需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

评估视网膜小胶质细胞的吞噬功能 体内 使用基于流式细胞术的检测方法

9.2K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/54677

⸱

2016年10月18日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell and Molecular Biology, The Scripps Research Institute, 2Department of Chemical Physiology, The Scripps Research Institute, 3The Lowy Medical Research Institute

本文内容

摘要

小胶质细胞的吞噬作用对于维持组织稳态至关重要，而吞噬功能不足已被认为与多种病理过程相关。然而，评估小胶质细胞功能 体内 在生理条件下精确监测和定量小胶质细胞吞噬潜能的技术具有较高难度。我们已开发出一种简单而稳健的方法，可用于实现上述目标。

摘要

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中的常驻巨噬细胞，具有多种维持CNS稳态的功能，包括吞噬受损的突触或细胞、碎片以及入侵的病原体。吞噬功能受损已被认为与阿尔茨海默病和年龄相关性黄斑变性等疾病的发病机制相关，这两种疾病分别表现为β-淀粉样蛋白斑块和玻璃膜疣的积累。尽管该功能至关重要，但小胶质细胞的吞噬作用一直难以准确评估 体内. 本文介绍一种简单而稳健的技术，可精确定量监测和量化 体内 视网膜小胶质细胞的吞噬潜能。以往的方法依赖于免疫组织化学染色和成像技术。本方法采用流式细胞术，在活体啮齿类动物眼部玻璃体内递送荧光标记的微粒后，检测小胶质细胞对这些微粒的摄取情况。该方法取代了传统耗时的组织切片、免疫染色和成像操作，可在不到六小时内实现对小胶质细胞吞噬功能的更精确量化。该实验流程还可用于评估不同化合物在生理环境下对小胶质细胞吞噬作用的影响。尽管该技术最初是为眼部研究开发的，但其应用并不局限于视觉科学领域。

引言

本方法的总体目标是准确评估和量化体内小胶质细胞的吞噬作用。小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中的常驻组织巨噬细胞，执行多种功能以维持组织稳态，包括免疫监视、分泌神经营养因子，以及尤为重要的吞噬作用1。在脑和视网膜发育过程中，小胶质细胞的吞噬作用在多个关键事件中发挥重要作用，例如无关突触的吞噬（突触修剪）以及凋亡神经元的清除2-4。此外，研究表明，小胶质细胞对受损或凋亡神经元、细胞碎片以及入侵微生物的吞噬作用，对于成年期中枢神经系统稳态的维持至关重要5。最后，小胶质细胞的吞噬功能已被证实与多种神经退行性疾病的发生机制相关，包括阿尔茨海默病和年龄相关性黄斑变性；在这些疾病中，吞噬能力缺陷或不足可能导致β-淀粉样蛋白（Aβ）斑块和玻璃膜疣（drusen）的积聚6,7。

小胶质细胞的功能受到其微环境的严格调控，尤其是可溶性因子（如转化生长因子β）或细胞间相互作用的影响。神经元持续表达多种细胞表面配体，例如 CD200 和 CX3CL1，而小胶质细胞则特异性表达相应的受体 CD200R 和 CX3CR1。这些受体的胞内区含有基于酪氨酸的免疫受体抑制基序（ITIM）。这类抑制性受体对于防止小胶质细胞过度活化至关重要，而过度活化可能引发神经炎症。因此，在正常的生理条件下，神经元与小胶质细胞之间的细胞间相互作用使小胶质细胞维持在静息状态。然而，在组织损伤过程中，神经元可能下调这些配体的表达，从而解除对小胶质细胞活化的抑制作用。因此，小胶质细胞的功能（包括吞噬作用）与其微环境密切相关8。尽管如此，迄今为止，尚无标准化的检测方法可用于在生理背景下或完全模拟中枢神经系统微环境的条件下研究小胶质细胞的吞噬功能。

