低细胞数量样品透射电镜分析的替代制样方法

摘要

本文介绍了一种用于透射电子显微镜（TEM）分析的低细胞数量样品制备方案。

摘要

透射电子显微镜（TEM）可提供细胞结构和超微结构的详细信息。然而，由于样品制备过程中需要大量细胞，对稀有细胞群体（尤其是悬浮生长的细胞，如造血干细胞（HSCs））进行TEM分析仍然受到限制。目前虽有少数采用细胞离心涂片或单层培养的方法可用于稀少样本的TEM分析，但这些方法难以从有限数量的细胞中获得显著的定量数据。本文介绍了一种适用于稀有细胞群体的替代性且新颖的TEM样品制备方法，能够实现定量分析。

相对较低的细胞数量， 即， 10,000个造血干细胞（HSCs）即可成功用于透射电子显微镜（TEM）分析，相较于通常TEM研究所需的数百万个细胞，显著减少了细胞数量。特别是，在经多聚甲醛-戊二醛（PFA-GA）固定后，使用伊文思蓝染色以可视化微小的细胞沉淀，有助于将其包埋于琼脂糖中。在超薄切片中观察到多个细胞组成的簇状结构。细胞形态保存良好，高尔基复合体及多个线粒体的超微结构细节清晰可见。该方法高效、简便且可重复，适用于从有限的生物样本中获取稀有细胞群体的样品，可用于定性和定量的透射电镜分析。

引言

细胞的超微结构及亚细胞器细节主要通过透射电子显微镜（TEM）对组织或细胞沉淀物的研究得以揭示^1,2组织的固体样品可直接用于电子显微镜研究。然而，透射电镜分析^1,3 悬浮细胞的处理仍然具有挑战性，且需要大量的细胞。 即数百万个细胞。因此，对悬浮状态下的稀有细胞群体进行超微结构分析时 例如， 造血干细胞（HSCs）难以进行有效评估。利用稀有样本通过细胞离心涂片法或单层培养法进行透射电子显微镜（TEM）分析的多次尝试，均因细胞数量有限而无法获得显著的定量数据。因此，对大量细胞的需求限制了这一强大工具在解析稀有细胞群体亚细胞超微结构细节中的应用。

悬浮液中细胞数量有限是透射电子显微镜（TEM）研究的一个关键限制因素，这导致细胞在处理过程中的定位困难，因此对数量有限且尺寸特别小的细胞进行TEM研究仍然具有挑战性。为克服这一限制，已采用多种替代方法：包括通过牛血清白蛋白/双丙烯酰胺（BSA-BA）介导的细胞悬浮液聚合，以及使用染料对细胞进行染色，使其在包括盖玻片在内的薄膜支撑材料上可见， 以及来自细胞离心涂片制备的透射电镜分析^4-6然而，该方法取得的成功非常有限，因为在超薄切片后，切片中仅能观察到极少数细胞。识别稀疏细胞的关键挑战依然存在，因为细胞单层在凝固的凝胶中大多不可见，难以进行切片定位。此外，细胞经细胞离心涂片制备后，可能因细胞铺展及细胞结构脆弱而改变其原有的空间组织状态。因此，这些固有缺陷亟需一种更为可靠的新方法，以实现对稀少细胞群体的透射电镜（TEM）研究。为解决这一问题，我们提出了一种新颖且替代性的样本制备方法，适用于稀少细胞群体的透射电镜研究。⁷.

在此，我们报告一种高效的样品制备方案，可利用稀少的生物样品进行透射电子显微镜（TEM）分析，并获得稳定可靠的定性和定量结果。固定后进行伊文思蓝染色，以定位来自少量细胞的微小细胞沉淀。 即，10,000个原本难以察觉的骨髓造血干细胞和祖细胞，随后将细胞沉淀嵌入琼脂糖中，再进行脱水和树脂包埋。该方法可使细胞聚集在一起，从而高效分析造血干细胞（鉴定为Lin）的超微结构和亚细胞结构组织^- Sca-1⁺ c-Kit⁺ Flt3^- CD34^-；造血干细胞（HSC），骨髓中一种稀有的细胞群体，占0.2 - 0.5%。该实验方案可用于超微结构研究，并对多种稀有但极为重要的细胞群体获得定量结果。

