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方法文章

犬动脉和静脉原代内皮细胞的分离与培养

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DOI：

10.3791/54786

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2016年11月18日

 ,  ,  , 
1Department of Clinical Sciences of Companion Animals, Faculty of Veterinary Medicine, Utrecht University

本文内容

摘要

需要开发新的从血管中分离原代内皮细胞的方法。本方案描述了一种新技术，可将目标血管完全翻转，使仅内皮层暴露于酶消化。由此获得的纯内皮细胞培养物可用于研究心血管疾病、疾病建模以及血管生成。

摘要

心血管疾病在人类医学和兽医学中均有研究。内皮细胞已被广泛用作 体外 用于研究血管发生、（肿瘤）血管生成及动脉粥样硬化的模型。目前的标准为 体外 研究人源内皮细胞（ECs）通常采用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和人脐动脉内皮细胞（HUAECs）。在犬类内皮细胞研究中，目前仅有一种细胞系（CnAOEC）可用，该细胞系来源于犬主动脉内皮。尽管目前尚未完全明确，起源于动脉或静脉的内皮细胞之间存在差异。为了更直接的研究方法 体外 内皮细胞功能研究中，我们介绍一种从多种血管中分离犬原代内皮细胞（CaPECs）的新方法。该技术可降低与成纤维细胞和平滑肌细胞等快速增殖细胞发生污染的风险，此类污染在标准分离方法中较为常见，例如用酶溶液冲洗血管或在消化含所有细胞的组织前将血管剪碎。我们描述的技术已针对犬模型优化，但也可轻松应用于其他物种，如人类。

引言

犬被用作心血管疾病研究的大型动物模型，也可能患有先天性（遗传性）血管异常1, 2。为了研究这些疾病，通常使用商业化的内皮细胞系来评估内皮细胞（EC）的功能。目前仅有一种可用于犬的商业化内皮细胞系（CnAOEC），来源于犬主动脉。该细胞系在研究中主要作为对照正常的内皮细胞使用3-5。在人类心血管研究中，最常用的内皮细胞系是人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和人脐动脉内皮细胞（HUAECs），分别来源于人脐带静脉和动脉。自20世纪80年代以来，HUVECs一直被视为血管研究的金标准6。它们被认为是研究内皮功能和疾病适应的经典模型系统。由于遗传背景以及微环境暴露的差异，从不同血管中分离的内皮细胞在形态和功能上存在差异7。此外，HUVECs和HUAECs来源于脐带，这是一种发育中的血管结构，其暴露的条件及对疾病的反应可能无法完全模拟成体血管。因此，将HUVECs和HUAECs中的研究结果普遍外推至心血管疾病是不充分的。

在研究成年内皮细胞（EC）的适应性和行为时，应使用来自目标血管的原代内皮细胞，这是一种更为直接的方法。为了分离这些细胞，已有多种方法被报道。其中一种被广泛描述的方法是用酶消化液灌注血管，该方法也常用于人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的分离8。但这种方法常导致平滑肌细胞和成纤维细胞等非内皮细胞的污染9。另一种常用的分离方法是对切碎的血管组织进行酶消化，随后根据内皮细胞标志物分化簇（CD）31通过荧光激活细胞分选（FACS）进行分选7,8。FACS分选及后续的细胞培养需要相对大量的细胞，因此不适合从小血管中分离内皮层。因此，我们致力于开发一种新型、稳健的方法，用于从多种犬类血管中高纯度地分离出纯净的内皮细胞群体。为验证该新分离方法的效率，我们从不同犬类的大、小动脉和静脉中成功分离并获得了纯化的犬原代内皮细胞（CaPEC）培养物。该方法还可用于培养来源于病变或异常血管的内皮细胞，例如先天性肝内或肝外门体分流血管，这是犬类中一种常见疾病2。此外，由于在操作过程中大部分血管结构保持完整，该方法还可实现从同一血管中分离其他相关细胞类型，例如血管平滑肌细胞。