已开发出多种检测方法用于测量小胶质细胞的吞噬活性 体外，其中原代小胶质细胞或小胶质细胞系与靶细胞共培养（例如，凋亡神经元）或荧光标记的微珠。随后通过荧光成像显微镜或流式细胞术评估靶标摄取情况9-12这些检测方法可用于评估药理学或遗传学操控对小胶质细胞吞噬作用的影响，尽管具有一定的信息价值，但仍无法完全复制复杂的 体内 环境。小胶质细胞吞噬作用的间接检测方法 体内 已有报道：通过染色被认为参与吞噬作用的分子来实现例如， CD68），评估小胶质细胞与吞噬靶标之间的物理邻近性（例如，受损的神经元或突触组分），或通过免疫组织化学方法检测小胶质细胞内吞噬靶标的定位（例如， Aβ13-17已有两项研究采用更直接的方法来评估小胶质细胞的吞噬作用 体内休斯及其同事采用成像技术测量了小胶质细胞通过颅内途径递送的微珠摄取情况18. Sierra 等 开发了一种改进的方法，利用复杂的成像技术对小胶质细胞吞噬凋亡细胞的过程进行定量评估4然而，这些方法涉及复杂的组织制备、切片、成像和分析流程。我们此前曾采用流式细胞术分析培养的视网膜色素上皮（RPE）细胞对光感受器外节的吞噬作用19在此，我们描述了一种快速评估视网膜小胶质细胞对荧光标记颗粒摄取能力的实验方案，作为定量测量指标 体内 小胶质细胞吞噬作用

本文所述方案可在不到六小时内，通过三个关键步骤实现对视网膜小胶质细胞吞噬功能的可靠且定量的检测：（1）玻璃体内注射荧光标记的颗粒，（2）视网膜组织的采集与制备，（3）流式细胞术分析。我们所建立的方法是一种评估视网膜中小胶质细胞吞噬功能的稳健方法，可成功用于检测各种化合物或基因操作如何在生理条件下改变这一关键的小胶质细胞功能。作为中枢神经系统的一个特殊区域，视网膜是研究小胶质细胞功能的便捷模型系统20。尽管该方法是在眼部开发的，但我们认为其对所有研究小胶质细胞吞噬功能的神经科学家均具有应用价值。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有动物的处理均遵循斯克里普斯研究所制定的伦理准则。

1. 注射材料的准备

  1. 对33G针头和注射器进行灭菌：拆卸后在115  οC下高压灭菌。用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗针头，以备注射使用。
  2. 将荧光标记的颗粒在室温下解冻5–10分钟。用含Ca2+/Mg2+的无菌PBS将颗粒重新配制成50 mg/mL的溶液，以备注射。
    注意：本方案中使用的为经验证适用于吞噬作用检测的真菌来源AF488标记颗粒21-23。为获得最佳摄取效果，应在注射前新鲜配制颗粒溶液。
    注意2：颗粒浓度可根据每个具体实验进行优化。

2. 玻璃体内注射微珠溶液

注意：注射操作需要两人配合完成，其中一人负责持鼠并保持对眼球的注视，另一人则负责传递已装液的注射器并推动推杆。

  1. 通过腹腔注射给予啮齿类动物 100 mg/ml 的氯胺酮和 10 mg/ml 的赛拉嗪，剂量为 20 µl/10 g 体重，以进行麻醉。注射前，使用脚趾夹捏法评估麻醉水平。
    注意：异氟烷对髓系细胞功能具有显著影响，因此在整个检测过程中应避免使用24,25。
  2. 用 0.5 µl 荧光标记的颗粒溶液填充针头。
  3. 将小鼠侧卧置于手术显微镜下（图 1A-B）。使用柔软材料，例如凝胶包，以更好地固定小鼠体位。对于眼睛尚未睁开的幼鼠，可借助精细的 45o 角度镊子沿眼裂轻轻施力，形成裂隙，使眼睑逐渐打开。
    1. 借助精细的 45o 角度镊子，小心地在眼睑周围施加压力，使眼球轻微突出于眼窝。用两根手指分别固定耳上方和下颌处以稳定头部，并沿眼睑方向轻轻拉伸皮肤，使眼球保持轻微突出状态。注意不要在靠近喉部的位置抓握（图 1B）。
  4. 为穿刺眼球，将注射器针头插入角膜缘（即角膜与巩膜连接处）。在有色小鼠中，此处可见为一灰色环状结构。针头略微回撤，排出少量玻璃体液后进行注射。操作者应一手轻轻固定小鼠，另一手持针；助手则缓慢推动注射器活塞。
  5. 缓慢拔出注射器。滴加眼部保湿液以保持眼球湿润。
  6. 将啮齿类动物置于加热垫上的笼内恢复，并持续监测其状态。若操作对象为幼鼠，在其恢复自主呼吸并能自发活动前，不得将其放回与其他清醒动物共处的笼中。若操作对象为成年动物，则需待其恢复胸卧姿势后，方可将其放回与其他清醒动物共处的笼中。

