本文介绍了一种捕获果蝇（Drosophila）原肠胚形成过程的活体成像方法。该技术使我们能够更深入地理解早期发育过程中所涉及的顶端收缩现象，并进一步分析组织结构重塑期间调控细胞运动的机制。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
原肠作用是多细胞动物（如Drosophila）胚胎发育过程中最早发生的一系列形态学上动态变化的事件。这种形态学改变也被称为上皮-间充质转化（EMT）。EMT的失调与纤维化及癌症转移密切相关。越来越多的证据表明，EMT受到多种分子机制的调控。因此，许多调控顶端收缩的关键基因也被认为是癌症转移中EMT过程的重要因素。与Drosophila原肠作用期间的EMT类似，上皮细胞可被诱导改变其形态，并被重编程以转向多种其他细胞类型的命运。本文提供了一种稳定的Drosophila原肠作用成像方法，用于检测此胚胎发育阶段中形态发生细胞运动的启动以及细胞命运的确定。利用该方法，我们鉴定了原肠作用时期的细胞重排现象，并通过GFP标记的DE-钙黏蛋白证实了顶端收缩在原肠作用过程中的重要性。
引言
原肠胚形成是多细胞动物（如Drosophila1,2）胚胎发育过程中最早发生的一系列形态上动态变化的事件。有趣的是，越来越多的证据表明，这一过程受到机械力与分子机制之间相互作用的调控3。此外，原肠胚形成中的上皮-间充质转化（EMT）过程，也在人类疾病（如癌症转移）中发挥重要作用4-8。因此，许多调控顶端收缩的基因也被证实是癌症转移过程中EMT的关键因子9。由此可见，原肠胚形成时期的顶端收缩是研究上述调控机制以及深入理解癌症转移的理想模型。该技术的优势在于，我们能够实时观察原肠胚形成期间的细胞运动，从而筛选出参与原肠胚形成及癌症转移的相关基因。
尽管细胞间黏附的作用相对鲜为人知，但人们认为它在顶端收缩过程中起着核心作用1。Drosophila 遗传学非常适合在单细胞水平上研究调控分子机制。该模型将帮助我们揭示顶端收缩在原肠胚形成过程中的重要性。此外，该方法还可用于筛选参与癌症转移的基因。对 Drosophila 原肠胚形成过程进行活体成像，进一步使我们能够更详细地理解调控组织重排的分子机制。本文中，我们提供了一种实现该目标的简单方法的全面描述。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
注意：本研究中使用的转基因果蝇包括以下品系：DE-cad::GFP 10。
1. 苹果平板的制备
- 将 12.5 g 琼脂、125 mL 市售 100% 苹果汁、12.5 g 葡萄糖和 375 mL H2O 混合。在微波炉中加热该混合物，并将其倒入 3 cm 的细胞培养皿中。于 4 °C 保存以备后续使用。
- 制备好苹果培养基平板后，在其表面添加一层薄薄的揉捏酵母糊，以供果蝇产卵。
2. 胚胎制备与活体成像实验方案
- 将约50只果蝇（25只雄性和25只雌性）放入一个瓶子中交配，并在覆盖有揉捏酵母的苹果汁培养基平板上过夜产卵。将苹果汁平板置于瓶口处。 将瓶子倒置放入培养箱中。用塑料膜包裹 果蝇 用铝箔包裹培养瓶以促进果蝇产更多卵。
- 第二天早上，将旧的苹果汁平板更换为新的平板。
- 用铝箔包裹瓶子，让果蝇产卵3至4小时。
- 数小时后（3至4小时），使用毛刷或棉签从苹果汁培养皿中收集胚胎，并用PBS冲洗。随后将胚胎转移至12孔细胞培养板中，再用PBS洗涤2至3次。
- 在12孔培养板中用50%次氯酸钠溶液脱绒毛膜5分钟。
- 脱膜处理后，用 PBS 再清洗胚胎 2 到 3 次。
- 将胚胎转移至含有PBS的3 cm细胞培养皿中，在显微镜下根据胚胎边界的透明程度挑选5期胚胎。使用200 µL枪头移取已分期的胚胎。
- 接下来，将两个选定的胚胎置于玻璃盖玻片上，用精细卷紧的滤纸吸去多余的PBS，使胚胎背侧朝上摆放 使用拧紧的滤纸轻轻压盖玻片。随后，用细针和拧紧的滤纸将胚胎以硅脂固定于玻璃盖玻片上。
- 在胚胎上加入一滴卤代烷油 700，将含有胚胎的盖玻片倒置于凹面载玻片上，载玻片底部留出一定空间。
- 使用共聚焦成像系统、氩/488 激光器和油浸物镜（63X）观察胚胎。
注意：准确识别胚胎的适当发育阶段对于捕获原肠胚形成事件的图像至关重要。在这些条件下，可观察到几乎所有胚胎均能正常发育至至少第14阶段。所分析的胚胎可继续培养并发育为成体。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
此处展示了黑腹果蝇（Drosophila）胚胎的原肠作用过程以及胚胎制备流程的总体概述（图1）。利用DE-cadherin::GFP标记细胞膜，并在果蝇原肠作用期间进行活体成像以观察细胞运动（图2）。由于DE-cadherin GFP果蝇可使我们可视化细胞黏附连接结构，因此能够利用该系统追踪细胞顶面的形态变化与细胞运动。更重要的是，该系统还可用于追踪内源性DE-cadherin的表达模式。
图1：胚胎制备流程的总体概述。A) 设置果...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
尽管我们此前已报道过一种类似的方法，可用于捕获果蝇（Drosophila）原肠胚形成过程的活体图像1，但本文所述方法更为详细，且易于追踪内源性钙黏蛋白的表达，因此在筛选参与原肠胚形成的關鍵因子的遗传学筛选中具有重要价值。为了最大限度地提高该成像实验的成功率，必须使用带凹槽的载玻片。机械压力有时会导致胚胎死亡，因此操作胚胎时应尽可能轻柔，因为任何机械应力都可能干扰胚胎原肠胚形成过程。在胚胎固定过程中使用适量的真空脂，可进一步改善活体成像的结果。