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方案

伦理声明：本研究中使用的血管是作为多余材料从健康犬的新鲜尸体（n=4）中获取的，这些犬因其他无关的研究项目被实施安乐死（遵循大学3R政策）。异常血管（肝内和肝外门体分流血管，各n=1）是在征得主人知情同意后，从提交至乌得勒支大学伴侣动物临床医院的病犬在死后采集的。

1. 原代犬内皮细胞的分离与培养

  1. 用 0.5% w/v 明胶溶液以每孔 2 ml 预包被 6 孔板，置于 37 °C、5% CO2 的湿化培养箱中孵育 2 小时。接种原代细胞前，去除多余的明胶溶液。
  2. 无菌条件下从新鲜犬类尸体中取出目标血管（例如主动脉、下腔静脉、门静脉）（图 1A）。在目标血管两端放置直钳，以保持血管系统的解剖结构。避免使用镊子对组织进行不必要的操作，以防损伤内皮细胞。
    1. 用手术剪在两端剪断夹住的血管，并从尸体中取出。将血管置于冰上盛有 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）的容器中运输。
      注意：本实验建议使用约 5 cm 长的血管，但长度为 1 cm 的血管也可提供足够的细胞用于培养。
  3. 将血管转移至盛有冰冻 HBSS 的培养皿中。使用手术剪去除血管外壁附着的组织和脂肪，同时保持血管本身的完整性（图 1B）。切割过程中应始终清晰可见血管：使用止血钳或镊子将周围组织拨开，以获得最佳视野。
    1. 用结扎线（例如聚乙醇酸 3-0）封闭血管的分支，随后用手术剪或手术刀将其切除。
  4. 将弯头 Halsted 蚊式钳小心插入血管一端，钳住血管另一端后缓慢回拉，逐步将血管翻转，直至完全内翻（图 1C-G）。此时血管外表面即为内皮细胞层。若翻转过程中遇到阻力，可再次将血管浸入 HBSS 中以减少摩擦。
  5. 在血管两端打荷包缝合线，完全闭合血管，防止非内皮血管组织暴露于消化过程（图 1H）。利用结扎线末端操作翻转后的血管。
  6. 若需延迟进行消化与培养，可在消化步骤（步骤 1.7）前对翻转后的血管进行冷冻保存。
    1. 将翻转后的血管放入冻存管中，加入细胞冻存液。使用冻存盒将样本逐步降温至 -80 °C。若计划在一周内使用，可暂存于 -80 °C；如需长期保存，则应将冻存管转移至 -180 °C。进行内皮细胞分离时，迅速在 37 °C 水浴中解冻冻存管，并立即转移至冰冻 HBSS 中。随后按步骤 1.7 操作。
      注意：由于冷冻过程会导致细胞活力下降，最终分离获得的内皮细胞总数将有所减少。
  7. 将血管转移至 50 ml 离心管中，用 HBSS 冲洗两次，以去除红细胞（或解冻后的残留冻存液）（图 1I）。
  8. 在 50 ml 离心管中加入 30 ml 含 II 型胶原酶（0.15 U/ml）和中性蛋白酶（dispase，0.15 U/ml）的犬内皮细胞生长培养基（CECGM），将血管置于其中，在 37 °C 下消化 1 小时，期间间歇性轻柔震荡。
  9. 将血管从管中取出，细胞悬液于 250 × g 离心 5 分钟。
  10. 将细胞沉淀重悬于 CECGM 中，按每孔 2 ml 接种至培养板（根据血管大小接种 1–3 孔）。将细胞置于 37 °C、5% CO2 的湿化环境中培养，每周更换培养基两次。
  11. 当细胞融合度达到 70–80% 时进行传代。
    1. 用预热的 HBSS 洗涤细胞，去除死亡或未贴壁细胞。每孔加入 200 µl 重组细胞解离酶（1x），放回培养箱孵育 5 分钟，或直至所有细胞脱落。
    2. 将细胞转移至 15 ml 离心管中，加入含 10% 胎牛血清（FCS）的 10 ml 培养基终止消化反应。于 250 × g 离心 5 分钟。将细胞继续培养于明胶预包被的培养板或培养瓶中。

