评估视网膜小胶质细胞吞噬功能在体内使用基于流式细胞术流量测定

Summary

在组织的动态平衡和吞噬功能不足的维护工作在病理上被牵连的小胶质细胞的吞噬作用是至关重要的。然而， 在体内评估小胶质细胞的功能在技术上具有挑战性。我们已经开发出一种简单而坚固的技术用于精确监测和量化小胶质细胞的吞噬潜力在生理环境。

Abstract

小胶质细胞是中枢神经系统 （CNS） 的组织驻留巨噬细胞，它们执行多种支持 CNS 稳态的功能，包括对受损突触或细胞、碎片和/或侵入病原体的吞噬作用。吞噬功能受损与阿尔茨海默病和年龄相关性黄斑变性等疾病的发病机制有关，其中淀粉样蛋白β斑块和玻璃膜疣分别积累。尽管小胶质细胞吞噬作用很重要，但体内评估一直具有挑战性。在这里，我们描述了一种简单而强大的技术，用于精确监测和量化视网膜小胶质细胞的体内吞噬潜力。以前的方法依赖于免疫组织化学染色和成像技术。我们的方法使用流式细胞术来测量活啮齿动物玻璃体内输送到眼睛后小胶质细胞对荧光标记颗粒的摄取。这种方法取代了涉及费力的组织切片、免疫染色和成像的传统做法，从而可以在不到 6 小时内更精确地量化小胶质细胞吞噬功能。该程序也可用于测试各种化合物如何在生理环境中改变小胶质细胞吞噬作用。虽然这项技术是在眼睛中开发的，但它的用途不仅限于视觉研究。

Introduction

该方法的总的目标是要准确评估和体内小胶质细胞吞噬量化。小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）的组织驻留的巨噬细胞。它们执行各种功能，以确保组织稳态的维持。这些包括免疫监视，神经营养因子的分泌，并为至关重要，吞噬作用^1。小胶质细胞的吞噬作用是在诸如无关突触（突触修剪）和去除神经元凋亡^2-4的吞噬大脑和视网膜的发育过程中的几个重要事件的关键。此外，损坏或凋亡细胞，细胞碎片和入侵微生物的小胶质细胞的吞噬作用已被证明是通过成年⁵维持CNS动态平衡是至关重要的。最后，小胶质细胞的吞噬作用已牵涉几种神经变性疾病，包括阿尔茨海默病和与年龄有关的发病黄斑变性，它已被认为有缺陷或不足的吞噬能力可能有助于淀粉样蛋白β（Aβ）斑块和玻璃疣，分别^6,7的积聚。

小胶质细胞功能紧密可以通过微调节，特别是通过可溶性因子如肿瘤生长因子β或细胞 - 细胞相互作用。神经元组成型表达几个细胞表面配体，例如CD200和CX3CL1，而小胶质细胞只表达相应受体CD200R和CX3CR1。这些受体包含在它们的细胞内部分基于免疫受体酪氨酸的抑制基序（ITIMs）。这些抑制剂受体是用于防止小胶质细胞的过度刺激，从而可以向神经炎症的关键。因此，在正常生理条件下，神经元和小胶质细胞之间的细胞 - 细胞相互作用保持小胶质细胞处于静止状态。在组织损伤，然而，神经细胞可下调EXP这些配体的ression，除去小胶质细胞活化的抑制效果。小胶质细胞的功能（包括吞噬），因此紧密相连的微环境^8。然而，到目前为止，还没有标准的测定法来研究小胶质细胞吞噬作用在生理环境或在完全复制其中枢神经系统微环境的一种方式。