方案

所有实验程序均经辛辛那提儿童研究基金会机构动物委员会批准。本研究中，从2至4月龄C57Bl/6近交系小鼠的骨髓中分离造血干细胞。通过使用FACS对骨髓细胞进行分选，结合不同表面标志物（包括Lineage、c-Kit、Sca-1、Flt3和CD34）染色，根据Lin⁻ Sca-1⁺ c-Kit⁺表型对HSC进行纯化。⁺ c-Kit⁺ Flt3^- CD34^- 门控策略按照先前所述的标准方案⁸.

注意：本实验过程中使用了多种高毒性化学试剂，这些试剂可通过吸入和皮肤接触产生毒性。请佩戴手套和防护服。操作这些化学品时，务必在通风橱内进行。

1. 细胞、固定、染色和预包埋

1. 使用FACS将10,000个造血干细胞（采用Lin^- Sca-1⁺ c-Kit⁺ Flt3^- CD34^-分选策略；LT-HSC群体）分选至含有600 µl含10%胎牛血清的Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM）的1.5 ml微量离心管中。
2. 使用配有摆动桶转子的离心机，在1,000 × g条件下离心10分钟，使分选后的HSC沉淀。轻轻吸除上清液，每步操作后在管中保留200 µl液体。此阶段，管中细胞沉淀仍不可见。
3. 在室温（RT）下加入0.2 ml 2倍固定液，固定细胞1小时^1,9。
   1. 使用前新鲜配制固定液。1倍浓度的固定液由3%多聚甲醛和2.5%戊二醛溶于0.1 M卡可基缓冲液中组成。
4. 使用配有摆动桶转子的离心机，在30 °C、1,000 × g条件下离心10分钟。
5. 用600 µl 0.1 M卡可基缓冲液洗涤细胞，离心后在管中保留200 µl缓冲液。
6. 向固定后的细胞中加入200 µl含2 mg/ml伊文思蓝的卡可基缓冲液，室温孵育20分钟。细胞将被染成蓝色。
7. 用600 µl 0.1 M卡可基缓冲液洗涤细胞3次，每次离心后均在管中保留200 µl缓冲液。
8. 将细胞重悬于200 µl缓冲液中，并将细胞悬液转移至0.5 ml离心管。使用台式离心机在1,000 × g条件下离心10分钟。小心吸除上清液，避免扰动此时已可见的微小细胞沉淀，管中保留50 µl缓冲液。
9. 在15 ml离心管中，将200 mg低熔点琼脂糖加入5 ml 0.1 M卡可基缓冲液中，配制成4%琼脂糖溶液。将该管置于盛有沸水的100 ml玻璃瓶中加热溶解琼脂糖，使用前保持温热状态。
10. 向0.5 ml离心管中的细胞悬液中加入200 µl溶于0.1 M卡可基缓冲液的4%低熔点琼脂糖溶液，并立即使用台式离心机在30 °C、1,000 × g条件下离心10分钟。
11. 确认离心后细胞已沉淀至0.5 ml管底部并嵌入半固态琼脂糖中后，立即将离心管转移至4 °C或冰上，静置20分钟以使琼脂糖完全凝固。此步骤极为关键，因该阶段形成的小而可见的细胞团块将在透射电子显微镜下呈现良好的细胞簇结构。
12. 使用27 G针头小心将含有细胞沉淀的凝固琼脂糖块从离心管转移至盛有缓冲液的35 mm塑料培养皿中^3,10。
13. 用解剖刀将含有细胞沉淀的凝固琼脂糖修整为约1–2 mm大小的一块。将含细胞沉淀的琼脂糖块转移至新的1.5 ml离心管中。
14. 使用600 µl 0.1 M卡可基缓冲液洗涤2–3次，通过移液器加液和吸液完成，无需离心。将此含细胞沉淀的琼脂糖块用于下一步操作。此步骤中，样品可在4 °C条件下过夜保存后再进行后续步骤。