2. 表征

  1. 培养犬主动脉内皮细胞（CnAOECs），并每周两次在显微镜下比较原代细胞与商品化细胞系的形态。
    注意：当内皮细胞达到约 > 70% 达到。
    1. 在预先用0.5%（w/v）明胶包被的T75培养瓶中，使用CECGM培养CnAOECs。当细胞融合度达到70–80%时，每周传代一次。
      1. 传代时，用预热的HBSS洗涤细胞一次，加入1 ml重组细胞解离酶（1x）。将培养瓶放回培养箱中孵育5分钟，或直至所有细胞脱落。加入含10%胎牛血清（FCS）的10 ml培养基（CEGM）以终止胰酶消化。将细胞悬液在250 × g离心5分钟，弃上清液，用1 ml培养基重悬细胞。
      2. 取10 µl细胞悬液，与0.4%台盼蓝按1:1比例稀释。使用自动细胞计数仪进行细胞计数，并接种4.0 × 10⁶个细胞5 新T75培养瓶中的活细胞。向培养瓶中加入10 ml预热的CECGM，于37 °C、含5% CO₂的湿润环境中培养。2.
  2. 从培养的CaPECs和CnAOECs第1代中分离RNA。
    1. 至少收集 1 x 103 将细胞离心成沉淀后，加入20 µl样品制备试剂（SPR），孵育1分钟以裂解细胞。孵育结束后，小心收集含有总RNA的细胞裂解液，并于-70 °C保存。
  3. 使用 cDNA 合成试剂盒将 mRNA 逆转录为 cDNA（例如， iScript) 说明书进行操作。cDNA 可在 4 °C 保存一周，或于 -20 °C 长期保存，直至进行 qPCR 实验。
  4. 检测内皮细胞标志物CD31的基因表达，以确认细胞的内皮来源。依据MIQE简明指南进行实验设计与定量分析10为标准化，检测参考基因GAPDH、RPS19和B2MG的表达水平11.
    1. 将获得的cDNA用无核酸酶水稀释10倍。
    2. 为标准曲线制备池化cDNA样品的4倍稀释液，并以无核酸酶水作为空白模板对照。将样品进一步稀释5次，达到总稀释倍数为50倍，用于qPCR反应。采用384孔板格式，每孔加入10 µl反应体系，设两个重复，其中包含4 µl cDNA和6 µl含20 pmol反向与正向引物的荧光染料混合液。表1).
    3. 将程序设置为95 °C预变性5分钟以激活Taq聚合酶，随后进行39个循环：95 °C变性10秒，Tm退火和延伸30秒。每对引物的Tm值如表所示 表1.
    4. 每次运行后进行熔解曲线分析，以确保仅扩增单一产物。使用参考基因的平均相对含量对样品的表达水平进行归一化，并在反应效率介于95%至105%之间时计算ΔCt值。
  5. 通过血管生成实验评估EC功能。
    1. 向预冷的血管生成载片的每个孔中加入 10 µl 细胞外基质，用移液器吸头轻轻铺展，使其覆盖孔底表面。细胞外基质应保持在冰上操作，并避免将气泡引入凝胶中。将载片置于含有浸湿滤纸的培养皿中，于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中孵育，使凝胶固化。2 30 分钟。
    2. 加入 1.0 × 104 初级 每孔加入50 µl内皮细胞生长培养基中的ECs。将玻片置于37 °C、5% CO₂条件下孵育6小时。2.
    3. 6小时后，使用20倍放大倍数拍摄照片，确保图像中包含整个孔内的区域。

