检测G蛋白偶联受体对G蛋白选择性激活的简便方法，目前仍是细胞信号转导领域尚未解决的挑战。本文通过将G蛋白偶联受体（GPCR）与G蛋白肽段成对锚定，构建了基于福斯特共振能量转移（FRET）的生物传感器，可在活细胞中以可控浓度探测构象变化。
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摘要
摘要
基于 Förster 奏鸣能量转移（FRET）的研究在 GPCR 信号转导研究中日益普遍。本研究团队开发了一种分子内 FRET 传感器，用于检测激动剂刺激后活细胞中 Gα 亚基与 GPCR 之间的相互作用。本文详细描述了在 100 µM 盐酸异丙肾上腺素处理下，检测 β2-肾上腺素受体与 Gαs C 末端肽段之间 FRET 变化的实验方案，该条件此前已有表征1。我们的 FRET 传感器为单一多肽链，依次包含全长 GPCR、FRET 受体荧光蛋白（mCitrine）、ER/K SPASM（系统性蛋白亲和力强度调控）连接子、FRET 供体荧光蛋白（mCerulean）以及 Gα 亚基 C 末端肽段。本方案将详细说明细胞准备、转染条件、仪器设置、实验操作及数据分析流程。该实验设计可检测反映蛋白质-蛋白质相互作用的微小 FRET 变化，也可用于比较不同配体及 GPCR-G 蛋白配对间相互作用强度的差异。为提高测量中的信噪比，本方案要求各步骤均具备较高精确度，本文呈现此流程旨在实现可重复的操作执行。
引言
G蛋白偶联受体（GPCR）是一类具有七个跨膜结构域的受体。仅人类基因组就包含约800个编码GPCR的基因，这些受体可被多种配体激活，包括光、气味分子、激素、肽类、药物及其他小分子。目前市场上近30%的药物以GPCR为靶点，因为它们在多种疾病状态下发挥重要作用2。尽管数十年来对这一受体家族进行了广泛研究，该领域仍存在许多尚未解决的重要问题，尤其是关于驱动GPCR与效应蛋白相互作用的分子机制。迄今为止，仅发表了一例高分辨率的晶体结构，揭示了β2-肾上腺素能受体（β2-AR）与Gs蛋白之间的相互作用3。结合过去三十年的大量研究，该结构再次强调了一个在该相互作用中至关重要的特定结构元件：Gα亚基的C末端。这一结构对GPCR介导的G蛋白激活4以及G蛋白的选择性识别5-6均具有重要意义。因此，Gα亚基的C末端在GPCR配体刺激与选择性G蛋白激活之间起到了关键的连接作用。
过去十年的研究表明，G蛋白偶联受体（GPCR）存在于广泛的构象状态中，配体结合可稳定特定的GPCR构象亚群。尽管已有多种技术可用于研究GPCR的构象动态，包括X射线晶体学、核磁共振（NMR）、荧光光谱法和质谱法，但在阐明这些构象在效应蛋白选择中的功能意义方面，仍缺乏有效的方法。7在此，我们概述一种基于荧光共振能量转移（FRET）的方法，用于检测G蛋白选择性的G蛋白偶联受体（GPCR）构象。FRET依赖于两个荧光基团之间的近距离和取向平行，且其发射光谱（供体）与激发光谱（受体）需存在重叠8随着蛋白质构象变化或蛋白质-蛋白质相互作用导致供体和受体荧光团相互靠近，它们之间的荧光共振能量转移（FRET）增强，可通过多种方法进行检测。8基于FRET的生物传感器已在GPCR研究领域得到广泛应用9它们已被用于通过在G蛋白偶联受体（GPCR）的第三胞内环和C末端插入供体与受体，来探测GPCR的构象变化；此外，还设计了传感器，通过用一对FRET荧光标记物分别标记GPCR及其效应蛋白（G蛋白亚基/阻遏蛋白），来探测GPCR与效应蛋白之间的相互作用。10；某些传感器还能检测G蛋白的构象变化11这些生物传感器使研究人员能够提出大量关键科学问题，包括G蛋白偶联受体（GPCR）和效应蛋白的构象变化、GPCR与效应蛋白相互作用的动力学，以及变构配体的相关特性。12我们课题组特别致力于开发一种生物传感器，用于在激动剂驱动条件下检测G蛋白特异性的G蛋白偶联受体（GPCR）构象。该生物传感器依赖于一种 recently developed 的技术，称为SPASM（systematic protein affinity strength modulation）。13SPASM 技术利用 ER/K 连接子将相互作用的蛋白质结构域进行锚定，从而调控其有效浓度。