3. 视网膜组织的收获

注意：应收集未注射荧光标记颗粒的眼睛的视网膜组织，作为流式细胞术分析的对照。尽管该实验可使用单个视网膜进行，但为获得最佳效果，建议将两个视网膜合并在一起使用。

  1. 在玻璃体内注射荧光标记颗粒后 3 小时收集视网膜组织。
    注意：虽然颗粒溶液注射后的时间可根据每个具体实验进行优化，但我们发现注射后 3 小时可在视网膜的大部分层中观察到颗粒摄取（图 1C-D）。
  2. 通过颈椎脱位法处死小鼠。
  3. 使用精细的 45o 角度镊子轻轻按压眼睑，使眼球突出，然后用镊子夹住眼球后方并拉出以收集眼球。
  4. 在解剖显微镜下解剖视网膜。将眼球转移至含有少量含 Ca2+/Mg2+ PBS 的培养皿中。在培养皿的干燥区域，用超细镊子尖端在角膜缘处刺穿眼球。
  5. 用精细的 45o 角度镊子夹住眼球，并使用弹簧剪沿角膜缘剪开，直至大约剪开角膜缘周长的一半。
  6. 用精细的 45o 角度镊子夹住眼球并将其浸入 PBS 中。用另一把精细的 45o 角度镊子撕开角膜和巩膜，晶状体和视网膜将完整地取出。
  7. 分离晶状体和视网膜。收集视网膜并转移至含有 2 ml 含 Ca2+/Mg2+ PBS 的 5.4 ml 聚苯乙烯试管中。

4. 制备单细胞悬液

  1. 使用神经组织解离试剂盒制备单细胞悬液，对生产商说明书进行微小修改。简言之，用P1000移液器反复吹打视网膜组织，并在37 oC下进行酶消化，不振荡。

5. 用于流式细胞术分析的单细胞悬液染色

  1. 将细胞重悬于 200 µl 染色缓冲液（含 0.2% 牛血清白蛋白（BSA）和 0.09% 叠氮化钠的杜氏磷酸盐缓冲液）中，并转移至 U 型底 96 孔板。在 130 × g 条件下离心 5 分钟。
    注意：叠氮化钠对人体和环境有害。请使用适当的个人防护装备，并根据当地法规处理废弃物。
  2. 将板倒置于水槽上方以弃去上清液。为阻断 Fc 受体，每孔加入含 5 µg/ml 抗小鼠 CD16/CD32 抗体的 25 µl 染色缓冲液重悬细胞。室温孵育 5 分钟。
  3. 加入含 0.5 µg/ml 抗小鼠 Ly6C-APC-Cy7、0.5 µg/ml 抗小鼠 Ly6G-Pe-Cy7 和 2.5 µg/ml 抗小鼠 CD11b-AF650 的染色缓冲液 25 µl。避光室温孵育 15 分钟。
  4. 在 130 × g 条件下离心 5 分钟。倒置板以弃去上清液。用 200 µl 染色缓冲液重悬细胞进行洗涤。
  5. 在 130 × g 条件下离心 5 分钟。将细胞重悬于含 0.5 µg/ml 碘化丙啶（PI）的 200 µl 染色缓冲液中。转移至 1.2 ml 微量滴定管中。
  6. 用额外的 100 µl 含 0.5 µg/ml PI 的染色缓冲液洗涤各孔，并与之前 200 µl 液体合并至 1.2 ml 微量滴定管中。最终获得 300 µl 染色细胞悬液。

