本文介绍了一种转基因报告小鼠模型，用于可视化小鼠不同组织中产生IL-22的细胞。该方法可用于追踪小鼠体内其他细胞因子或分泌蛋白的定位。
本文介绍了一种转基因报告小鼠模型，用于可视化小鼠不同组织中产生IL-22的细胞。该方法可用于追踪小鼠体内其他细胞因子或分泌蛋白的定位。
报告基因小鼠已被广泛用于观察靶向基因表达的定位。本实验方案重点介绍建立新型转基因报告基因小鼠模型的策略。我们选择可视化白细胞介素（IL）22 基因的表达，因为该细胞因子在肠道中具有重要功能，可促进因炎症而受损组织的修复。与其他检测产物的方法相比，报告基因系统具有显著优势 体内对于IL-22，其他研究首先从组织中分离细胞，然后对细胞进行再次刺激 体外IL-22 通常为分泌性细胞因子，通过药物将其滞留在细胞内，并利用细胞内染色技术进行可视化检测。该方法可鉴定具有产生 IL-22 能力的细胞，但无法确定这些细胞在检测时是否正处于实际分泌状态。 体内报告基因设计包括将荧光蛋白（tdTomato）基因插入IL-22基因中，使得荧光蛋白无法被分泌，因而滞留在产生该蛋白的细胞内 体内荧光产物随后可在组织切片中或通过 离体 通过流式细胞术进行分析。报告基因的实际构建过程包括对含有IL-22基因的细菌人工染色体进行重组工程改造，随后将该工程化染色体导入小鼠基因组。通过流式细胞术分析，在不同小鼠组织（包括脾脏、胸腺、淋巴结、派伊尔集合淋巴结和肠道）中均观察到稳态下的IL-22报告基因表达。通过T细胞（CD4+CD45RBhigh）过继转移，并对报告基因表达进行可视化观察。阳性T细胞首先出现在肠系膜淋巴结中，随后逐渐积聚于远端小肠和结肠组织的固有层内。利用BAC构建的报告系统在模拟IL-22表达方面具有较高的保真度，且相较于基因敲入方法更为简便。
报告基因在特定细胞类型中的表达有助于识别在稳态和受扰动状态下组织中活跃表达目标基因的细胞。该方法还可用于分离这些仍保持活性的细胞，以研究它们的其他特性。报告小鼠已被广泛应用于阐明特定细胞因子、转录因子和调控元件的作用机制。以往的策略1,2,3主要依赖于将报告基因敲入小鼠染色体上的目标位点，这一过程耗时且成本较高。因此，亟需一种更为简便的报告小鼠构建方法。
细胞因子是一类广泛存在的小分子分泌型蛋白质/多肽，通过细胞间信号传导调节免疫反应。白细胞介素22（IL-22）是一种具有多种已报道功能的细胞因子，包括维持屏障功能、促进组织修复以及调节炎症反应4尽管IL-22最初被发现是T细胞的产物5，后续研究证实其在人类自然杀伤（NK）细胞中表达6 和小鼠7 以及其他类型的天然淋巴细胞中8尽管已对产生IL-22的细胞进行了广泛观察，但此前对IL-22的可视化仍需要 离体 刺激和通透化后使用抗体进行染色。因此，新型IL-22报告小鼠将是研究IL-22在稳....
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所有动物均按照2011年癌症研究弗雷德里克国家实验室动物实验管理委员会制定的《实验动物护理和使用指南》中所述实验程序接受了适当的护理。
1. 通过BAC重组工程生成IL-22-tdTomato报告小鼠
注意：小鼠应处于无意识状态，且对有害刺激无任何反应。使用70%乙醇对术区进行消毒，并使用玻璃珠灭菌器对所有手术器械进行灭菌。
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使用重组工程技术修饰携带小鼠 IL-22 基因的细菌人工染色体，构建了小鼠 IL-22 报告基因转基因 IL-22 位点 图1 展示了含有 sacBII 基因（一种正筛选标记）和氯霉素抗性基因的 pBACe3.6 载体的示意图11. 在将 tdTomato 引入第一外显子后，信号肽序列被破坏，如图所示 图2因此，tdTomato 报告基因被保留在表达 IL-22 的细胞内，从而可通过流式细胞术对其进行检测和分选。纯合小鼠由原始 founder 系繁育而来，并通过 PCR 筛选，无需回交即可获得具有稳定遗传背景的后代，这一点不同于常规的基因敲入策略。为验证 IL-22 报告基因的准确性， 体外-生成的脾细胞在Th22或中性条件下培养。 图3 证明 IL-22-tdtomato 在 Th22 细胞中表达良好 体外通过流式细胞术或荧光显微镜检测。 体内，如图所.......
