方法文章

利用大鼠肝门阻断模型进行肝内节段性直接给药的方法

DOI：

10.3791/54729

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2017年4月2日

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1Collaboration for Organ Perfusion, Protection, Engineering and Regeneration (COPPER) Lab, Division of Transplant, Department of Surgery, Comprehensive Transplant Center, The Ohio State University Wexner Medical Center

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

建立了一种独特的大鼠肝脏肝门阻断模型，用于研究药物分子在减轻缺血-再灌注损伤中的作用。该模型通过门静脉分支对缺血肝段的门脉供血进行直接插管，从而实现肝脏的直接给药。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肝脏主要手术中采用入肝血流阻断以及肝移植手术，均需经历一段时间的热缺血及随后的再灌注过程，从而导致缺血/再灌注（I/R）损伤，并引发多种不良后果。对于拟用于肝移植的边缘性供肝而言，潜在的I/R损伤会降低器官利用率，进而加剧目前供体短缺的问题。因此，迫切需要深入研究肝I/R损伤，以减轻其对移植后移植物功能的不利影响。目前常采用大鼠肝门阻断模型来评估不同分子对肝I/R损伤的作用。根据具体实验设计，这些分子可通过吸入、硬膜外输注、腹腔注射、静脉给药或经外周肠系膜上静脉注射等方式给予。本研究建立了一种用于评估药物分子缓解I/R损伤效果的大鼠肝门阻断模型。该大鼠肝门阻断模型的关键在于通过门静脉侧支直接插管至缺血肝段的供血分支，实现药物对肝段的直接靶向输送。本方法的具体操作为：对左侧外叶和中叶肝脏实施60分钟缺血，在此期间持续输注待研究物质。本例中，将聚乙二醇化超氧化物歧化酶（PEG-SOD）——一种自由基清除剂——直接输注至缺血肝段。系列实验结果表明，输注PEG-SOD可有效减轻肝I/R损伤。该方法的优势在于可将药物直接注入缺血肝段，从而减少药物分布容积，并降低全身性不良反应的发生风险。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肝脏主要手术中采用入肝血流阻断以及肝移植手术，均需要经历一段暖缺血时间及随后的再灌注期，从而导致缺血/再灌注（I/R）损伤1。肝脏I/R损伤的后果已有大量文献详细阐述1,2,3。文献中描述的I/R损伤后果包括：活性氧物质的生成，炎症级联反应的启动（包括中性粒细胞、库普弗细胞和内皮细胞的活化），血红素加氧酶系统的活化以及Toll样受体的活化，内皮素与一氧化氮之间的失衡，核因子-κB的活化，以及促炎性细胞因子和黏附分子合成的增强1,2,3。这些促炎性事件可能导致细胞凋亡、坏死、器官功能障碍，最终导致器官衰竭3。

用于肝移植的器官若发生缺血-再灌注（I/R）损伤，可能导致早期移植物失功，并因边缘供体器官更易受损而加剧当前供体短缺的问题3。目前，美国等待肝移植的潜在受者达15,226人4，而2015年仅实施了5,950例肝移植手术5。由于器官供体资源极为有限，亟需开展针对肝脏I/R损伤的研究，以优化移植物功能并提高器官利用效率。

用于研究肝缺血-再灌注损伤的动物模型包括大鼠肝门阻断模型和大鼠肝移植模型。目前有多种大鼠肝门阻断模型在使用，其中最常见的是采用显微外科夹夹闭供应左外叶和中叶的门静脉、肝动脉和胆管的模型。6,7,8,9,10,11,12 30至60分钟6,7,10,13,14，随后进行60分钟至24小时的再灌注期7,9,10,13,14 允许切除大鼠肝脏的左侧叶和中叶，其约占肝实质的70%9一些旨在研究缺血预处理的实验方案包括在通过夹闭肝门血管诱导较长时间缺血之前，对肝门血管或后肢进行间歇性夹闭。9,13. 文献中还描述了多种改良方法。第一种是夹闭供应左外叶和方叶的门静脉和肝动脉，但不包括胆管15第二种改良方法是在离断门静脉、肝动脉和胆管之前，通过夹闭这些结构来诱导全肝缺血。16,17,18,19,20第三种改良方法包括夹闭右叶肝门血管30至60分钟。8. 另一种改良方法是夹闭一只后肢的血管束，以诱导肝脏损伤13,21. 本文展示了门静脉阻断术的多种操作方法 图1A-D.