2. 锇酸固定、脱水、包埋

1. 用移液器从含有细胞沉淀和琼脂糖的1.5 ml离心管中移除卡可基酸盐缓冲液。加入1.0 ml 1%四氧化锇（OsO₄）₄在通风橱中加入溶液，4 °C 下孵育 1 小时。
2. 用600 µl 0.1 M卡考基酸盐缓冲液洗涤三次，将样品转移至带盖的20 ml玻璃闪烁小瓶中。
3. 将样品进行脱水、浸透及树脂包埋处理（例如，LX-112）在6孔板中依次更换以下溶液。使用镊子移动含有细胞沉淀的琼脂糖块。
   1. 将样品在室温下浸入25%乙醇中15分钟。
   2. 将样品在室温下浸入50%乙醇中15分钟。
   3. 将样品在室温下浸入75%乙醇中15分钟。
   4. 将样品在室温下浸入95%乙醇中15分钟。
   5. 在室温下将样品浸入100%乙醇中，每次15分钟，重复两次。
   6. 将样品浸入乙醇：树脂（3:1）中，室温下放置30分钟。
   7. 将样品浸入乙醇：树脂（1:1）中，室温下孵育30分钟。
   8. 将样品浸入乙醇：树脂（1:3）中，室温下孵育30分钟。
   9. 在室温下将样品浸入纯树脂中，每次60分钟，重复两次。
4. 使用镊子小心地将样品转移至锥体尖端形橡胶模具底部，并在样品上方添加更多纯树脂以填满模具。将样品在60 °C下孵育72小时，使树脂聚合。
5. 通过扭转橡胶模具，将聚合的树脂锥体从模具中取出。如前所述，应在聚合的树脂锥体中观察到一小团黑色细胞。⁷使用氰基丙烯酸酯将聚合的树脂锥体固定在安装柱上。

3. 切片与透射电子显微镜观察

1. 将样品块固定在超薄切片机上后，使用剃刀刀片和金刚石刀修整样品块。修成一个顶部和底部相互平行、侧边角度均匀的短而宽的梯形金字塔形状。这种金字塔形状有助于进行连续切片。
2. 进一步使用金刚石刀在细胞沉淀物周围修块，并去除细胞沉淀物琼脂糖块周围的包埋介质。
3. 使用超薄切片机切割1 µm厚的切片。用睫毛工具和金属环工具将1 µm切片从水槽转移至载玻片，方法如先前报道⁷。将载有切片的载玻片转移至37 °C的加热板上干燥。
4. 使用配备0.22 µm滤器的注射器向切片滴加一滴甲苯胺蓝溶液，孵育3分钟。用蒸馏水冲洗载玻片，并让切片自然干燥。在光学显微镜下观察，以确定细胞的位置。
5. 使用金刚石刀切割超薄切片（70 - 100 nm）。用睫毛工具将2 - 3个切片从水槽转移至200目载网，并置于玻璃培养皿中。
6. 将含有载网的玻璃培养皿转移至30 °C加热板上，干燥30分钟。
7. 在室温下用1%醋酸铀溶液滴染载网10分钟，然后用蒸馏水冲洗6 - 8次。再用Reynolds铅柠檬酸盐溶液在室温下染色5分钟，同样用蒸馏水冲洗6 - 8次。将含有载网的玻璃培养皿转移至37 °C加热板上干燥切片。
8. 使用电子显微镜在80 kV条件下分析切片⁷。

结果

本文描述了一种从少量细胞中高效且一致地制备透射电镜（TEM）分析样品的实验方案。使用伊文思蓝进行后固定染色，并将细胞转移至0.5 ml微量离心管中，有助于观察微小的细胞沉淀⁷。在琼脂糖中用四氧化锇进行锇化处理，可在脱水和包埋过程中轻松识别深色的细胞沉淀。

含有少量细胞沉淀的组织块所制备的半薄切片证实了多个细胞聚集在一起（图 1A 和 1B）。从细胞聚集区域切取超薄切片，并在电子显微镜下进行分析（图 1C）。这些细胞的形态和超微结构保存良好（图 1D）。单个细胞的电镜图像显示了细胞内超微结构的高分辨率细节（图 1E）。此外，高倍放大（50,000X）图像显示亚细胞器结构完整，如线粒体等细胞器的完整性得以良好保存（图 1F）。

...