在连接子两侧连接一对荧光共振能量转移（FRET）荧光团，可构建一种能够报告蛋白质间相互作用状态的检测工具。12. 之前1 SPASM 模块用于将 Gα 蛋白的 C 末端锚定至 G 蛋白偶联受体（GPCR），并利用 FRET 荧光探针 mCitrine（在本方案中以其广为人知的变体黄色荧光蛋白（YFP）表示，激发/发射峰为 490/525 nm）和 mCerulean（在本方案中以其广为人知的变体青色荧光蛋白（CFP）表示，激发/发射峰为 430/475 nm）监测它们之间的相互作用。该基因编码的单一多肽链从 N 末端到 C 末端依次包含：全长 GPCR、FRET 受体（mCitrine/YFP）、10 nm ER/K 连接子、FRET 供体（mCerulean/CFP）以及 Gα 蛋白 C 末端肽段。在本研究中，传感器简写为 GPCR-连接子长度-Gα 肽段。所有组分之间均由无规卷曲结构的（Gly-Ser-Gly）序列分隔。4 连接子，可使每个结构域自由旋转。此前已利用两种典型的G蛋白偶联受体（GPCR）：β2-雄激素受体和视蛋白1.
将该传感器瞬时转染至HEK-293T细胞中，并基于荧光计开展活细胞实验，以每秒计数（CPS）的任意单位测量FRET荧光对在有或无配体存在下的荧光光谱。利用这些测量数据计算荧光团之间的FRET比值（YFPmax/CFPmax）。通过从配体处理样本的FRET比值中减去未处理样本的平均FRET比值，进一步计算出FRET变化值（ΔFRET）。可在不同构建体之间比较ΔFRET（如β2-AR-10 nm-Gαs肽与β2-AR-10 nm-无肽）。本文详细描述了在活体HEK-293T细胞中表达这些传感器、监测其表达水平，以及针对未处理与药物处理条件进行基于荧光计的活细胞FRET测量的设置、操作和数据分析的实验方案。尽管本方案专用于经100 µM异丙肾上腺素酒石酸盐处理的β2-AR-10 nm-Gαs肽传感器，但其可针对不同的GPCR-Gα配对及配体进行优化。
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方案
1. DNA 制备
- 使用模块化克隆方案设计传感器构建体。请参考先前详细描述的β2-AR传感器设计1。
- 根据商业质粒小提试剂盒说明书提取DNA，并用2 mM Tris-HCl溶液（pH 8）洗脱，浓度≥ 750 ng/µl，A260/A280比值为1.7 - 1.9，A260/A230比值为2.0 - 2.29。
2. 细胞培养准备
- 在含有4.5 g/L D-葡萄糖的DMEM培养基中培养HEK-293T-Flp-n细胞，添加10%胎牛血清（经热灭活）（v/v）、1% L-谷氨酰胺补充剂、20 mM HEPES（pH 7.5），于37 °C、5% CO2的加湿环境中培养。后续操作均需在生物安全柜中进行。
- 传代至6孔板前，让细胞生长至完全汇合的单层状态。达到汇合所需时间取决于初始接种密度。用于6孔板接种的细胞应选择在接种后1–2天内达到汇合的培养皿。一个10 cm组织培养处理过的培养皿在完全汇合时，细胞密度约为4 × 106 个细胞/ml。细胞培养生长情况参见图1。
- 用10 ml PBS洗涤细胞，然后用0.25%胰蛋白酶消化（见讨论部分第2段）。将8 × 105 个细胞/孔接种于组织培养处理过的6孔板中，每孔加入2 ml培养基，孵育16–20小时使其贴壁。
3. 转染条件
- 对于可能需要不同时间达到最佳表达水平（20 - 36 小时）的构建体，应错开转染时间，以同步实验条件，确保整个实验在统一的时间点进行。同时设置一个未转染的对照孔，其细胞密度与实验组相当，用于在后续分析中扣除背景噪声和散射信号。
- 将转染试剂恢复至室温：低血清培养基、DNA 和转染试剂。
- 在生物安全柜中，将试剂按以下顺序加入无菌微量离心管中：将 2 µg DNA 与 100 µl 低血清培养基混合。将 6 µl 转染试剂加入 DNA/培养基混合物中，注意不要接触混合液表面或管壁。每孔设置一个独立的转染反应。可根据需要优化转染条件（DNA 用量 1 - 4 µg，转染试剂用量 3 - 6 µl），以获得稳定的表达水平。更多优化比例参见表 1。
