小胶质细胞的吞噬作用对于维持组织稳态至关重要，而吞噬功能不足已被认为与多种病理过程相关。然而，评估小胶质细胞功能 体内 在生理条件下精确监测和定量小胶质细胞吞噬潜能的技术具有较高难度。我们已开发出一种简单而稳健的方法，可用于实现上述目标。
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摘要
摘要
小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中的常驻巨噬细胞，具有多种维持CNS稳态的功能，包括吞噬受损的突触或细胞、碎片以及入侵的病原体。吞噬功能受损已被认为与阿尔茨海默病和年龄相关性黄斑变性等疾病的发病机制相关，这两种疾病分别表现为β-淀粉样蛋白斑块和玻璃膜疣的积累。尽管该功能至关重要，但小胶质细胞的吞噬作用一直难以准确评估 体内. 本文介绍一种简单而稳健的技术，可精确定量监测和量化 体内 视网膜小胶质细胞的吞噬潜能。以往的方法依赖于免疫组织化学染色和成像技术。本方法采用流式细胞术，在活体啮齿类动物眼部玻璃体内递送荧光标记的微粒后，检测小胶质细胞对这些微粒的摄取情况。该方法取代了传统耗时的组织切片、免疫染色和成像操作，可在不到六小时内实现对小胶质细胞吞噬功能的更精确量化。该实验流程还可用于评估不同化合物在生理环境下对小胶质细胞吞噬作用的影响。尽管该技术最初是为眼部研究开发的，但其应用并不局限于视觉科学领域。
引言
本方法的总体目标是准确评估和量化体内小胶质细胞的吞噬作用。小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中的常驻组织巨噬细胞，执行多种功能以维持组织稳态，包括免疫监视、分泌神经营养因子，以及尤为重要的吞噬作用1。在脑和视网膜发育过程中，小胶质细胞的吞噬作用在多个关键事件中发挥重要作用，例如无关突触的吞噬（突触修剪）以及凋亡神经元的清除2-4。此外，研究表明，小胶质细胞对受损或凋亡神经元、细胞碎片以及入侵微生物的吞噬作用，对于成年期中枢神经系统稳态的维持至关重要5。最后，小胶质细胞的吞噬功能已被证实与多种神经退行性疾病的发生机制相关，包括阿尔茨海默病和年龄相关性黄斑变性；在这些疾病中，吞噬能力缺陷或不足可能导致β-淀粉样蛋白（Aβ）斑块和玻璃膜疣（drusen）的积聚6,7。
小胶质细胞的功能受到其微环境的严格调控，尤其是可溶性因子（如转化生长因子β）或细胞间相互作用的影响。神经元持续表达多种细胞表面配体，例如 CD200 和 CX3CL1，而小胶质细胞则特异性表达相应的受体 CD200R 和 CX3CR1。这些受体的胞内区含有基于酪氨酸的免疫受体抑制基序（ITIM）。这类抑制性受体对于防止小胶质细胞过度活化至关重要，而过度活化可能引发神经炎症。因此，在正常的生理条件下，神经元与小胶质细胞之间的细胞间相互作用使小胶质细胞维持在静息状态。然而，在组织损伤过程中，神经元可能下调这些配体的表....
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方案
所有动物的处理均遵循斯克里普斯研究所制定的伦理准则。
1. 注射材料的准备
- 对33G针头和注射器进行灭菌：拆卸后在115 οC下高压灭菌。用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗针头，以备注射使用。
- 将荧光标记的颗粒在室温下解冻5–10分钟。用含Ca2+/Mg2+的无菌PBS将颗粒重新配制成50 mg/mL的溶液，以备注射。
注意：本方案中使用的为经验证适用于吞噬作用检测的真菌来源AF488标记颗粒21-23。为获得最佳摄取效果，应在注射前新鲜配制颗粒溶液。
注意2：颗粒浓度可根据每个具体实验进行优化。
2. 玻璃体内注射微珠溶液
注意：注射操作需要两人配合完成，其中一人负责持鼠并保持对眼球的注视，另一人则负责传递已装液的注射器并推动推杆。
- 通过腹腔注射给予啮齿类动物 100 mg/ml 的氯胺酮和 10 mg/ml 的赛拉嗪，剂量为 20 µl/10 g 体重，以进行麻醉。注射前，使用脚趾夹捏法评估麻醉水平。
注意：异氟烷对髓系细胞功能具有显著影响，因此在整个检测过程中应避免使用24,25。 - 用 0.5 µl 荧光标记的颗粒溶液填充针头。
- 将小鼠侧卧置于手术显微镜下（
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结果
在此，我们介绍一种利用流式细胞术分析在生理条件下快速、可靠地定量吞噬性视网膜小胶质细胞数量的方法。图2). 该方法可经调整用于检测化合物和/或基因操作对小胶质细胞吞噬能力的影响（图3A、图3B）。也可用于幼年（出生后10 - 20天）或成年小鼠（图3C）。通过腹腔注射给予不同剂量的脂多糖（LPS）。LPS刺激24小时后，采用本文所述方案评估视网膜小胶质细胞的吞噬功能（图3A）。与对照组相比，1.42 mg/kg 剂量的 LPS 显著增加了吞噬性小胶质细胞的百分比（图3B)，这符合预期26.
