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方法文章

小鼠离体灌注肾脏技术

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DOI：

10.3791/54712

⸱

2016年11月17日

 ,  , 
1Institute of Anatomy, Swiss National Centre of Competence in Research Kidney, University of Zürich, 2Department of Physiology, University of Regensburg

本文内容

摘要

小鼠离体灌注肾（MIPK）是一种用于维持小鼠肾脏在离体状态下 离体 灌流并保持功能状态1小时。缓冲液和手术技术有详细描述。

摘要

小鼠离体灌注肾（MIPK）是一种用于维持小鼠肾脏在离体状态下 离体 灌流并保持功能状态1小时。这是研究离体器官生理学以及实现未来多种创新应用的前提，包括用于肾脏生物工程的灌流脱细胞化，或高剂量给予抗排斥药物或基因编辑药物以对肾脏进行移植前预处理。在灌流期间，可对肾脏进行操作，评估肾功能，并施用多种药物。操作结束后，肾脏可用于移植，或进行分子生物学、生物化学分析及显微镜检查。

本文描述了灌注液及进行该手术所需的技术 离体 小鼠肾脏灌注。文中提供了灌注装置的详细信息，并展示了肾脏制备物的活性数据：肾血流量、血管阻力和尿液数据作为功能学指标，不同肾单位节段的透射电镜图像作为形态学指标，以及不同肾单位节段转运蛋白的蛋白质印迹作为分子水平的检测结果。

引言

器官的离体灌注是生理学家数十年来持续研究的课题1。该技术使得在排除血压、激素或神经等全身性影响因素的情况下，对器官功能进行研究成为可能。Carl Eduard Loebell 被认为是最早于1849年描述成功实现离体肾脏灌注的人2。自那时起，灌注装置经历了显著的改进。Frey 和 Gruber 引入了用于氧合的人工肺以及用于连续灌注的脉动泵2。早期研究人员主要研究大型哺乳动物——特别是猪2和狗3——的肾脏，而 Weiss et al. 首次报道使用大鼠肾脏，成为小型哺乳动物器官灌注研究中的一个里程碑4。Schurek et al. 报道，若要实现充分的肾小管氧合，必须在灌注液中添加哺乳动物红细胞5。对于长期实验而言，同一研究团队随后引入的缓冲液连续透析技术至关重要6。2003年，Schweda et al. 首次报道了功能完整的小鼠离体灌注肾脏模型（MIPK）7，之后由 Rahgozar et al.18 和 Lindell et al.14 进一步优化。

尽管小鼠离体灌注肾（MIPK）技术上比大鼠离体灌注肾更具挑战性，但其优势在于能够广泛使用各类基因修饰小鼠。本文详细介绍了作者对离体小鼠肾脏进行1小时灌注的方法。该方法可实现对肾血流速率、血管阻力、激素释放、血气分析、尿液分析以及药物应用的连续评估。操作结束后，肾脏可用于分子与生化分析，或固定后用于显微镜检查，亦可移植至受体小鼠（图1）。

使用半合成缓冲液、输入因素和测量输出的肾脏灌注示意图。
图1：离体灌注肾脏可能的输入/输出概览。 BGA：血气分析。请点击此处查看此图的放大版本。

随着移植前长时间常温肾脏灌注技术的兴起（无论是否联合使用抗排斥药物或基因组编辑药物）8,9, 10, 11、脱细胞支架全肾生物工程构建12以及高剂量荧光染料在多光子成像中的应用13，该技术在未来几年内有望受到越来越多的关注。此外，该模型也非常适合用于研究特定基因在急性肾损伤过程中的作用14。

本文提供了一步一步的操作方案，以使其他实验室能够成功进行离体小鼠肾脏灌注。首先，详细说明了缓冲液的组成及配制方法。接着，详细描述了手术过程，并展示了关键操作步骤。第三，展示了代表成功制备的实验数据：包括肾血流量、血管阻力、肾小球滤过率以及电解质排泄分数——这些均为反映组织活性的功能性指标——同时还提供了灌注1小时后固定肾脏的不同肾单位节段的透射电子显微镜形态图像。