几个实验已经开发来测量体外 ，其中primary胶质或小胶质细胞系是与靶细胞（ 例如 ，神经细胞凋亡），或荧光标记的珠培养的小胶质细胞的吞噬活性。那么目标摄取使用荧光显微成像或者流式细胞仪^9-12评估。这些检测允许药理或遗传操纵可能会如何影响小胶质细胞的吞噬功能，虽然信息量大，无法完全复制体内环境的复杂的测试。审查小胶质细胞吞噬间接的方法在体内已经报道:这些是由被认为参与在吞噬作用（ 例如，CD68）分子的染色来实现，评估小胶质细胞和目标吞噬（ 例如 ，受损的神经元或突触元素）的物理接近度，或通过吞噬的免疫组化检测小胶质细胞内的目标（ 例如^{，Aβ）13-17。}两项研究使用更直接的方法来评估在体内的小胶质细胞的吞噬功能。休斯和他的同事用成像技术来衡量通过颅内航线^18条交付珠小胶质细胞摄取。塞拉等人开发了一种精制方法定量评估使用复杂的成像技术⁴凋亡细胞的小胶质细胞吞噬作用。然而，这些方法涉及用于组织制备，切片，成像和分析复杂的协议。我们在以前使用的流式细胞仪分析，以评估感光吞噬了通过在培养¹⁹视网膜色素上皮（RPE）细胞器段。这里，我们描述了协议来快速评估摄取荧光标记颗粒视网膜小胶质细胞在体内的小胶质细胞的吞噬作用的定量量度。

我们在这里描述的协议允许在三个关键步骤在不到6小时视网膜小胶质细胞吞噬的可靠和定量测量:（1）荧光标记的粒子的玻璃体内递送，（2）收获并制备视网膜组织的，和（3）流流式细胞仪分析。我们开发的方法是，以评估视网膜的小神经胶质细胞吞噬一个健壮的方法，它可以成功地用于测试各种不同的化合物或遗传操作如何改变在生理设置该键小胶质细胞的功能。由于中枢神经系统的一个专门区域，视网膜是研究小神经胶质细胞功能²⁰的方便模式系统。虽然这种方法是在T开发他的眼睛，我们相信它可以为研究小神经胶质细胞吞噬功能全部神经学家有用。

Protocol

所有动物均按照由斯克里普斯研究所制定的道德准则处理。

1.注射材料的制备

1. 消毒一个33克的针头和注射器:在^115οC.拆卸和高压灭菌器通过在无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）上升准备用于注射的针。
2. 解冻在室温下进行5荧光标记的粒子 - 10分钟。通过重构在无菌PBS 50毫克/毫升溶液中^钙 /镁^离子制备颗粒溶液注射。
   注:已验证的吞噬检测真菌来源的AF488标记的粒子在这个协议中^21-23使用。为了达到最佳的吸收，准备颗粒新鲜，并立即注射前。
   注2:颗粒浓度可为每个特定实验进行优化。

2.珠解决方案的玻璃体腔注射

注:两个P需要eople执行注射，在某种程度上，使得执行注射可按住鼠标和保持的焦点上的眼球，而其他人传递加载的注射器和推动柱塞的人。

1. 麻醉以100毫克/毫升氯胺酮和10mg / ml的甲苯噻嗪腹膜内注射的啮齿动物的剂量20微升/ 10克体重的。注射前，用脚趾捏来评估麻醉水平。
   注:异氟醚对髓样细胞功能具有深刻的影响，因而，其在本测定法中使用，应避免^24,25。
2. 负载针用0.5微升荧光标记的颗粒溶液。
3. 莱鼠标侧身手术显微镜（ 图1A-B）之下。使用软质材料， 如凝胶包，为鼠标的更好的定位。对于年轻小鼠中，眼睛还没有开放，轻轻创建一个fissu打开细^45°直角钳的帮助下眼睑沿切口重新从眼睑最终将打开。
   1. 以优良的^45°直角钳的帮助下仔细施加压力，周围的眼睑，使眼球轻微突出插槽。用两个手指就在耳朵上面并由其下颚握住头和并行皮肤轻轻拉伸到眼皮稍微保持眼睛从插座中。要小心，不要抓太靠近咽喉（ 图1B）。
4. 穿刺眼球，将注射器的针头在角膜缘（其中角膜和巩膜连接）。这是在色素小鼠灰色圆圈可见。缩回针稍微驱逐玻璃体液中的一小体积，然后注入。在进行注射用一只手，并与其他的针应轻轻握住鼠标的人;第二个人应该慢慢推柱塞。
5. 慢慢地缩回注射器。敷眼滴保湿，保持眼部水分。
6. 让啮齿动物在笼子里过隔热垫恢复，并继续监测动物。如果有幼崽时，请勿动物恢复到与其他动物的警戒，直到呼吸，并且能够自发运动的笼子。如果与成人的工作，不要啮齿动物恢复到与其他警报动物笼子里，直到它重新获得胸骨靠着。

