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方法文章

利用拼接技术扩展纳米图案化基底以调控细胞行为的纳米形貌

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DOI：

10.3791/54840

⸱

2016年12月8日

 ,  , 
1Department of Chemical and Biomedical Engineering, West Virginia University, 2Department of Biomedical Engineering, Columbia University

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用小型纳米图案化模具制备大面积纳米图案化基底的方案，用于研究纳米形貌对细胞行为的调控作用。

摘要

基底纳米形貌已被证明是细胞表型和功能的强效调节因子。为了深入解析纳米形貌对细胞行为的调控作用，需要制备大面积的纳米图案化基底，以便在纳米结构表面培养足够数量的细胞，用于后续的生物化学和分子生物学分析。然而，现有的纳米加工技术在大面积范围内制备高精度纳米图案方面仍存在局限性。本文介绍一种利用拼接技术将小面积、高精度纳米图案扩展至大面积纳米图案化基底的方法。该方法结合了多种技术：首先采用软光刻技术，从结构明确的母模复制出聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具；然后利用拼接技术将多个PDMS模具组装成一个大面积的整体模具；最后通过纳米压印技术在聚苯乙烯（PS）基底上制备出主模具。利用该PS主模具，我们制备了PDMS工作基底，并验证了纳米形貌对细胞铺展的调控作用。该方法为在大面积上制备结构明确的纳米图案提供了一条简单、经济且多功能的技术路径，并有望进一步拓展用于构建具有复合组分的微/纳米级器件。

引言

近期多项研究发现，基底纳米形貌对细胞行为具有显著影响，从细胞黏附、铺展和迁移，到增殖与分化均受其调控1-6。例如，在深纳米光栅结构上培养的细胞表现出更小的细胞尺寸和更低的增殖速率，甚至引发细胞凋亡，尽管与平面对照组相比，其细胞取向性、伸长和迁移能力得到增强2,7-10。此外，已有研究表明，纳米形貌可促进干细胞向特定谱系分化，如神经细胞2,11,12、肌肉细胞13和成骨细胞3,4。同时，由于人们对工程化纳米材料毒性的担忧日益增加14,15，有必要将纳米形貌整合到生理相关的体外（in vitro）模型中，以实现对纳米材料风险的准确评估。为了开展生物化学和分子生物学分析，需要在大面积纳米图案化基底上培养足够数量的细胞。然而，传统纳米加工技术在大面积范围内制备高精度纳米图案方面存在局限性。

包括胶体光刻16和聚合物去混相17在内的自组装方法能够以低成本快速制备大面积纳米结构。由于自组装依赖于组装单元（如胶体颗粒和大分子）之间的相互作用，以及这些单元与基底之间可能存在的相互作用，因此它无法独立用于制备具有精确空间定位和任意形状的纳米结构18。同时，伴随而来的高密度缺陷也是一个缺点。通过采用模板引导的自组装方法，可实现对纳米图案的精确空间控制，该方法利用自上而下的光刻技术提供形貌和/或化学模板，以引导组装单元的自下而上组装过程19-21。其他纳米制造技术，如步进闪光光刻22和卷对卷纳米压印光刻23，虽已被开发出来，但由于工艺复杂或需要专用设备，其应用受到限制。然而，无论是模板法还是其他替代纳米制造技术，均需要具有明确纳米尺度图案的模板或母模。

此类模板和母模通常采用聚焦电子束、离子束或光子束光刻技术制备。例如，电子束光刻（EBL）24 和聚焦离子束光刻25 可实现亚5 nm分辨率的精确图案。双光子光刻技术已展示出小至30 nm的特征尺寸26。尽管聚焦束光刻技术能够制备出结构清晰的纳米级结构，但其高昂的设备投资以及耗时且成本较高的工艺限制了其在学术研究中的广泛应用27。因此，开发一种既高效又经济的技术，以高保真度制备大面积纳米图案表面，具有重要意义。

我们报道了一种简单且成本效益高的拼接技术，可用于从小面积明确定义的模具制备大面积纳米图案化表面28。本实验方案详细提供了从使用电子束光刻（EBL）制备的图案复制聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具，到将多个PDMS模具组装成一个大面积模具，再到在聚合物（如聚苯乙烯，PS）基底上制备主模具，最终生产工作基底的逐步操作流程。利用扩展后的纳米图案化基底，我们展示了纳米形貌对细胞铺展行为的调控作用。