大鼠肝脏肝门阻断模型已被用于研究不同分子和化合物对肝缺血/再灌注（I/R）的影响。根据所采用的模型，这些分子可通过吸入11、硬膜外输注12、腹腔注射17,18,21,22、静脉给药10,14,15,19,23,24，或注入外周肠系膜上静脉8等方式递送。

本报告中详述的大鼠肝脏肝门阻断模型包括通过门静脉的侧支直接插管至缺血节段的门脉供血区（图2），从而实现将待研究药物直接输送至肝段组织。我们的方法是诱导左侧叶和中叶缺血60分钟，在此期间直接向缺血节段输注待研究物质，本实验中为聚乙二醇化超氧化物歧化酶（一种自由基清除剂）25。在诱导缺血前及再灌注后120分钟采集血液样本。随后处死大鼠，并采集左叶和中叶组织样本。此外，还采集右叶组织样本作为内部对照。

这种方法具有诸多优势。首先，当所研究的药理学物质可直接注射至缺血区域时，其分布容积相较于注射到体循环或腹腔内的分布容积要低得多。此外，这种方法虽不能完全消除，但可减少系统性副作用的可能性。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有操作均按照机构动物护理指南和美国国家研究委员会《实验动物人道护理与使用指南》（IACUC）的规定进行，并已获得俄亥俄州立大学IACUC委员会的批准。

1. 初始设置

  1. 设置手术显微镜和手术室（图3，图4）。开启所有设备，包括麻醉维持和生命体征监测设备。打开电外科设备和加热垫。将输液泵放置在手术台附近。
    1. 用麻醉注射器抽取10 mL用于吸入的液态异氟烷（分子量184.5），并将其放入麻醉机中。
    2. 在手术台附近放置一个200 mL的液氮容器，在用于处理血液样本的离心机附近另放一个。
    3. 将手术器械、4-0和7-0编织丝线、无菌棉签、4×4无纺布纱布、5 mL注射器以及27号胰岛素注射器放置在手术台附近。
  2. 准备异氟烷麻醉舱，并确保麻醉诱导输送系统中已加入足量的异氟烷。

2. 麻醉诱导

  1. 操作大鼠前，应穿戴以下个人防护装备（PPE）：外科口罩、外科手套和一次性防护服。
  2. 称量大鼠体重并记录。
    注意：应使用Sprague Dawley大鼠。
  3. 将大鼠放入麻醉舱中，打开异氟烷和氧气，通过异氟烷舱诱导麻醉。
  4. 使用电动剃毛器剪除动物腹部的毛发，以获得更清洁的暴露区域（图5）。
  5. 将动物重新放回异氟烷舱中额外麻醉一分钟。进行足趾夹捏测试以确认麻醉深度。