3.视网膜组织的收获

注:从眼睛与荧光标记的颗粒注入视网膜组织应当收集作为流式细胞分析控制。虽然该试验可以使用单个视网膜中进行，以获得最佳性能，二视网膜应一起合并。

1. 荧光标记的粒子的玻璃体内注射后收集视网膜组织3小时。
   注意:当颗粒溶液注射后时间可以为每个特定实验进行优化，我们发现，在注射后3小时，粒子的摄取可以在大多数的层ö看出F中的视网膜（ 图1C-D）。
2. 通过颈椎脱位牺牲小鼠。
3. 通过对细^45°角度的钳的帮助下proptose眼球眼睑轻轻按压收集眼球。放置眼球和拉后面的钳子。
4. 解剖解剖显微镜下视网膜。转移眼球到含有PBS中少量与^钙 /镁^离子培养皿。在培养皿的干燥区域，穿孔与超细镊子的末端的角膜缘的眼球。
5. 握住精45 ^度直角钳的帮助下，眼球和使用弹簧剪刀削减各地的角膜缘，直到角膜缘周围的大约一半被切断。
6. 握住精45 ^度直角钳眼球和带来眼球到PBS。随着第二对罚款^45°直角钳撕裂的角膜和巩膜分开。该晶状体和视网膜会出来我ntact。
7. 分离晶状体和视网膜。收集视网膜和转移到含2毫升的PBS与^钙 /镁^离子一5.4毫升聚苯乙烯试管中。

4.准备单细胞悬液

1. 准备使用具有小的修改，以制造商的说明一个神经元组织解离试剂盒单细胞悬浮液。简而言之，磨碎视网膜吹打向上和向下P1000的吸管和无晃动表演在^37℃酶消化。

5.染色单细胞悬浮液的流式细胞仪分析

1. 悬浮细胞在200μl染色缓冲液（Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水含有0.2％牛血清白蛋白（BSA）和0.09％叠氮化钠），并转移到一个U型底96孔板中。离心机在130×g下5分钟。
   注:叠氮化钠对人体是有害和环境。使用适当的个人防护设备第二，根据当地法规丢弃垃圾。
2. 反转板在水槽上方，以弃上清。要阻止Fc受体，悬浮细胞在25微升含有抗CD16鼠/ CD32抗体的5微克/毫升，每孔染色缓冲。孵育在室温下5分钟。
3. 添加25微升含0.5微克/毫升的抗小鼠的Ly6C-APC-Cy7的的，抗小鼠Ly6G-PE-Cy7的0.5微克/毫升和2.5微克/毫升的抗小鼠的CD11b-AF650的染色缓冲液中。孵育在黑暗中在室温下15分钟。
4. 离心机在130×g下5分钟。反转板弃上清。通过在200μl的染色缓冲液中重悬浮细胞洗。
5. 离心机在130×g下5分钟。重悬在200μl含有0.5微克/毫升碘化丙啶（PI）的染色缓冲液中。转移至1.2ml微量管。
6. 洗井用另外100微升的染色缓冲液中含有0.5微克/毫升PI和池与前将200μl的1.2毫升微量管。得到的300微升染色的细胞的总体积。

6.流式细胞仪分析

1. 使用传统的三个激光（紫色，蓝色和红色激光），避免PE，PerCP-经Cy5.5，BV510，并且由于显著溢出从非常明亮的荧光AF488粒子PI染料。使用的第四（黄色）激光来优化该试验中，因为它允许在PE标记的抗体和PI（在mCherry通道代替PerCP-经Cy5.5通道）的使用（ 图2）。
   注意:如果一个黄色激光不可用，在另一个信道使用死细胞排除染料。
2. 门上的PI阴性细胞（PI-）排除死细胞（ 图2B）。
3. 不含死细胞，对细胞CD11b阳性细胞（细胞CD11b ^+）门之后，这将包括所有的骨髓细胞（ 图2C）。
4. 内的CD11b ⁺人口，门上的Ly6C ^- / Ly6G ^-排除嗜中性粒细胞（细胞CD11b ⁺ / Ly6G ^+）和单核细胞（细胞CD11b ⁺ /的Ly6C ^+; 图2D）。门控小胶质细胞（ ^- / Ly6G ^-这里被定义为的CD11b ⁺ /的Ly6C为简单起见）后，两个明显的群体应该是可见的;一个负和一个正对荧光标记的粒子。吞噬细胞将已经采取了粒子，因此是AF488 ^+（ 图2E）。
   注:的Ly6C积极或Ly6G阳性群体也可以利用分析这种染色方法来测量粒子的吸收。吞噬细胞CD11b ⁺细胞的百分比与吞噬小胶质细胞的百分比（ 图2F）良好相关。研究人员不流式细胞经验，可以进行单独的CD11b染色更简单的分析，尽管这将包括吞噬嗜中性粒细胞和单核细胞，以及小胶质细胞。在此的CD11b ⁺ /的Ly6C ^- / Ly6G ^{- <}/ SUP>人口，这些细胞> 99％的小胶质细胞通过用标记F4 / 80和CX3CR1染色来判断;这些标记可以添加，但并不在我们手中必要的。