- 将混合物在生物安全柜中室温孵育 15 - 30 分钟。若孵育时间超过 30 分钟，则不应再使用该反应体系。
- 以逐滴方式将反应液加入孔中，并轻轻摇晃六孔板，确保充分混匀。每孔加入一个转染反应体系。
- 转染 20 小时后，使用组织培养荧光显微镜检测荧光表达。使用 10X 物镜评估群体表达情况，使用 40X 物镜观察单个细胞中蛋白的定位。重点观察蛋白在质膜（PM）上的表达。若发现明显的蛋白内化现象，应继续监测转染情况，直至质膜上出现显著表达信号。
4. 试剂与仪器准备
- 配制100 mM药物储备液，并于-80 °C保存：异丙肾上腺素酒石酸盐（溶于含300 mM抗坏血酸的dH2O中，终浓度为100 mM）。在冰上或冷室中配制，并立即进行速冻。可分装保存，一年内使用。
- 配制细胞缓冲液（每种条件约需2 ml），置于37 °C水浴中预热。每日新鲜配制。缓冲液成分参见表2。
- 配制药物缓冲液（10 ml），室温保存。缓冲液成分参见表2。
- 使用浓盐酸对比色皿进行酸洗，随后用弱碱（1 M KOH）中和，并用dH2O彻底冲洗比色皿。
- 在荧光仪周围准备工作站，配备若干盒10、200和1,000 µl移液器吸头，设置10分钟倒计时的计时器，连接便于清洗比色皿的真空管线及吸头，准备洁净擦拭纸巾，以及装有超纯H2O的冲洗瓶。
- 将荧光仪外置水浴和加热金属块预热至37 °C。
- 开启荧光仪；设置CFP检测参数：激发波长430 nm，带宽8 nm；发射波长范围450 nm - 600 nm，带宽4 nm。仅用于传感器对照的YFP检测（参见讨论部分），设置激发波长为490 nm，带宽8 nm，发射波长范围500 - 600 nm，带宽4 nm。本实验将采用CFP检测参数采集FRET光谱。
- 如下图图2所示，将十二个1.5 ml微量离心管放置于加热金属块中，作为细胞分装管（500 µl微量离心管）的支架。在1号和7号支架中放入小块组织，以缓冲放置于其中的比色皿。
注意：为避免交叉污染，未处理组和药物处理组应使用独立的比色皿。
图2. 微量离心管在加热块中的设置及位置参考。未处理样本的比色皿位于位置1；细胞分装管位于位置2至6。药物处理样本的比色皿位于位置7；细胞分装管位于位置8至12。请点击此处查看此图的放大版本。
- 在2-6号和8-12号槽中各加入约750 µl水，以形成小型37 °C水浴。
- 将十个用于细胞分装的500 µl微量离心管放入小型水浴槽（2-6号和8-12号槽）中。每支试管代表该条件下的一个独立重复（5支未处理，5支药物处理）。
- 监测细胞的表达情况（参见步骤3.6）。
5. 实验与数据采集
图3. 实验示意图。 实验设置与操作的详细分步指南。 请点击此处查看该图的放大版本。
- 参考文献 图3 用于实验示意图。当细胞达到收获条件时（根据荧光显微镜检测到的蛋白表达情况判断，参见讨论部分第4段）：在生物安全柜中，轻轻移除约1 ml培养基，用P1,000加样器将细胞在原培养液中轻轻重悬，转移重悬液至1.5 ml微量离心管中。
注意：避免使用胰蛋白酶，因为它可能会消化GPCR传感器的N端和/或结合口袋。 - 计数细胞以确保重悬液中的细胞密度适当。优化重悬体积，使细胞浓度为 4 x 106 cells/ml
- 在室温下，将细胞于摆动桶离心机中以290 × g离心3分钟。离心结束后弃去上清液。
- 轻柔地 在 1 ml 细胞缓冲液（4°C 保存）中重悬细胞 37 °C）并重复步骤 5.3。在第二次离心期间，从 -80 °C在药物缓冲液中按1:100稀释，制备1 mM的工作液，室温保存。
- 第二次离心后，弃去上清液，并在1 ml细胞缓冲液中轻轻重悬细胞（4 x 106 细胞/毫升）。测量OD600 使用1 ml细胞悬液和1 ml细胞缓冲液作为空白对照，在分光光度计中测定样品的吸光度。将细胞加入一次性塑料比色皿中进行测定，测定后立即转移回微量离心管中。
- 作为未转染细胞对照组的光谱检测，使用 P1000 移液器将未转染细胞轻轻重悬于 1 ml 细胞缓冲液中，然后加入 90 µl 将细胞加入比色皿中，在激发波长430 nm（带宽8 nm）、发射波长450–600 nm（带宽4 nm）条件下采集FRET光谱。每次使用新鲜样品重复采集3–5次光谱 90 µl 细胞。将细胞库存保存于 37 °C 在不同样品之间，使用P1,000枪头轻轻重悬各份样品，并用超纯水冲洗比色皿2O 在样品之间。