3. 实验步骤

  1. 将大鼠鼻部置于鼻罩内，并用固定装置或胶带将四肢固定在加热垫上。
  2. 通过麻醉输送系统、鼻罩和异氟烷继续实施麻醉，对于体重在200至250克之间的动物使用3.6%浓度，体重超过250克的动物使用4%浓度。通过脚趾夹捏和皮肤夹捏测试确认麻醉深度。
  3. 使用锐利剪刀沿腹中线从耻骨至剑突水平切开皮肤（图6）。
  4. 沿腹白线从耻骨至剑突切开腹膜进入腹腔，注意避免损伤膀胱或肠道。由于肝脏前部靠近剑突处亦与腹膜粘连，确保在此区域切开腹壁前先将其松解。
  5. 在右肝叶下缘水平处横向切开皮肤及腹膜。
  6. 将麻醉浓度下调至1.6%（体重200–250 g动物）或2%（体重>250 g动物）。
  7. 使用弯头蚊式钳抬起剑突。
  8. 放置肋骨牵开器，尽可能将肋骨从中线向两侧拉开（图7）。剪断镰状韧带、膈韧带和胃韧带。用湿润的无菌棉签将肝脏向上翻起。
  9. 根据需要剪断其他韧带以暴露肝门区域。使用生理盐水湿润的纱布进行内脏旋转（图7）。
  10. 采用锐性或钝性分离法清除门静脉肝门部及其全程表面的疏松结缔组织。
  11. 用镊子穿透左门静脉、动脉和胆管后方的疏松结缔组织，形成一个通道，穿过4-0 Potts缝线但暂不打结（图8）。
  12. 清除位于右肾大致水平处汇入门静脉的后支表面的疏松结缔组织。该静脉将用于插管。
  13. 使用胰岛素注射器从下腔静脉（IVC）抽取0.5 mL血液（图9）。将0.5 mL血液置于小瓶中，在135 × g条件下离心12分钟，尝试分离血清。
    1. 若红细胞与血清之间界面不清晰，可在135 × g条件下额外再离心2–3分钟。吸取血清并转移至另一小瓶用于丙氨酸氨基转移酶（ALT）检测。将样本直接浸入液氮中迅速冷冻。
  14. 剪取两段7-0缝线并放置于拟插管静脉附近。将第一根7-0缝线尽可能靠内侧环绕该静脉，打结后用弯头蚊式钳牵拉固定（图10）。在该静脉靠近与门静脉交汇处再放置第二根7-0缝线并打一个结，但暂不收紧。
  15. 准备输注泵，连接装有3 mL试剂的5 mL注射器，并预充管路。
  16. 使用显微外科夹夹闭远端门静脉。
    注：此举可在静脉切开插管时减少出血。
  17. 使用小型显微外科剪刀，在7-0固定缝线与其和门静脉交汇点之间的静脉壁上剪开一个0.5 mm的小孔。使用27-0导管插入左门静脉系统（图11，图12）。将导管插入至左右门静脉分叉远端。
  18. 通过注入1 mL生理盐水检查导管位置，观察肝脏左外侧叶和中叶是否变苍白。手动确认导管已越过右门静脉起始处，但尚未超过供应中叶的门静脉分支起始处。
  19. 收紧Potts缝线并开始记录缺血时间。收紧7-0缝线，固定静脉与27-0导管，随后移除远端门静脉上的夹子。
  20. 启动输注泵，开始输注聚乙二醇-超氧化物歧化酶（PEG-SOD，0.00067 g/mL）。输注开始时间应尽可能接近缺血开始时间。

4. 监测

  1. 在整个输注过程中持续监测动物的生命体征。在15分钟内输注2 mL 0.9%生理盐水或含有PEG-SOD（0.00067 g/mL）的0.9%生理盐水2 mL。

5. 再灌注

  1. 从缺血开始计时，等待一小时。此为1小时的热缺血时间。
  2. 移除Potts缝线。取出27-0导管。收紧静脉周围的7-0缝线。记录时间。此时间点标志着再灌注的开始。

6. 持续采样

  1. 在再灌注后120分钟从下腔静脉（IVC）抽取0.5 mL血液。抽血时应缓慢进行，以避免红细胞溶血。将血液缓慢滴入样品管中。每次采血后应确保下腔静脉的出血得到控制。
    1. 若仍有持续出血，可用无菌棉签或一块1 cm × 1 cm大小的纱布轻轻按压止血。
  2. 以135 × g离心12分钟。如果分离效果不充分，可再额外离心2–3分钟，转速仍为135 × g。
  3. 将一半血清放入样品管中，用于后续ALT检测。迅速冷冻保存这些样本。

7. 安乐死

  1. 在大鼠仍处于麻醉状态时，剪断下腔静脉（IVC）和上腔静脉（SVC），并持续监测直至血流、呼吸和心跳停止。
  2. 切开膈肌，并通过环形切开膈肌并切断肝脏与腹腔之间残留的结缔组织，进行简短的肝切除术。将肝脏从腹腔中取出。
  3. 从肝脏的左叶和中叶取四个样本，从右叶取四个样本。样本应尽可能大，其大小仅受限于可用的肝组织量。将这些样本放入已标记的小瓶中，并在液氮中速冻。用于后续组织三磷酸腺苷（ADP）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH）的检测。