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方案

本手稿中涉及动物的所有操作均依照瑞士法律进行，并已获得瑞士苏黎世州兽医管理局的批准。

1. 缓冲液配制

  1. 配制溶液 1 - 4 及抗利尿激素（ADH）溶液（表 1）。
  2. 配制透析缓冲液（表 1）。
    注意：该缓冲液用于灌流过程中的透析。之后，将红细胞用此缓冲液稀释以制备最终灌流液。
  3. 红细胞制备。
    1. 取 250 ml 人红细胞浓缩液（从当地血库获得的检测样品），用透析缓冲液稀释至 500 ml。在 2,000 × g 条件下离心 8 分钟。小心去除上清缓冲液，避免移除任何红细胞。重复此步骤 3 次。
  4. 配制白蛋白（牛血清白蛋白；BSA）缓冲液。
    1. 在 200 ml 透析缓冲液中，使用搅拌子溶解 44 g BSA。用滤纸过滤溶液。
  5. 制备灌流液。
    1. 将步骤 1.3.1 中的红细胞通过滤纸过滤至 BSA 缓冲液中。用透析缓冲液定容至总体积 800 ml。
      注意：此即最终灌流液。此时血细胞比容应在 8% 至 12% 之间。灌流液可在 4 °C 下保存最多 12 小时。

2. 启动透析和氧合

  1. 开启环绕大缓冲液储液罐、小缓冲液储液罐以及湿润室（一个双层小室，用于后续放置肾脏，需预热至 37 °C 并保持 100% 湿度）的水浴，设置温度为 37 °C（图 2）。
  2. 向大缓冲液储液罐中加入透析缓冲液，向小储液罐中加入灌注液。
  3. 打开 5% CO2/95% O2 混合气体对透析缓冲液的通气。
  4. 启动灌注液与透析缓冲液之间的连续透析。注意使用低通量透析管。继续进行第 3 步。

细胞周期示意图，包含分子生物学研究中的各个阶段及转换过程。
图 2：灌流回路的示意图。 该示意图展示了灌流回路的主要组件及缓冲液流动方向。所有被深蓝色框包围的组件均通过水浴/恒温器维持在 37 °C。 1： 透析缓冲液体积至少为灌流缓冲液的 3 倍，并持续用 95% O2/5% CO2 气体鼓泡。 2： 透析缓冲液与灌流缓冲液在透析管中通过蠕动泵持续进行相互透析。 3： 由于该透析过程，灌流缓冲液被富集为含 9% O2/5% CO2 的环境，且电解质水平在整个灌流过程中保持恒定。 4： 蠕动泵将灌流缓冲液推向肾脏。 5： 憋压装置（windkessel）用于消除蠕动波并作为气泡捕获器。 6： 压力传感器（连接至 4.（蠕动泵）），可在允许自由交替流动的同时维持持续压力。 7： 在整个灌流过程中，肾脏始终置于湿润腔室内，以保持 100% 空气湿度及 37 °C 的肾脏温度。 请点击此处查看该图的放大版本。

3. 手术步骤第一部分（所有结扎位置的示意图见图3）

注意：所有缝合均使用 5-0 外科缝线进行。

  1. 通过腹腔注射麻醉小鼠（每克体重10 µl，含20 mg/ml 氯胺酮和1 mg/ml 哌替啶溶于0.9% NaCl中）。通过检测后肢反射是否消失来确认麻醉深度足够。
  2. 将小鼠仰卧位固定在湿润的培养皿中，用兽用眼膏保护眼睛。将1 ml 注射器置于脊柱下方以抬高腰血管。
  3. 使用剪刀从耻骨嵴至胸骨做正中腹切口，依次切开皮肤和腹肌。
  4. 取出肠管并将其置于小鼠腹部左侧外侧。
  5. 游离膀胱周围的结缔组织，暴露双侧输尿管及尿道。
  6. 在左侧输尿管上放置结扎线（结扎线 I），并收紧结扎。
  7. 在尿道上放置结扎线（结扎线 II），并收紧结扎。
  8. 在膀胱整体周围放置一个“套索”式结扎线（结扎线 III）。
  9. 在膀胱上做1 mm的切口。
  10. 用2 cm长的PE 50导管插入切口进行插管。
  11. 将结扎线III在导管周围收紧固定。
  12. 在结扎线远端切断左侧输尿管和尿道。此时膀胱仅通过右侧输尿管连接，可自由活动。
  13. 清除腹主动脉周围的结缔组织和脂肪。
  14. 在腹主动脉中段位置放置一结扎线（结扎线 IV）。
  15. 在膈肌下方、肠系膜上动脉与腹腔干之间，于主动脉上放置一结扎线（结扎线 V）。
  16. 在肠系膜上动脉周围放置一结扎线（结扎线 VI）。
  17. 在右肾动脉下方、左肾动脉上方的主动脉处放置一结扎线（结扎线 VII）。
  18. 在尾静脉复合体（下腔静脉，cava）周围放置一结扎线（结扎线 VIII），然后进入第4步。