- 实验条件下，分装 90 µl 转染细胞分别加入到 500 µl 将试管置于加热块的2-6、8-12号孔位的支架中。每次分装时，用P1000移液器轻轻重悬细胞储备液。
- 细胞分装后，加入 10 µl 向2-6号管中加入药物缓冲液，用于未处理条件样品。
- 开始实验，加入 10 µl 将1 mM药物溶液加入第8号管中，启动计时器倒计时10分钟，用P200移液器轻轻混匀。盖紧管盖并放回 37 °C 加热块
- 立即取用2号管，用P200轻轻混匀（使用新枪头），加入 90 µl 将细胞悬液加入未处理组的比色皿中，并置于荧光计内。
- 在激发波长430 nm（带宽8 nm）、发射波长450–600 nm（带宽4 nm）条件下采集FRET光谱。
- 在9分10秒时，对9号管进行涡旋震荡 10 µl 加入1 mM药物溶液，用P200轻轻混匀（使用新吸头），然后将离心管放回加热块中。
- 用3号管重复步骤5.10–5.11，用10号管重复步骤5.12。
- 以1分钟为间隔重复步骤5.10–5.13（08:10，07:10， 等等。直至收集完所有未处理组样本的光谱，并向所有药物处理组样本中添加药物。每次移液均需使用新的吸头，以防止交叉污染。
- 在5分钟减10秒时，开始用P200移液器轻轻混匀第8号管（药物处理条件），并加入 90 µl 将细胞悬液转移至用于药物处理样品的独立比色皿中，并放入荧光计。
- 采集FRET光谱（设置参见步骤5.11）。
- 以1分钟为间隔重复步骤5.15–5.16（04:10，03:10， 等等。用于其余药物条件样本（管 9 - 12）。
- 实验结束后，保存项目文件，用超纯水彻底清洗比色皿，2O，并为下一个条件重新补充试管。在洗涤步骤中注意防止交叉污染。更换移液器吸头2O瓶以及在清洗间隙的真空管路中。
6. 数据分析
- 将数据文件保存并导出为SPC格式，用于后续分析。分析程序可从Sivaramakrishnan实验室的出版物网站下载。
- 为分析软件创建路径文件，其中应包含分析程序（v9、v15）、未转染样本文件（未转染细胞光谱采集见步骤5.6）、OUTPUT数据文件，以及用于数据输入的逗号分隔值（CSV）文件。
- 将以下信息输入CSV文件（参见表3示例），并为每个样本指定相应条件，包括：
文件名——单个SPC图谱文件
受体——指定所测试的GPCR构建体（例如，Β2）
结合蛋白——指定所测试的构建体肽段变体（例如，S）
激动剂——指定未处理（N）或药物处理（D）条件
目录——保存SPC文件的路径文件夹，通常按日期组织
OD——分光光度计记录的样品光密度值 - 输入未转染样本（步骤5.6）的文件名，以从样本中扣除缓冲液和散射噪声。
- 将实验条件输入分析程序。
- 运行程序以分析各单一条件内（v9）及跨条件间（v15）的样本。
- 排除数据集中明显为异常值的样本文件，或通过增加或减少单个文件的OD值来调整扣除参数。
- 将数据导出至OUTPUT文件，以获取计算得到的FRET比值（525 nm/475 nm）。
- 通过从药物处理条件的单个FRET比值中减去未处理条件的平均FRET比值，计算ΔFRET。
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结果
实验设置与实施的通用示意图详见图3。
为了在传感器狭窄的动态范围内检测到FRET变化，必须严格遵循系统的各项细节。细胞质量对于蛋白表达以及取样的一致性至关重要。图1展示了培养细胞的图像，其中细胞以均匀的单层生长（10倍物镜），适用于六孔板接种和转染，如图1 (a)所示；而图1 (b)显示细胞呈团块状生长，形成树突样形态，不推荐用于一致性的接种。此外，还可优化转染条件以实现可重复的表达。本文所推荐使用的转染试剂已针对多种条件进行了优化。表1列出了在低血清培养基中DNA与转染试剂比例的优化条件。
所有数据收集完毕并录入CSV文件用于分析后（参见示例） 表3），生成的结果将类似于所示的原始FRET光谱数据 图4（a） 归一化后的平均FRET光谱如图所示 图4（b）在...