Results

在这里，我们描述了一种方法，使用流式细胞术分析（ 图2）迅速且可靠地量化在生理环境吞噬视网膜小胶质细胞的数量，该方法可适于测试上的吞噬能力的化合物和/或遗传操作的效果小胶质细胞（ 图3A，3B）。 （ - 1天产后10）或成年小鼠（ 图3C）也可在年轻使用。不同剂量的脂多糖（LPS）的腹膜内给药。 24小时后LPS攻击，这里所描述的协议被用来评估视网膜小胶质细胞吞噬功能（ 图3A）。与载体对照相比（ 图3B）时，正如所预料的²⁶的1.42毫克/ kg的剂量的LPS诱导的吞噬小胶质细胞的百分比在统计学上显著增加。

Discussion

有在该方法中三个关键步骤:（1）荧光标记的粒子的玻璃体内注射液; （2）收集和准备视网膜组织;及（3）流式细胞仪分析。我们建议研究实行前履行我们在座的方法，玻璃体内注射。白化小鼠（ 例如 BALB / c）和有色溶液（ 例如，荧光标记的颗粒）可用于针的容易可视化和注入溶液。玻璃体内注射是具有挑战性的，如果不正确执行会导致偏见和不同的结果。与注射技术差相关的常见问题是在透镜和/或损害视网膜，这可能会导致出血和炎症的穿孔。为了尽量减少创伤到眼睛的风险，啮齿动物应该以最小的头部运动一个稳定的位置。穿透眼球，注射器应缓慢而不是插入推得太远，避免击球镜头。另一种常见的并发症是注射材料的回流出眼球。为了避免这种情况，柱塞应缓慢压下和，在注射后，眼球应该允许缩回到眼窝和注射器应缓慢缩回。最好玻璃体内注射以低水平激活的小胶质细胞，但未经处理的组和治疗组之间有明显的差异可以被测量。至关重要的是，适当的对照（ 例如，非攻击小鼠）在各实验中用于建立基线吞噬水平。需要实践本方法的另一个方面是视网膜剥离。为了确保整个标本的单相媲美细胞制剂，视网膜组织必须迅速并以最小可能的组织破坏收集。表演在PBS解剖的最后一...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
立体显微镜	Nikon	已停产
Hamilton 注射器，600系列	Sigma	26702
33 号，小轮毂 RN NDL，0.5 英寸，点式 4 - 12o	Hamilton	7803-05
酵母聚糖 A （S. cerevisiae） 生物颗粒，Alexa Fluor 488 偶联物	ThermoFisher Scientific	Z-23373	注射前立即准备
DPBS	康宁	21-030-CV
Dumont #5/45 镊子	精细科学工具	11251-35	需要两个
Dumont #5SF 镊子	精细科学工具	11252-00
Vannas 弹簧剪刀 - 3 毫米 尖端	精细科学工具	15000-10	弯曲
神经组织解离套件 –产后神经元	Miltenyi Biotec	130-094-802
5 ml 聚苯乙烯圆底管	Falcon	352054
96 孔 U 型底板	Falcon	353077
染色缓冲液 （BSA）	BD Biosciences	554657
CD11b-BV650 抗体	BioLegend	101259
Ly6C-APC-Cy7	BioLegend
Ly6G-PE-Cy7	BioLegend	127617
碘化丙啶	BD Biosciences 556463
纯化的抗小鼠 CD16/32 抗体	BioLegend	101301