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讨论
该方法包含三个关键步骤：（1）玻璃体内注射荧光标记颗粒；（2）视网膜组织的采集与制备；（3）流式细胞术分析。我们建议研究人员在实施本方法前先练习玻璃体内注射。白化小鼠（Albino mice）例如，BALB/c）和一种有色溶液（例如， 荧光标记的颗粒）可用于方便地观察针头和注射溶液。玻璃体内注射操作具有挑战性，若操作不当将导致结果出现偏差且变异较大。注射技术不佳常引发的问题包括晶状体穿孔和/或视网膜损伤，可能导致出血和炎症。为最大限度降低眼部创伤风险，应使啮齿类动物保持稳定体位，尽量减少头部移动。穿刺眼球时，应缓慢插入注射器，避免推进过深而触碰晶状体。另一常见并发症是注射物质从眼内反流。为避免此情况，应缓慢按压推杆；注射完成后，应让眼球自然回缩至眼窝，再缓慢撤出注射器。理想的玻璃体内注射仅引起轻微的小胶质细胞活化，但未处理组与处理组之间仍可观察到明显差异。必须设置适当的对照组（例如， 未接受刺激的小鼠）在每次实验中用于建立基础吞噬水平。该方法中另一个需要熟练掌握的方面是视网膜解剖。为确保不同样本间获得可比的单细胞悬液，必须迅速获取视网膜组织，并尽量减少组织损伤。在PBS中进行解剖的最.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
Salome Murinello 获美国糖尿病协会基金（编号：1-16-PDF-072）资助。本研究获得 Martin Friedlander 收到的美国国立卫生研究院（国家眼科研究所 EY11254 和 EY22025）以及 Lowy 医学研究所研究基金的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 体视显微镜 | Nikon | 已停产 | |
| Hamilton 注射器，600系列 | Sigma | 26702 | |
| 33号针头，小柄RN针，0.5英寸，4型针尖 - 12o | Hamilton | 7803-05 | |
| Zymosan A（S. cerevisiae）BioParticles，Alexa Fluor 488偶联物 | ThermoFisher Scientific | Z-23373 | 注射前立即配制 |
| DPBS | Corning | 21-030-CV | |
| Dumont #5/45 镊子 | Fine Science Tools | 11251-35 | 需要两个 |
| Dumont #5SF 镊子 | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Vannas弹簧剪 - 3 mm切割刃 | Fine Science Tools | 15000-10 | 弯曲型 |
| 神经组织解离试剂盒 – 新生神经元 | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| 5 ml 聚苯乙烯圆底管 | Falcon | 352054 | |
| 96孔U型底板 | Falcon | 353077 | |
| 染色缓冲液（BSA） | BD Biosciences | 554657 | |
| CD11b-BV650 抗体 | BioLegend | 101259 | |
| Ly6C-APC-Cy7 | BioLegend | 128025 | |
| Ly6G-PE-Cy7 | BioLegend | 127617 | |
| 碘化丙啶 | BD Biosciences | 556463 | |
| 纯化抗小鼠CD16/32抗体 | BioLegend | 101301 |
参考文献
- Gomez-Nicola, D., Perry, V. H. Microglial dynamics and role in the healthy and diseased brain: a paradigm of functional plasticity. Neuroscientist. 21, 169-184 (2015).
- Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with ....
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重印与许可