6. 流式细胞术分析

  1. 使用传统的三激光（紫色、蓝色和红色激光）系统时，应避免使用 PE、PerCP-Cy5.5、BV510 和 PI 荧光染料，因为荧光标记的 AF488 颗粒信号极强，会产生显著的荧光溢出。建议使用第四根（黄色）激光以优化本实验，因其可允许使用 PE 标记的抗体以及将 PI 检测通道转移至 mCherry 通道（而非 PerCP-Cy5.5 通道）（图 2）。
    注意：若无黄色激光，可在其他通道中使用死细胞排除染料。
  2. 设门圈选 PI 阴性细胞（PI-），以排除死细胞（图 2B）。
  3. 在排除死细胞后，设门圈选 CD11b 阳性细胞（CD11b+），该群包含所有髓系细胞（图 2C）。
  4. 在 CD11b+ 细胞群中，进一步设门圈选 Ly6C-/Ly6G- 细胞，以排除中性粒细胞（CD11b+/Ly6G+）和单核细胞（CD11b+/Ly6C+；图 2D）。在微胶质细胞设门后（此处为简化定义为 CD11b+/Ly6C-/Ly6G-），应可见两个明显细胞群：一个为荧光标记颗粒阴性，另一个为阳性。吞噬性细胞已摄取颗粒，因此表现为 AF488+（图 2E）。
    注意：也可分析 Ly6C 阳性或 Ly6G 阳性细胞群，以通过该染色方法检测颗粒摄取情况。吞噬性 CD11b+ 细胞的比例与吞噬性微胶质细胞的比例具有良好的相关性（图 2F）。对于无流式细胞术经验的研究人员，可仅使用 CD11b 染色进行更简单的分析，但该方法将同时包含吞噬性中性粒细胞、单核细胞及微胶质细胞。在 CD11b+/Ly6C-/Ly6G- 细胞群中，根据 F4/80 和 CX3CR1 标记物染色判断，这些细胞> 99% 为微胶质细胞；这些标记物可添加使用，但在本实验中非必需。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

本文介绍了一种在生理条件下利用流式细胞术快速、可靠地定量吞噬性视网膜小胶质细胞数量的方法。图2). 该方法可适用于检测化合物和/或基因操作对小胶质细胞吞噬能力的影响图3A、图3B）。也可用于幼年（出生后10–20天）或成年小鼠（图3C）。通过腹腔注射不同剂量的脂多糖（LPS）。LPS刺激24小时后，采用本文所述方案评估视网膜小胶质细胞的吞噬功能（图3A）。与对照组相比，1.42 mg/kg 剂量的 LPS 显著增加了吞噬性小胶质细胞的比例（图3B），这符合预期26.

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

该方法包含三个关键步骤：（1）玻璃体内注射荧光标记颗粒；（2）视网膜组织的采集与制备；（3）流式细胞术分析。我们建议研究人员在实施本方法前先练习玻璃体内注射。白化小鼠（Albino mice）例如，BALB/c）和一种有色溶液（例如， 荧光标记的颗粒）可用于方便地观察针头和注射溶液。玻璃体内注射操作具有挑战性，若操作不当将导致结果出现偏差且变异较大。注射技术不佳常引发的问题包括晶状体穿孔和/或视网膜损伤，可能导致出血和炎症。为最大限度降低眼部创伤风险，应使啮齿类动物保持稳定体位，尽量减少头部移动。穿刺眼球时，应缓慢插入注射器，避免推进过深而触碰晶状体。另一常见并发症是注射物质从眼内反流。为避免此情况，应缓慢按压推杆；注射完成后，应让眼球自然回缩至眼窝，再缓慢撤出注射器。理想的玻璃体内注射仅引起轻微的小胶质细胞活化，但未处理组与处理组之间仍可观察到明显差异。必须设置适当的对照组（例如， 未接受刺激的小鼠）在每次实验中用于建立基础吞噬水平。该方法中另一个需要熟练掌握的方面是视网膜解剖。为确保不同样本间获得可比的单细胞悬液，必须迅速获取视网膜组织，并尽量减少组织损伤。在PBS中进行解剖的最...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

Salome Murinello 获美国糖尿病协会基金（编号：1-16-PDF-072）资助。本研究获得 Martin Friedlander 收到的美国国立卫生研究院（国家眼科研究所 EY11254 和 EY22025）以及 Lowy 医学研究所研究基金的资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
体视显微镜Nikon已停产
Hamilton 注射器，600系列Sigma26702
33号针头，小柄RN针，0.5英寸，4型针尖 - 12oHamilton7803-05
Zymosan A（S. cerevisiae）BioParticles，Alexa Fluor 488偶联物ThermoFisher ScientificZ-23373注射前立即配制
DPBSCorning21-030-CV
Dumont #5/45 镊子Fine Science Tools11251-35需要两个
Dumont #5SF 镊子Fine Science Tools11252-00
Vannas弹簧剪 - 3 mm切割刃Fine Science Tools15000-10弯曲型
神经组织解离试剂盒 – 新生神经元Miltenyi Biotec130-094-802
5 ml 聚苯乙烯圆底管Falcon352054
96孔U型底板Falcon353077
染色缓冲液（BSA）BD Biosciences554657
CD11b-BV650 抗体BioLegend101259
Ly6C-APC-Cy7BioLegend128025
Ly6G-PE-Cy7BioLegend127617
碘化丙啶BD Biosciences556463
纯化抗小鼠CD16/32抗体BioLegend101301