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IL-22 在固有免疫防御和组织重塑中发挥关键作用。产生 IL-22 的细胞已被鉴定 离体 通过细胞内染色。然而，追踪IL-22的表达仍然具有挑战性 原位，无论是在正常状态还是炎症条件下。本方案描述了一种建立IL-22报告小鼠模型的新方法，该模型可使我们定位报告基因表达细胞 体内将编码TdTomato的报告基因插入IL-22基因座中破坏信号序列的位点。该策略使报告基因滞留在产生细胞内，而IL-22则会被迅速分泌，从而实现对报告基因表达细胞的可视化。工程化的IL-22报告基因系统包含于一个大型BAC中，旨在保留调控元件，以确保报告基因的表达模式与IL-22保持一致。转基因小鼠的肠道组织显示，在小肠固有层中的CD4 T细胞和天然淋巴细胞中存在稳态下的报告基因表达。在诱导性结肠炎模型中，结肠中的CD4 T细胞表达该报告基因。
IL-22 在炎症性肠病中的作用尚不明确。IL-22 参与肠道黏膜防御和组织再生，能够诱导产生保护性因子20,
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作者无任何利益冲突需要披露。
感谢 Kelli Czarra 和 Megan Karwan 提供的动物实验技术协助，Kathleen Noer 和 Roberta Matthai 提供的流式细胞术协助，以及 Donna Butcher 和 Miriam R. Anver 提供的病理学分析。本项目获得了 Ely 和 Edythe Broad 基金会资助（资助对象：Scott Durum），并全部或部分由美国国立卫生研究院国家癌症研究所联邦资金支持，合同编号为 HHSN261200800001E（MRA）。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RP23-401E11 BAC | 赛默飞世尔科技 | RPCI23.C | 需要基因ID：50929 |
| NucleoBond BAC 100 | 宝生物工程（Takara Clontech） | 740579 | |
| PCR SuperMix High Fidelity | 赛默飞世尔科技 | 10790020 | |
| PI-SceI | 新英格兰生物实验室 | R0696S | |
| SpeI | 新英格兰生物实验室 | R0133S | |
| LB肉汤 | 赛默飞世尔科技 | 10855-001 | 1 L：10 g SELECT Peptone 140，5 g SELECT Yeast Extract，5 g 氯化钠 |
| 抗小鼠CD3抗体 | eBioscience | 11-0031 | |
| 抗小鼠CD4抗体 | eBioscience | 17-0041 | |
| 抗小鼠CD45抗体 | 赛默飞世尔科技 | MCD4530 | |
| 抗小鼠CD45RB抗体 | eBioscience | 11-0455 | |
| 抗小鼠RFP抗体 | Abcam | Ab62341 | |
| HBSS，无钙，无镁，无酚红 | 赛默飞世尔科技 | 14175145 | KCl，KH2PO4，Na2HPO4，NaHCO3，NaCl，D-葡萄糖 |
| DNase I | 罗氏 | 10104159001 | |
| ACK裂解缓冲液 | 赛默飞世尔科技 | A1049201 | |
| Percoll | GE医疗生命科学 | 17-0891-01 | |
| 胶原酶D | 罗氏 | 11088858001 | |
| 中性蛋白酶II（Dispase II，II型） | 罗氏 | 4942078001 | |
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| Dynal振荡器 | 电子显微镜科学 | 61050-10 | |
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| LSRII SORP/流式细胞仪 | 贝克顿·迪金森公司 | 询价 |
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