采用大脑中动脉阻塞技术诱导小鼠缺血性卒中与缺血-再灌注及梗死区域的可视化

摘要

我们描述了一种通过使用硅胶包被的缝合线阻塞大脑中动脉来诱导小鼠脑卒中的模型。该方案可用于诱导永久性阻塞，或暂时性缺血后进行再灌注。

摘要

脑血管疾病在全球人群中具有很高的发病率，包括多种类型的疾病，如中风。为了研究中风对组织损伤的影响并评估治疗干预措施的有效性，已开发出多种物种的若干实验模型。这些模型包括完全性全脑缺血、不完全性全脑缺血、局灶性脑缺血以及多灶性脑缺血。本方案所描述的模型基于大脑中动脉闭塞（MCAO），属于局灶性缺血类别。该技术可在大脑半球一个明确定义的区域产生稳定的局灶性缺血，且比其他方法更具微创性。本方案所述操作在小鼠上进行，原因在于存在多种遗传变异品系，且已有大量针对小鼠标准化的行为学和神经功能缺陷评估测试可供使用。

引言

对脑卒中等心血管疾病的研究依赖于体内模型的应用。为了理解缺血、药物毒性及/或治疗的可能影响，需要采用一种合适、标准化、可靠且可重复的疾病模型，以实现不同治疗组之间的比较研究。在本研究中，我们选用小鼠，因其具有大量可用的转基因品系以及标准化的评估模型。已有研究建立了用于评估实验性缺血性脑卒中后运动与行为功能缺损及其后续恢复情况的评分系统^1,2。

目前有多种缺血性脑卒中模型可供选择，例如完全性全脑缺血、不完全性全脑缺血、多灶性脑缺血以及局灶性脑缺血。其中，局灶性脑缺血也是临床上患者中最常见的脑卒中类型。大多数脑卒中事件由大脑中动脉（MCA）主干或其附近部位发生栓塞性或血栓性闭塞所引发。基于这些特征，本研究所采用的模型能够较好地模拟人类脑卒中的病因学过程，因而所得结果具有高度相关性³。然而，将动物模型中的研究成果转化为人类疾病的治疗手段仍面临巨大挑战。迄今为止，仅有溶栓药物组织型纤溶酶原激活剂被批准用于急性缺血性脑卒中的治疗⁴。

在小鼠局灶性脑缺血模型中，后循环脑卒中模型和脑静脉血栓形成模型具有高度侵入性，限制了其适用性，并制约了可开展的分析范围。然而，其他技术如栓塞性卒中模型、光化学诱导血栓模型、....

方案

所有实验程序均经迈阿密大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，符合美国国立卫生研究院（NIH）指南要求。 实验需使用无菌器械并采用无菌技术。

1. 准备阻断缝线

1. 对于体重在 20 - 25 g 之间的小鼠，使用直径为 0.21 mm 的缝合线；对于体重在 25 - 35 g 之间的小鼠，使用直径为 0.23 mm 的缝合线。MCAO 手术中缝合线类型的选择取决于动物体重。
2. 使用银色笔从硅胶包被的尖端开始，在缝合线上 9 mm 处做标记，作为插入长度的参考。

2. 手术准备

1. 使用实验室麻醉系统，将异氟烷与氧气混合，对小鼠进行麻醉。在商用麻醉机上设置异氟烷浓度为5，氧气流速为2（参见材料表）。将动物转移至手术台面，并通过鼻罩维持麻醉状态（异氟烷设置为1.5–2.5，氧气流速为2）。
   1. 确保小鼠呼吸频率维持在每秒1–2次，无喘息现象。同时确认动物无胡须刺激反应及足底反射（脚趾夹捏反应）。手术期间应至少每5分钟监测一次呼吸频率和呼吸努力程度。
2. 使用无菌棉签在每只眼睛表面滴加一滴眼用润滑剂，以防止手术过程中角膜干燥。或者，也可从无菌药用软管中挤出眼用软膏涂抹于眼部。
3. 将动物翻转为仰卧位，剃除手术切口区域的毛发。....

结果

阻塞缝合的插入路径如图1所示。大脑中动脉阻塞（MCAO）缝合线应沿路径进入阻塞区域，在颈内动脉（ICA）处发生分叉。成功阻塞大脑中动脉将导致组织损伤，可通过TTC染色观察到。图2展示了假手术处理动物（图2A）以及经历60分钟MCAO缺血再灌注动物（在阻塞后90分钟或24小时进行染色，图2B）的染色图像。为确定脑卒中体积，首先使用成像过程中提供的标尺，通过从对侧总脑区面积中减去同侧未梗死区域的面积，计算出每张切片的脑卒中面积。该计算可使用商业软件或开源软件完成。随后，根据切片厚度为1 mm，计算每张切片的脑卒中体积，并将所有切片的脑卒中体积相加。此步骤可得出每只动物的总脑卒中体积，进而可在不同动物组别和处理方式之间进行比较。通常情况下，60分钟的阻塞后接23小时的再灌注，在15周龄未经处理的野生型C57BL/6J小鼠中产生的脑卒中体积约为21 ± 3 mm³。

讨论

成功应用所描述的MCAO方法在很大程度上依赖于对脑血流解剖结构的理解。由于缺乏直接的视觉提示，难以判断缝线放置是否正确，因此在将其用于研究性实验之前，反复练习以熟练掌握该操作至关重要。应分析脑卒中体积以确保结果的一致性。添加激光多普勒系统有助于确定血流是否成功阻断，并应定期使用以确保操作正确执行。通过调整动脉的位置，可帮助将MCAO缝线引导至阻塞部位。为协助引导缝线进入大脑中动脉（MCA），当缝线刚通过颈外动脉（ECA）/颈内动脉（ICA）分叉处时，可用镊子轻压分叉点上方约2-3 mm处的ICA，以引导缝线向左/向下走行，防止其进入翼腭动脉。此外，移动第3.3步中放置的垫枕或将下方结向上并向右牵拉，也有助于调整动脉方向，便于插入操作。本方案其余步骤涉及在体视显微镜下进行的显微外科操作，相对简单明了。据本课题组及他人报道，该方法的成功率约为80–90%。然而，多种因素可能影响动物存活率，包括体温控制和缝线的选择^20,21,22。 术中维持动物体.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.23 mm MCAO 缝合线	Doccol	702345PK5Re
0.21 mm MCAO 缝合线	Doccol	702145PK5Re
银笔	staples	503205
麻醉机	Vetequip	901806
手术剪	Fine science tool	14558-09
直头手术镊	Fine science tool	00108-11
弯头手术镊	Fine science tool	00109-11
弹簧剪	Fine science tool	15000-08
尼龙缝合线	Braintree scintific	SUT-S 104
缝合用缝线	VWR	95057-036
异氟烷	Piramal
2,3,5-三苯基氯化四氮唑	FisherSci	50-121-8005
脑组织切片模具	Braintree scintific	BS-A 5000C
冷冻切片机刀片	VWR	89202-606
可选：
Periflux 激光多普勒系统	Perimed	Periflux 5000
监测单元	Perimed	PF 5010 - LDPM