参考文献

  1. Gomez-Nicola, D., Perry, V. H. Microglial dynamics and role in the healthy and diseased brain: a paradigm of functional plasticity. Neuroscientist. 21, 169-184 (2015).
  2. Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biol. 8, e1000527(2010).
  3. Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74, 691-705 (2012).
  4. Sierra, A., et al. Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis. Cell Stem Cell. 7, 483-495 (2010).
  5. Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).
  6. Chan, G., et al. CD33 modulates TREM2: convergence of Alzheimer loci. Nat Neurosci. 18, 1556-1558 (2015).
  7. Murinello, S., Mullins, R. F., Lotery, A. J., Perry, V. H., Teeling, J. L. Fcgamma receptor upregulation is associated with immune complex inflammation in the mouse retina and early age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 247-258 (2014).
  8. Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
  9. Derecki, N., Cronk, J., Kipnis, J. Assay of phagocytic function in primary murine microglia. Protoc Exchange. , (2012).
  10. Fricker, M., Oliva-Martin, M. J., Brown, G. C. Primary phagocytosis of viable neurons by microglia activated with LPS or Abeta is dependent on calreticulin/LRP phagocytic signalling. J Neuroinflammation. 9, 196(2012).
  11. Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines. J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).
  12. Neher, J. J., et al. Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death. J Immunol. 186, 4973-4983 (2011).
  13. Fricker, M., et al. MFG-E8 mediates primary phagocytosis of viable neurons during neuroinflammation. J Neurosci. 32, 2657-2666 (2012).
  14. Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease. J Neurosci. 31, 11159-11171 (2011).
  15. Neher, J. J., et al. Phagocytosis executes delayed neuronal death after focal brain ischemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4098-E4107 (2013).
  16. Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice. J Neuroinflammation. 8, 174-174 (2011).
  17. Preissler, J., et al. Altered microglial phagocytosis in GPR34-deficient mice. Glia. 63, 206-215 (2015).
  18. Hughes, M. M., Field, R. H., Perry, V. H., Murray, C. L., Cunningham, C. Microglia in the degenerating brain are capable of phagocytosis of beads and of apoptotic cells, but do not efficiently remove PrP(Sc), even upon LPS stimulation. Glia. 58, 2017-2030 (2010).
  19. Westenskow, P. D., et al. Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived RPE cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 6282-6290 (2012).
  20. London, A., Benhar, I., Schwartz, M. The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders. Nat Rev Neurol. 9, 44-53 (2013).
  21. Fritzenwanger, M., Jung, C., Goebel, B., Lauten, A., Figulla, H. R. Impact of short-term systemic hypoxia on phagocytosis, cytokine production, and transcription factor activation in peripheral blood cells. Mediators Inflamm. , 429501(2011).
  22. Ragsdale, R. L., Grasso, R. J. An improved spectrofluorometric assay for quantitating yeast phagocytosis in cultures of murine peritoneal macrophages. J Immunol Methods. 123, 259-267 (1989).
  23. Stokes, L., Surprenant, A. Dynamic regulation of the P2X4 receptor in alveolar macrophages by phagocytosis and classical activation. Eur J Immunol. 39, 986-995 (2009).
  24. Kotani, N., et al. Intraoperative modulation of alveolar macrophage function during isoflurane and propofol anesthesia. Anesthesiology. 89, 1125-1132 (1998).
  25. Xu, X., Feng, J., Zuo, Z. Isoflurane preconditioning reduces the rat NR8383 macrophage injury induced by lipopolysaccharide and interferon gamma. Anesthesiology. 108, 643-650 (2008).
  26. abd-el-Basset, E., Fedoroff, S. Effect of bacterial wall lipopolysaccharide (LPS) on morphology, motility, and cytoskeletal organization of microglia in cultures. J Neurosci Res. 41, 222-237 (1995).
  27. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. , (2014).
  28. Jackson, W. S. Selective vulnerability to neurodegenerative disease: the curious case of Prion Protein. Dis Model Mech. 7, 21-29 (2014).
  29. O'Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Sci Rep. 6, 20636(2016).
  30. Usui, Y., et al. Angiogenesis and Eye Disease. Annu Rev Vision. 1, 155-184 (2015).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

视网膜小胶质细胞玻璃体内注射荧光颗粒组织解离细胞悬液Fc受体阻断活率染料LPS刺激
评估视网膜小胶质细胞的吞噬功能 体内 使用基于流式细胞术的检测方法
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。