧毒
CuSO₄40.5H2O	Sigma Aldrich	209198	有毒的
环己二烯	Sigma Aldrich	125415	易燃，健康危害
环己烷	Sigma Aldrich	34855	易燃，有害，健康危害，环境危害
二氯甲烷	Sigma Aldrich	34856	有害，健康危害
乙醚	Sigma Aldrich	296082	易燃，有害
二甲基亚砜（DMSO）	Acros Organics	348441000
二甲基亚砜 d6 （DMSO-d6)	Sigma Aldrich	175943
乙醇	Sigma Aldrich	2860	易燃，有害
乙酸乙酯	Sigma Aldrich	34858	易燃，有害
甘油	Sigma Aldrich	G5516
Irdye 680-LT 链霉亲和素	Li-Cor 生物科学	925-68031
IRDye680-LT Streptavidin	Licor	925-68031	使用前短暂离心以沉淀蛋白质复合物
甲醇	Sigma Aldrich	34966	剧毒
甲醇	Sigma Aldrich	34860	易燃，有毒，危害健康
N-(3-二甲氨基丙基)-N′盐酸乙基碳二亚胺	Sigma Aldrich	E7750	有害，腐蚀性
N,N二异丙基乙胺	Sigma Aldrich	D125806	易燃，腐蚀性，有毒
N,N-二甲基甲酰胺	Sigma Aldrich	227056	易燃，有害，健康危害
NCbz-L-丝氨酸	Fluorochem	M03053	有害的
尼康A1共聚焦显微镜	Nikon		阅读用户手册
NuPAGE 4-12% Bis-Tris 凝胶	Thermo Fisher Scientific	NP0335BOX
碳载钯	Sigma Aldrich	330108
p-茴香胺	Sigma Aldrich	A88255	有毒，健康危害，环境危害
多聚甲醛	sigma Aldrich	441244	有毒、吸入有害、腐蚀性、易燃
聚乙二醇	Sigma Aldrich	P3265
含DAPI的ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂	Thermo Fisher Scientific	P36931	避免气泡产生
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma Aldrich	P8340
碳酸氢钠	Sigma Aldrich	S6014
十二烷基硫酸钠（SDS）	Sigma Aldrich	L3771	有毒、腐蚀性、易燃
氢化钠	Sigma Aldrich	452912	易燃
硫酸钠	Sigma Aldrich	239313
Starion FLA-9000 成像扫描仪	FUJIFILM		阅读  用户手册
链霉亲和素琼脂糖	Thermo Fisher Scientific	20349
蔗糖	Sigma Aldrich	S7903
叔丁醇	Sigma Aldrich	360538	有毒，易燃
四氢呋喃	Sigma Aldrich	186562	易燃，有害，健康危害
硫脲	Acros Organics	424542500	有毒，于50℃温育 °C 溶解
Tris	Sigma Aldrich	RDD008
三(2-羧乙基)膦（TCEP）	Sigma Aldrich	C4706
Tris[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺（TBTA）	Sigma Aldrich	678937
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100	有毒的
Tween-20	Sigma Aldrich	P9416
吐温-80	Sigma Aldrich	P1754
Ultra turrax IKA T18 basic 组织匀浆机	IKA
十一碳-10-炔-1-醇	Fluorochem	13739	有害的
尿素	Sigma Aldrich	U5378	有毒，于 50 °C 保温 °C以溶解