心血管系统示意图，显示颅侧和尾侧血管、主动脉、腔静脉通路。
图3：手术期间放置结扎线的示意图。剖腹术后腹腔打开的视图。肠管被移向左侧。L 和 R 分别表示左肾和右肾。黑线表示相应结扎线的位置。结扎线按文中所述顺序依次放置并收紧。X 标记为主动脉插管切口的位置。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 灌注管路的预充

  1. 启动旋转泵，并用灌注液充满管路。注意排尽所有气泡。
  2. 将风袋装置用灌注液填充至约一半高度。
  3. 当所有管路充满且无流动时，将压力传感器校准至 0 mm Hg。在此期间，保持灌注针处于肾脏水平位置。
  4. 保持恒定的最低流速（0.6 ml/min），然后进入第 5 步。

5. 手术步骤 第2部分

  1. 在结扎线 IV 与左肾动脉分支之间放置一个夹子。
  2. 在结扎线 IV 尾侧的主动脉上做一个小切口，注意不要切破背侧管壁。
  3. 使用血管扩张器扩张主动脉上的开口。
  4. 用一根针（长 2 cm，拉制的 PE 50 管）插管主动脉，将针尖推至夹子处。
  5. 打开夹子。
  6. 将针尖向头侧推进，直至到达右肾动脉与主动脉的连接处。
  7. 结扎线 VII 扎紧。
  8. 结扎线 IV 扎紧。
  9. 用剪刀剪开胸腔，分离膈肌；通过一次剪切，切断主动脉、下腔静脉、心脏及自主神经。此步骤通过持续深度麻醉下的快速放血使动物安乐死。
  10. 启动灌注泵的压力控制，维持平均压力在 80 至 100 mmHg 之间。
  11. 结扎线 V 扎紧。
  12. 结扎线 VI 扎紧。
  13. 结扎线 VIII 扎紧。
  14. 用剪刀将右肾从结缔组织及其周围的脂肪囊中游离出来。
  15. 在结扎线 V 近端切断主动脉。
  16. 在结扎线 VI 远端切断肠系膜上动脉。
  17. 将支撑肾脏的血管束整体剪下，注意不要损伤血管本身。
  18. 在肝脏与肾脏连接处切断肝脏。注意完全游离肾脏，但保留一小部分肝脏附着于其上，以维持下腔静脉通畅。
  19. 将肾脏血管束从小鼠体内取出，将小鼠移出湿润腔室。
  20. 在肝脏与肾脏连接处绕一圈“套索”状结扎线（结扎线 IX）。
  21. 用静脉导管（2 cm PE 50）插管下腔静脉。
  22. 扎紧结扎线 IX，静脉血应立即通过静脉导管流出。
  23. 关闭湿润腔室。

6. 下游分析

  1. 在接下来的一个小时内，持续监测血流和血管内压力15。收集静脉流出液，可用于分析肾脏肾素释放等指标7。收集尿液，用于分析电解质浓度和肾小球滤过率14。灌注1小时后，肾脏可速冻用于蛋白质印迹分析，或固定用于成像研究16。

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结果

采用所述方法，分离的小鼠肾脏可保持活性至少1小时。我们在持续灌注1小时后检测了组织活性，评估指标包括功能参数（肾血流量和血管阻力、静脉流出液血气分析、肾小球滤过率、尿钠排泄分数）、形态学参数（光镜和电镜下的组织学检查）以及分子生物学参数（细胞凋亡标志物和炎症因子mRNA表达水平）。+ 和 K+ 排泄功能和尿渗透压）以及形态学方法（透射电子显微镜，TEM）对四只野生型 C57Bl/6 小鼠的肾脏进行分析。此外，通过蛋白质印迹法检测不同肾小管节段顶膜标志蛋白的表达，比较同一动物的离体灌注肾脏与未灌注肾脏之间的差异. 在所有实验中，均采用恒压灌注，将灌注压力维持在约 100 mmHg图4）。在这些肾脏中，灌注液流速和血管阻力在55分钟内保持稳定，分别为15.6 ± 0.4 ml/min*g肾重和35 ± 1.0 mmHg*min/ml。图4 A)。灌注液流速降低或血管阻力增加是反映组织活力下降的敏感指标，应在整个灌注过程中密切监测。灌...