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结果

不同的血管均成功地采用了所述的分离方案（图2）。从健康犬只中成功分离并翻转了主动脉、下腔静脉、门静脉和冠状动脉（每只犬的所有血管，n=4）。采用相同方法，从两例先天性门体分流（分别为肝外型和肝内型，各n=1）中分离出内皮细胞。尽管主动脉易于翻转，但胸段主动脉的操作难度高于腹段主动脉。胸段主动脉具有多个肋间动脉分支，需逐一结扎，以确保消化液仅接触内皮细胞。所分离的尾腔静脉段包含肾静脉的分支点，在翻转前需先行结扎。对于门静脉，需在血管翻转前结扎胃十二指肠静脉的汇入支。犬的冠状动脉是一类较细小的血管（中等体型犬的直径约为1–2 mm），我们取其回旋支的一段进行操作。由于其直径较小，仅翻转约1 cm的短段更为方便，因为蚊式钳无法插入过深。

分离后一天，培养板中可见贴壁细胞。培养过程中，CaPECs 呈多边形，倾向于以簇状生长，如图3所示。分离后3至6天可观察到大量内皮细胞克隆。培养约10天后，...

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讨论

在针对犬内皮细胞（ECs）的研究中，通常使用CnAOEC原代细胞系来模拟犬的内皮细胞谱系3, 12, 13。在人类研究中，脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养仍被视为金标准。显然，仅依赖脐带来源的内皮细胞在心血管研究中存在明显局限性。内皮细胞具有特定的基因表达模式，决定其动静脉特异性。为了反映出生后血管中的这些差异，我们提出了一种基于内皮细胞特定解剖位置的新型分离方法。目前常用的原代内皮细胞分离方法包括用酶溶液灌注血管或在消化前将血管剪碎，这两种方法均存在非内皮细胞污染的风险。我们建立了一种犬原代内皮细胞（CaPECs）的分离技术，其污染风险较低，且适用于小血管。该内皮细胞分离方法基于血管翻转操作，可避免对血管中其他类型细胞的消化。无菌条件下取材血管至关重要，如图1A所示，以防止内皮细胞培养过程中发生细菌或真菌污染。若出现细菌生长，可在培养基中添加额外的抗菌剂（例如，庆大霉素）。根据我们的经验，一旦发生真菌感染，治疗通常难以成功。

为了确保翻转成功，必须获取一段长度约为 5 cm 的血管。促进血管翻转的第二个重要...

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披露

作者无竞争性财务利益。

致谢

作者谨此感谢 Hans de Graaf 和 Tomas Veenendaal 在培养 ECs 过程中提供的技术支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
II型胶原酶Life Technologies17101-015
分散酶（Dispase）Life Technologies17105-041
DMEM (1x) + GlutaMAXLife Technologies31966-021
Hank's 平衡盐溶液Life Technologies14025-050
犬内皮细胞生长培养基 Cell ApplicationsCn211-500
CnAOECsCell ApplicationsCn304-05
胎牛血清（FCS） GE Healthcare16000-044
TrypLE ExpressLife Technologies12604-013
SPRBio-Rad170-8898
iScript 反转录试剂盒Bio-Rad170-8891
SYBR Green 超级混合液Bio-Rad170-8886
Recovery 细胞冻存液Gibco/Life Technologies12648-010使用前保持在冰上
冷冻容器，Nalgene Mr. FrostySigma-AldrichC1562
明胶Sigma-AldrichG1890
手术剪（Mayo 或 Metzenbaum）B. Braun MedicalBC555R
蚊式钳 B. Braun MedicalFB440R
弯头蚊式钳B. Braun MedicalFB441R
聚乙醇酸-3-0 缝线（polyglactin 3-0）EthiconVCP311H
台盼蓝Bio-Rad145-0013
自动细胞计数板Bio-Rad145-0102
双腔计数载片Bio-Rad145-0011
MatrigelBD BiosciencesBD356231需在冰上缓慢解冻
µ-Slide 血管生成实验板Ibidi81501
内皮细胞生长培养基LonzaCC-3156
EGM-2 SingleQuot 试剂盒 LonzaCC-4176

参考文献

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