8. 实验后分析

  1. 根据制造商说明书，使用诊断试剂盒检测肝组织和血清样品中的谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性。
  2. 用裂解缓冲液匀浆肝组织，并通过Bradford法进行定量。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离组织裂解液，并使用抗切割型caspase-3和actin抗体进行免疫印迹分析。使用公开可用的软件对Western blot结果进行定量。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本实验共分为两组，每组3只大鼠。其中三只大鼠的肝脏通过输注泵在15分钟内注入2 mL生理盐水（NS）；另三只大鼠的肝脏通过输注泵在15分钟内注入2 mL含有聚乙二醇化超氧化物歧化酶（PEG-SOD，0.00067 g/mL）的生理盐水（NS）。如上述方案所述，在门静脉阻断前及再灌注120分钟时采集血液样本。此外，在完成120分钟再灌注后，从大鼠肝脏的左叶和中叶采集四个肝组织样本，从右叶采集四个肝组织样本。

在对照组（NS）和实验组（PEG-SOD）动物中，分别于肝门阻断前及再灌注后120分钟测定血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平。对照组（NS）动物在肝门阻断前与再灌注后120分钟的ALT水平之间存在显著差异。在再灌注后120分钟时，对照组（NS）与实验组（PEG-SOD）动物的ALT水平之间也存在显著差异（图13A）。对对照组（NS）和实验组（PEG-SOD）动物肝脏左右两叶的组织丙二醛（MDA）水平进行了测定。右叶（未行肝门阻断）在对照注射（NS）与实验注射（PEG-SOD）条件下，组织MDA水平无显著差异。左叶（经肝门阻断及再灌注后）在对照注射（NS）下的组织MDA水平显著高于右叶（未行肝门阻断），p < 0.001。左叶（经肝门阻断及再灌注后）在对照注射（NS）与实验注射（PEG-SOD）条件下的组织MDA水平亦存在显著差异，p < 0.005（图13B）。检测了组织谷胱甘肽（GSH）水平，右叶（未行肝门阻断）在对照注射（NS）与实验注射（PEG-SOD）条件下的组织GSH水平无显著差异。左叶（经肝门阻断及再灌注后）在对照注射（NS）下的组织GSH水平与右叶（未行肝门阻断）在对照注射（NS）下的水平相比，差异显著，p < 0.05。左叶（经肝门阻断及再灌注后）在对照注射（NS）与实验注射（PEG-SOD）条件下的组织谷胱甘肽水平存在显著差异，p < 0.005（图13C）。通过Western blot比较对照组动物肝脏右叶与左叶，结果显示左叶在肝门阻断及再灌注后裂解型caspase-3表达增加（图13D）。另一次Western blot比较了接受对照处理与PEG-SOD处理动物的左叶组织（图13E），结果显示接受PEG-SOD处理动物的肝组织中裂解型caspase-3表达降低。密度测定分析进一步表明，对照组动物左叶肝组织中裂解型caspase-3水平显著高于右叶（图13F）。比较接受PEG-SOD输注的实验组动物与接受生理盐水输注的对照组动物的左叶肝组织，密度测定结果显示，PEG-SOD处理组动物的裂解型caspase-3水平显著低于对照组（图13G）。

肝脏解剖图；门静脉、肝动脉、胆道分支的详细结构；医学教育。
图1：解剖示意图。A. 大鼠肝脏的解剖示意图。B. 大鼠肝脏的解剖示意图。左侧叶和中叶的门脉蒂被夹闭，左侧叶和中叶处于缺血状态。C. 大鼠肝脏的解剖示意图。左侧叶的门脉蒂被夹闭，左侧叶处于缺血状态。D. 大鼠肝脏的解剖示意图。右侧叶的门脉蒂被夹闭，右侧叶处于缺血状态。

用于血管研究的带套管肝脏灌注示意图，展示解剖结构。
图 2： 解剖示意图。 大鼠肝脏的解剖示意图，门静脉通过一支侧支进行套管插管。左叶和中叶肝脏的门脉蒂被缝线环绕，并使用微血管夹紧固于血管束周围。左叶和中叶处于缺血状态。