讨论

该方法通过使用伊文思蓝染色和琼脂糖包埋，在脱水、树脂包埋和切片过程中对微量细胞沉淀进行定位，从而实现对少量细胞的透射电镜分析。重要的是，该方法能够保持细胞簇的完整性，并维持细胞的超微结构，有利于对多个细胞进行分析以实现数据的定量研究。

在透射电镜（TEM）研究中，通常需要包含数百万个细胞的细胞沉淀，以便有效地将细胞包埋于琼脂糖/明胶基质中，并进行洗涤、脱水和渗透处理，从而获得大量细胞的数据。研究人员已采用将细胞悬液固定于BSA-双丙烯酰胺聚合树脂中、在薄支撑膜上染色单层细胞，或使用细胞离心涂片法来应对细胞数量少或样本稀少情况下的TEM分析^4-6。然而，由于细胞在基质中分布稀疏，且在细胞离心涂片制备过程中细胞可能发生铺展及细胞间裂解，导致细胞形态改变，因此在TEM下定位和切取细胞仍是一项繁琐的工作，常需在切片前重新包埋。此外，单层细胞在切片时仍难以定位¹¹。因此，即使是从细胞数量较少的稀有生物样本中获得的细胞沉淀，也更便于进行TEM分析¹。

与先前已发表的方法相比...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
20% 甲醛水溶液	电子显微镜科学公司	15713	注意 吸入或皮肤接触有毒。佩戴手套，并在通风橱中操作。
70% 戊二醛水溶液	电子显微镜科学公司	16350	注意 吸入或皮肤接触有毒。佩戴手套，并在通风橱中操作。
卡考基酸盐缓冲液	电子显微镜科学公司	12300	用蒸馏水配制 0.1 M 卡考基酸盐缓冲液（pH 7.4），4 °C 保存。注意 吸入或皮肤接触具有刺激性，佩戴手套并在通风橱中操作。
伊文思蓝	西格玛	E-2129
低熔点琼脂糖	西格玛奥德里奇	A-5030
四氧化锇	电子显微镜科学公司	19130	将 1 g 四氧化锇溶于 50 ml 0.1 M 卡考基酸盐缓冲液中，配制成 2% OsO4 储存液，注意 吸入或皮肤接触剧毒，强氧化剂，需穿戴防护服和护目镜，在通风橱中操作。
LX-112 包埋试剂盒（LADD®)
DDSA（十二烯基琥珀酸酐）	LADD	21340	将 16% DDSA、30% NMA 和 54% LX-112 混合后，加入 1.4% DMP-30
NMA（纳迪克甲基酸酐）	LADD	21350
环氧树脂 Epon 812（LX-112）	LADD	21310	注意 吸入或皮肤接触有毒。佩戴手套、防护服，并在通风橱中操作。
DMP-30（2,4,6-三(二甲氨基甲基)苯酚）	LADD	21370
雷诺氏柠檬酸铅（EM Stain II）	徕卡		注意 吸入有毒，避免接触皮肤或眼睛。
醋酸铀酰（EM Stain I）	徕卡	8072820	注意 吸入有毒，避免接触皮肤或眼睛。
伊氏改良杜尔贝科培养基（IMDM）	美国典型培养物保藏中心	30-2005	成分：NaCl、NaHCO3、HEPES、葡萄糖、Ca、Mg、丙酮酸钠 等。详细信息请见：https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx
锥形尖端模具	特德·佩拉	10585
包埋圆柱模具	特德·佩拉	10580
超薄切片机	（徕卡 EM UC7）
200 目镍网栅	电子显微镜科学公司	G-200 Ni
电子显微镜	日立 H-7650 型
图像采集软件	AMT-600
35 mm 塑料培养皿	费希尔科技
快干胶氰基丙烯酸酯	电子显微镜科学公司	72588
剃须刀片
玻璃闪烁瓶	费希尔科技	03-337-14
载玻片
睫毛工具
金属环工具