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讨论

小鼠离体灌注肾是一种在可控环境中研究肾功能的工具 离体 1小时，填补了两者之间的空白 在体 在完整动物中进行的实验，可能因多种系统性因素的影响而存在缺陷，以及 体外 在分离的肾单位节段或培养细胞中进行的实验必然忽略了完整器官结构对功能的影响。据作者所知，目前尚无其他替代技术可用于完成此项特定任务。然而，对肾组织的生物化学研究则可通过使用肾组织切片以更为简便的方式开展17尽管目前该技术主要用于研究肾脏生理学，但许多新应用正在被探讨。例如，它可在灌注脱细胞和再细胞化过程中用于肾脏生物工程12此外，正在研究在移植前对肾脏进行长时间的常温灌注，并向灌注液中给予高剂量的抗排斥药物或基因组编辑药物；该研究甚至已进入临床环境8, 9, 10, 11小鼠离体灌注肾是一种理想工具，可用于上述应用，尤其适用于通过基因敲除模型阐明单个基因的功能。

成功实验的关键在于三个步骤。本文为感兴趣的实验室提供了重现该操作流程的方法。首先，缓冲液的配制必须确保肾脏在可重复的条件下获得长期存活所需的...

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披露

作者无竞争性财务利益，也无其他事项需披露。

致谢

作者谨向 Hans-Joachim Schurek 致以衷心感谢，感谢他提供的宝贵科学建议。作者还感谢 Monique Carrel 和 Michèle Heidemeyer 提供出色的技术支持，感谢 David Penton Ribas 和 Nourdine Faresse 对手稿的审阅，以及 Carsten Wagner 和 Jürg Biber 提供 NaPi-2a 抗体。本研究得到了瑞士国家能力研究中心“Kidney.CH”以及瑞士国家科学基金会项目资助（项目编号：310030_143929/1）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
灌注回路：
湿润室 834/8Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-2901
带篮和侧口的插管Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-2947
恒温器 TC120-ST5 Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-4544
ISM 827/230V 滚压泵 Reglo 模拟型Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-0114
带夹套的缓冲液储液瓶，1 LHarvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-3438
带夹套的缓冲液储液瓶，0.5 LHarvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-3436
压力传感器 APT300 Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-3862
TAM-D Plugsys 传感器Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-1793
SCP Plugsys 伺服控制器Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-2806
Windkessel Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-3717
HSE-USB 数据采集系统Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-3330
低通量透析器 Diacap 聚砜膜B.Braun7203525
用于主动脉插管的PE管，内径1.19 mm × 外径1.70 mmScientific Commodities Inc.BB31695-PE/8
名称公司目录编号备注
缓冲液试剂：
Aminoplasmal 10%B.Braun134518064
丙酮酸钠Sigma-AldrichP2256-25G
L-谷氨酸单钠盐水合物Sigma-AldrichG1626-100G
L-(-)-苹果酸钠盐Sigma-AldrichM1125-25G
乳酸钠-L-盐Sigma-AldrichL7022-10G
α-酮戊二酸钠盐Sigma-AldrichK1875-25G
NaClSigma-Aldrich31434-1KG-R
NaHCO3Sigma-AldrichS5761-5KG
KClSigma-Aldrich60130-1KG
尿素Sigma-AldrichU5378-500G
肌酐Sigma-AldrichC4255-10G
氨苄青霉素Roche10835242001
MgCl2 * 6H2OSigma-AldrichM2393-500G
D-葡萄糖Sigma-AldrichG8270-1KG
CaCl2 * 6H2O Riedel-de-Haën12074
NaH2PO4Sigma-AldrichS9638-500G
Na2HPO4Sigma-AldrichS0876-500G
抗利尿激素 dDAVPSigma-AldrichV2013-1MG
荧光素标记菊粉（FITC-Inulin）Sigma-Aldrich
用于红细胞过滤的滤器Macherey-NagelMN 615
血气分析：
ABL 80 flexRadiometer Medical ApS
电子显微镜：
Philips CM100 透射电镜（TEM）FEI

参考文献

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