手术器械设置；工具：剪刀、镊子、手术刀。可见消毒设备。
图3：器械设置。本图展示了器械的设置情况。

用于精细操作的手术显微镜装置；可见显微镜、控制面板和工作台工具。
图 4：手术室装置。 本图展示了手术室的配置。请点击此处查看该图的放大版本。

实验室实验；研究人员处理啮齿动物进行研究；生物学研究操作。
图 5：腹部毛发的修剪。 本图展示了腹部毛发的修剪过程。请点击此处查看该图的放大版本。

在显微镜下进行手术操作；医学研究实验室设置中的无菌技术。
图6：固定与皮肤切口。 本图展示了大鼠的固定方法及皮肤切口操作。请点击此处查看该图的放大版本。

大鼠手术解剖、解剖学研究、实验设置，展示内脏器官和组织分析。
图 7： 肋骨牵开器放置与去脏术。 本图展示了肋骨牵开器的放置及去脏术操作。请点击此处查看该图的放大版本。

动物解剖，手术操作，内脏暴露，解剖学研究，教育科研。
图8：缝线的放置。 本图展示了缝线的放置方式。请点击此处查看该图的放大版本。

实验研究中对实验大鼠进行手术操作，解剖器械，精确技术。
图9： 从下腔静脉采血。 本图展示从下腔静脉采血的操作过程。请点击此处查看该图的放大版本。

动物解剖显示内部器官；生物学教学实验装置。
图10： 静脉分支被结扎并牵开。 本图显示静脉分支已被结扎并牵开。 请点击此处查看此图的放大版本。

对实验大鼠进行手术；用于解剖学研究和生物医学研究的解剖装置。
图11：插管过程。本图展示了插管操作的过程。请点击此处查看此图的放大版本。

大鼠解剖示内部器官；可见手术器械；解剖学研究。
图12：插管术。 本图展示了插管操作过程。请点击此处查看该图的放大版本。

肝脏缺血-再灌注研究；柱状图，免疫印迹；ALT、MDA、谷胱甘肽水平；PEG-SOD。
图13： 代表性结果：利用大鼠肝门阻断模型直接节段性肝内递送聚乙二醇化超氧化物歧化酶。 NS = 生理盐水。PEG-SOD = 聚乙二醇化超氧化物歧化酶，ALT = 丙氨酸氨基转移酶，MDA = 丙二醛。A. 比较肝门阻断前与再灌注后120分钟的血清丙氨酸氨基转移酶（ALT，mU/mL）。对照组（NS）在肝门阻断前与再灌注后120分钟之间存在显著差异（p < 0.001）。在再灌注后120分钟，对照组（NS）与实验组（PEG-SOD）之间也存在显著差异（p < 0.05）。采用学生t检验。误差线表示标准差。B. 右叶（无肝门阻断）组织丙二醛水平在接受对照注射（NS）和实验注射（PEG-SOD）时无显著差异。左叶（肝门阻断后及再灌注后）组织丙二醛在接受对照注射（NS）时显著高于右叶（无肝门阻断）（p < 0.001）。左叶（肝门阻断后及再灌注后）在接受对照注射（NS）与实验注射（PEG-SOD）时组织丙二醛水平存在显著差异（p < 0.005）。采用学生t检验。误差线表示标准差。C. 右叶（无肝门阻断）组织谷胱甘肽在接受对照注射（NS）和实验注射（PEG-SOD）时无显著差异。左叶（肝门阻断后及再灌注后）组织谷胱甘肽在接受对照注射（NS）时显著高于右叶（无肝门阻断）接受对照注射（NS）（p < 0.05）。左叶（肝门阻断后及再灌注后）在接受对照注射（NS）与实验注射（PEG-SOD）时组织谷胱甘肽水平存在显著差异（p < 0.005）。采用学生t检验。误差线表示标准差。D. Western blot显示，对照动物（生理盐水）左叶（肝门阻断后及再灌注后）肝组织中裂解型caspase-3水平高于右叶（无肝门阻断）。E. Western blot显示，与接受对照处理（生理盐水）的动物相比，接受PEG-SOD处理的动物肝组织中裂解型caspase-3水平降低。F. 肝门阻断及再灌注后动物肝组织中裂解型caspase-3水平显著升高（p < 0.05）。采用学生t检验。误差线表示标准差。G. 比较实验动物（灌注PEG-SOD）与对照动物（灌注生理盐水）的左叶肝组织，接受PEG-SOD处理的动物裂解型caspase-3水平显著低于对照动物。采用学生t检验。误差线表示标准差。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本系列实验表明，与对照组（生理盐水）相比，向左叶和中叶注射PEG-SOD可显著降低丙氨酸氨基转移酶（ALT）的释放、细胞膜脂质过氧化（MDA）水平，并维持谷胱甘肽（GSH）水平。肝脏组织转氨酶，包括丙氨酸氨基转移酶（ALT），是肝细胞损伤的明确标志物。左叶注射PEG-SOD后ALT水平降低，提示PEG-SOD具有保护作用。组织MDA水平升高表明脂质过氧化增强，通常被视为氧化应激和组织损伤的标志。活性氧（ROS）的过量产生会导致MDA生成增加26。动物左叶和中叶组织中MDA水平在注射PEG-SOD后显著降低，进一步证明了PEG-SOD的保护作用。这与目前的认识一致，即PEG-SOD可保护细胞免受部分还原态活性氧物种造成的损伤27。此外，在活性氧存在的情况下，氧化型谷胱甘肽（GSSG）被还原为还原型谷胱甘肽（GSH）28。注射PEG-SOD的肝脏左叶和中叶中GSH水平得以维持，进一步支持了PEG-SOD的保护效应。此外，实验还显示，在经历缺血-再灌注损伤的组织中，活化型caspase-3（凋亡产物）水平升高。左叶经PEG-SOD处理后，活化型caspase-3减少，提示PEG-SOD可减少细胞凋亡的发生。