确保去壳和胚胎筛选操作快速完成，是本实验方案成功的关键因素。在胚胎完全干燥前使用细针将其粘附固定，对最大化实验结果也至关重要。固定胚胎后，利用共聚焦显微镜观察GFP标记的DE-钙黏蛋白。在活体成像实验中，每10秒采集一次图像，总时长不超过30分钟1。在此条件下，几乎所有胚胎均可正常发育至至少14期。激光功率也应优化。正确进行胚胎处理以减少卵黄膜可能产生的自发荧光同样重要。
原肠作用是发育过程第6阶段发生的动态事件。该发育阶段直...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由代谢紊乱研究阿斯特拉斯基金会（HT）、武田科学基金会（HT）以及日本文部科学省资助的私立大学战略研究基础推进项目（HT）提供支持。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 卤代烃油 700 | Sigma | MKBH 5726 | |
| 真空润滑硅脂 | Beckman | 335148 | |
| 玻璃盖玻片 | Matsunami glass | 厚度 No1 | 24 - 36 mm |
| 胚胎固定器 | Corning | Corning3477 | |
| 塑料果蝇培养瓶 | Hitec | MKC-100 | |
| DE-钙黏蛋白基因敲入果蝇 | REF (10) |
参考文献
- Haruta, T., Warrior, R., Yonemura, S., Oda, H. The proximal half of the Drosophila E-cadherin extracellular region is dispensable for many cadherin-dependent events but required for ventral furrow formation. Genes Cells. 15 (3), 193-208 (2010).
- Oda, H., Takeichi, M. Evolution: structural and functional diversity of cadherin at the adherens junction. J. Cell Biol. 193 (7), 1137-1146 (2011).
- Fernandez-Sanchez, M. E., Serman, F., Ahmadi, P., Farge, E. Mechanical induction in embryonic development and tumor growth integrative cues through molecular to multicellular interplay and evolutionary perspectives. Methods Cell Biol. 98, 295-321 (2010).
- Alderton, G. K. Metastasis: Epithelial to mesenchymal and back again. Nat. Rev. Cancer. 13 (1), 3(2013).
- Fabregat, I., Malfettone, A., Soukupova, J. New Insights into the Crossroads between EMT and Stemness in the Context of Cancer. J. Clin. Med. 5 (3), (2016).
- Serrano-Gomez, S. J., Maziveyi, M., Alahari, S. K. Regulation of epithelial-mesenchymal transition through epigenetic and post-translational modifications. Mol. Cancer. 15, (2016).
- Yu, A. Q., Ding, Y., Li, C. L., Yang, Y., Yan, S. R., Li, D. S. TALEN-induced disruption of Nanog expression results in reduced proliferation, invasiveness and migration, increased chemosensitivity and reversal of EMT in HepG2 cells. Oncol. Rep. 35 (3), 1657-1663 (2016).
- Zheng, X., et al. Epithelial-to-mesenchymal transition is dispensable for metastasis but induces chemoresistance in pancreatic cancer. Nature. 527 (7579), 525-530 (2015).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J. Clin. Invest. 119 (6), 1420-1428 (2009).
- Huang, J., Zhou, W., Dong, W., Watson, A. M., Hong, Y. Directed, efficient, and versatile modifications of the Drosophila genome by genomic engineering. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (20), 8284-8289 (2009).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