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讨论
该系统中FRET检测的严格动态范围强调了在本方案的每一步骤中进行灵敏质量控制的必要性。确保FRET实验成功最关键的步骤包括：1）细胞培养，2）转染，3）蛋白表达，以及4）在检测执行过程中及时且精确的协调操作。
细胞的健康状况和传代培养质量可能显著影响实验系统的信噪比，而细胞状态不佳则可能导致无法检测到FRET的任何一致变化。通常情况下，细胞在约20代内保持最佳健康状态，但具体代数可能因细胞系、操作方式和培养条件的不同而有所差异。一旦细胞难以形成融合的单层生长，或持续呈现树突状生长模式（见图1 (b)），实验的背景噪声将受到不利影响。仔细的细胞维护，包括定期更换培养基以及及时从维持培养板中清除非贴壁细胞和碎片，有助于提高用于六孔板接种和转染实验的细胞质量。细胞团块会显著降低转染效率，可通过胰蛋白酶消化维持培养板将团块有效分散为单个细胞：对10 cm的融合培养皿加入10 ml 0.25%胰蛋白酶处理30秒，吸除胰蛋白酶但保留约200 μl，将培养皿置于37 °C培养箱中孵育2–3分钟。此时细胞可轻松脱落，且不易发生聚集。
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披露
作者声明不存在任何竞争利益。
致谢
R.U.M. 获美国心脏协会博士前奖学金（14PRE18560010）资助。本研究获美国心脏协会科学家发展基金（13SDG14270009）资助。 & 美国国立卫生研究院（1DP2 CA186752-01） & 1-R01-GM-105646-01-A1）资助项目，授予 S.S.
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| B2-AR-10 nm-Gas 肽传感器 | Addgene | 47438 | https://www.addgene.org/Sivaraj_Sivaramakrishnan/ |
| GeneJET 质粒小量提取试剂盒 | Fermentas/Fisher Sci | FERK0503 | 使用 2 mM Tris 洗脱缓冲液洗脱 |
| HEK-293T-Flp-n 细胞 | Life Technologies | R78007 | |
| 胰蛋白酶（0.25%） | Life Technologies | 25200056 | |
| DMEM-高糖 | Life Technologies | 11960-044 | 使用前在 37 °C 水浴中预热 |
| FBS，经认证，热灭活，美国来源 | Life Technologies | 10082147 | |
| Glutamax I 100x | Life Technologies | 35050061 | |
| HEPES | Corning | MT25060CL | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | 低血清培养基；使用前恢复至室温 |
| XtremeGene HP 转染试剂 | Roche | 6366236001 | 因其稳定性高而强烈推荐；使用前恢复至室温 |
| FluoroMax 4 | Horiba | 需配合 FluorEssence V3.8 软件使用 | |
| 3 mm 光程石英比色皿 | Starna | NC9729944(16.45F-Q-3/z8.5) | 在荧光分光光度计中使用时可能需要比色皿支架/适配器，可从 Starna 购买 |
| Sc100-S3 加热循环水浴泵 | Fisher Scientific | 13-874-826 | 使用前预热至 37 °C |
| Thermomixer 加热金属块 | Eppendorf | 22670000 | 使用前预热至 37 °C |
| 超纯无 DNA/RNA 酶水 | Life Technologies | 10977015 | 在室温下使用 |
| D-(+)-葡萄糖，无水 | Sigma | G5767 | |
| 牛肺来源抑肽酶 | Sigma | A1153 | |
| 亮抑蛋白酶肽半硫酸盐 | EMD | 10-897 | |
| L-抗坏血酸，试剂级 | Sigma | A0278 | |
| (-)-异丙肾上腺素 (+)-酒石酸盐 | Sigma | I2760 | 每次实验使用新鲜分装样品 |
参考文献
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