超氧化物歧化酶（SOD）是清除活性氧物种的关键酶。该酶催化两个超氧阴离子转化为过氧化氢和水。随后，过氧化氢酶将过氧化氢转化为水和氧气，从而完成这一过程25。天然SOD的半衰期较短，限制了其在实验模型中的应用，直到聚乙二醇偶联超氧化物歧化酶（PEG-SOD）的开发才得以改善。将SOD与聚乙二醇偶联后，其半衰期从6分钟延长至14小时。Nguyen et al. 在大鼠模型中通过系统给药证明了PEG-SOD能够减轻肝缺血引起的脂质过氧化29。

该技术存在多种潜在的改进方法，其中一些已在文献中有所描述。根据所采用的模型，分子可通过吸入11、硬膜外输注12、腹腔注射17,18,21,22、静脉给药10,14,15,19,23,24，或注射至外周肠系膜上静脉8等方式递送。

本方案中有几个关键步骤，其中最重要的是门静脉插管。必须注意在静脉上切开的孔不能过大，因为组织具有很强的弹性，切口会自行扩大。我们建议使用显微手术剪先切开一个直径约0.5 mm的孔。可通过器械将套管插入切口，相比徒手操作，这种方法更灵活精准。此外，在初始插入套管时，应将其方向对准左、右门静脉的分叉处，以避免刺破静脉后壁。当套管尖端到达分叉部位后，即可将其进一步送入左侧门静脉。一旦套管进入左门静脉（该血管供应左叶和中叶），可通过触诊静脉内部来手动确认其位置。此外，也可通过注入少量冷生理盐水，观察肝脏供血区域是否出现苍白现象，从而验证套管位置是否正确。

大鼠肝门阻断模型为研究肝缺血-再灌注损伤提供了一个可重复且稳定的平台。研究人员已采用多种不同的门阻断模型来研究抗氧化剂及其他小分子的保护作用6,7,8,9,10,11,12,13,14。模型的差异点包括：被夹闭的血管、发生缺血的肝段、是否夹闭胆管，以及再灌注持续的时间6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21。 此外，当该模型用于研究某种分子给药的影响时，给药途径也存在异质性8,10,11,12,14,15,17,18,19,21,22,23,24。本研究所述方法具有若干优势。首先，对缺血肝段的门静脉系统进行直接插管，可实现药理学物质在肝段内的直接递送，从而可将肝脏其他叶作为内部对照。其次，肝段插管可缩小被研究分子的分布容积，通过将物质直接注入目标肝段，降低系统性副作用的风险。肝段直接插管还允许在缺血前、缺血中或缺血后递送物质，从而可在缺血-再灌注损伤周期的任一时间点研究该分子的作用效果。随着缺血时间的延长和损伤程度的增加，该模型还可为肝再生研究提供更多机会。

该方法也存在一些局限性。首先是启动成本。对于尚未配备手术显微镜的实验室而言，购置一台手术显微镜可能是一笔较大的初期投入。若无显微镜，该技术可能难以甚至无法实施。其次是学习曲线所需的时间。尽管该操作相对简单，但仍需要一定练习，初学者可能需要进行大量操作才能达到熟练水平。

总之，该模型为研究肝脏缺血-再灌注损伤提供了一个可重复、简单且经济高效的平台。尽管在本方案中输注了聚乙二醇化超氧化物歧化酶（一种自由基清除剂）25，但该模型也可用于输注多种不同的药物物质，以评估其对肝脏缺血-再灌注损伤的影响。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有作者均声明无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢Dennis Mathias所做的插图工作。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）T32AI 106704-01A1项目以及俄亥俄州立大学器官移植、灌注、工程与再生Flesch基金（T. Flesch Fund for Organ Transplantation, Perfusion, Engineering and Regeneration）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
斯普拉格-多利大鼠 Harlan Sprague Dawley Inc. 200–250 克 
手术显微镜 Leica M500-N w/ OHS
活性炭罐Kent ScientificSOMNO-2001-8
异氟烷 分子量 184.5 Piramal Healthcare
Pressure-Lok 精密分析注射器  Valco Instruments Co, Inc. SOMNO-10ML
电外科设备Macan MV-7A
加热垫Braintree Scientific HHP2
SomnoSuite 小动物麻醉系统Kent Scientific SS-MVG-Module
PhysioSuiteKent Scientific PS-MSTAT-RT
异氟烷麻醉舱 Kent ScientificSOMNO-0530LG
SurgiVetIsotecCDS 9000 台式机
氧气 Praxair98015
27-0 微型套管Braintree Scientific MC-28
肋骨牵开器 Kent Scientific INS600240
聚乙二醇-超氧化物歧化酶（PEG-SOD）Sigma Aldrich S9549 SIGMA
GenieTouchKent Scientific
生理盐水BaxterNDC 0338-0048-04
4 × 4 非织造海绵 Criterion104-2411
无菌棉签Henry Schein Animal Health1009175
U-100 27 号胰岛素注射器Terumo22-272328
5 mL 注射器BD REF 309603
4-0 编织丝线缝合线Deknatel, Inc.198737LP
7-0 编织丝线缝合线Teleflex Medical REF 103-S
1.8 mL Arcticle 冷冻管USA Scientific 1418-7410
显微外科器械
名称公司 目录编号备注
小型剪刀 Roboz RS-5610
大型剪刀S&T SAA-15
镊子 — 大角度S&T JFCL-7
镊子 — 小角度 S&TFRAS-15 RM-8
夹钳施加器ROBOZRS-5440
剪刀 — 非显微FST 14958-1114958-11
镊子 — 直头 S&T FRS-15 RM8TC
大型显微外科夹Fine Scientific Tools18055-01
小型显微外科夹Fine Scientific Tools18055-01
小型显微外科夹Fine Scientific Tools18055-02
小型显微外科夹Fine Scientific Tools18055-03
其他器械
名称公司 目录编号备注
小型蚊式钳通用 
分析 
名称公司 目录编号备注
丙氨酸氨基转移酶（ALT）检测试剂盒 BiovisionK752-100
丙二醛（MDA）检测试剂盒 Abcam ab118970
谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒Cayman Chemical7030002
抗体 — Cleaved Caspase-3 和 Actin Cell Signaling TechnologyAntibody 9661
ImageJ 软件 美国国立卫生研究院 
RIPA 裂解与提取缓冲液 Millipore10-188

参考文献

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