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方案

1. 从电子束光刻模具复制PDMS模具

  1. 制备硅模具29
    1. 在尺寸为 1 × 1 cm 的硅（Si）基底上，以 2,500 rpm 的转速旋涂 200 μl 聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）溶液 1 分钟，形成一层薄膜。
    2. 将 Si 基底上的 PMMA 薄膜在 180 °C 下烘烤 2 分钟。
    3. 使用聚焦电子束在 PMMA 薄膜上写入设计的纳米图案，区域剂量为 300 µC/cm2。
    4. 在显影液中显影 PMMA 纳米图案 80 秒。
    5. 使用电子束蒸发仪在 PMMA 纳米图案上沉积一层厚度为 50 nm 的镍层，输出电压为 10 kV，发射电流为 0.5 mA，沉积速率为 0.5 Å/sec。
    6. 在 80 °C 下，将样品置于 20 ml 去胶液中浸泡 20 分钟，剥离 PMMA 部分。
    7. 通过反应离子刻蚀（RIE）将纳米图案刻蚀到 Si 基底中，获得所需深度的 Si 模具。
      ​注意：使用四氟甲烷（CF4）/氧气（O2）（90%/10%）混合气体，在电感耦合等离子体（ICP）功率为 400 W、RIE 功率为 150 W 的条件下，将 Si 基底刻蚀至 560 nm 深度。
  2. 硅烷化处理 Si 模具
    1. 将玻璃盖玻片和 Si 模具放入一个 100 mm 的聚苯乙烯（PS）培养皿中，并转移至通风橱内的玻璃干燥器中。
    2. 在盖玻片上滴加 10 µl 1H,1H,2H,2H-八氟辛基三氯硅烷。
      ​警示：1H,1H,2H,2H-八氟辛基三氯硅烷可能引起皮肤腐蚀和严重眼损伤。请佩戴适当的个人防护装备（PPE）。
    3. 将培养皿部分盖住。
    4. 在通风橱中将干燥器抽真空，持续 5 小时，以完成 Si 模具的硅烷化处理。
  3. 制备 PDMS 预聚体
    1. 在一次性称量皿中称取 10 g PDMS 树脂和 1.05 g 固化剂。
    2. 使用塑料勺充分混合 PDMS 预聚体。
    3. 将 PDMS 预聚体置于塑料干燥器中抽真空脱气约 20 分钟，直至混合物变得澄清透明。
  4. 复制 PDMS 模具
    1. 将硅烷化处理后的 Si 模具放入一个 60 mm 的培养皿中。
    2. 将 PDMS 预聚体倒入培养皿中的 Si 模具上。
    3. 将培养皿放入塑料干燥器中抽真空脱气约 10 分钟，直至所有气泡消失。
    4. 将培养皿转移至加热板上，在 70 °C 下固化 PDMS 预聚体 4 小时。
    5. 使用镊子小心地将 PDMS 模具从 Si 模具上剥离。
      ​注意：PDMS 模具可在常温条件下储存最多一周。固化后，PDMS 模具中仍存在一些未交联的 PDMS 树脂分子和残留的固化剂30。这些低分子量成分会随时间逐渐扩散至表面并积累，从而影响 PDMS 表面的形貌和力学性能31。但在一周内，这种扩散效应并不显著。

2. 将PDMS模具拼接成一个大型单片模具

  1. 通过重复步骤1.4制备多个PDMS模具。
    注意：每次称取相同质量的PDMS混合物，以获得相同厚度的PDMS模具。
  2. 在光学显微镜下确定各向异性PDMS纳米图案（如纳米光栅）的取向，并用记号笔在PDMS模具背面标记其方向。
    注意：对于各向同性纳米形貌（如纳米柱），无需标记其取向。
  3. 在通风橱中用乙醇清洗硅基底，并用压缩空气吹干。
  4. 用刀片切除每个PDMS模具上无图案的区域。
    ​注意：对于将置于拼接模具边缘的PDMS模具，仅需切除与其他模具接触的无图案区域。
  5. 将裁剪后的PDMS模具带有纳米图案的一面朝下放置在硅基底的镜面一侧，然后将其他模具紧密排列在其周围，但不要相互接触。
  6. 制备PDMS粘合层
    1. 将1 g脱气后的PDMS预聚物（PDMS树脂与固化剂比例为10:1.05）浇注在洁净的玻璃载片（7.5 cm × 2.5 cm）上，形成厚度为0.5 mm的薄层。
    2. 在热板上100 °C条件下加热该PDMS层3–5分钟。用针轻触表面，确保该层部分固化但未完全固化。
      注意：部分固化的PDMS不像未固化的预聚物那样具有流动性，但相比完全固化的PDMS具有粘性。
  7. 将PDMS粘合层贴附在已对齐的PDMS模具背面，迅速翻转整个组装体并转移至热板上。
  8. 在组装体顶部使用金属块施加压缩力（5 kPa），以确保PDMS粘合层与PDMS模具背面良好接触，并在100 °C下固化1小时。
    注意：小心调整金属块的位置，避免组装体发生倾斜。
  9. 移除金属块，并将完整的拼接PDMS模具从硅基底上小心剥离下来。

3. 在PS基底上制备主模具

注意：固定在玻璃载片上的拼接PDMS模具可用于在聚苯乙烯（PS）板或PS薄膜上制备主模具，进而复制出可使用的纳米图案化基底。

  1. 在聚苯乙烯（PS）板上制备主模具
    1. 准备聚苯乙烯（PS）板
      1. 将PS颗粒在80 °C的真空烘箱中干燥两天。
      2. 将压机预热至230 °C。
      3. 从下至上依次组装铝板、聚四氟乙烯（PTFE）片和铝制垫片。
      4. 在具有3 cm（长）× 3 cm（宽）× 0.3 cm（高）方形开口的铝制垫片中加入3.5 g PS颗粒。
        ​注意：该垫片比PDMS模具厚约0.1 cm，因此最终的纳米图案化PS基底厚度约为0.1 cm。
      5. 在铝制垫片上方再放置一片PTFE片，然后放上另一块铝板。
      6. 将整个组件放入压机中。
      7. 在230 °C下预热PS颗粒30分钟。
      8. 对组件施加0.1 MPa的压缩压力，持续5分钟。
      9. 释放压力，然后重新施加0.5 MPa的压缩压力。
      10. 重复步骤3.1.1.9，每次压力增加0.5 MPa，直至达到目标压力1.5 MPa。
      11. 关闭压机加热器，在1.5 MPa恒定压力下冷却至70 °C以下。
      12. 取出组件，并将PS板存放在80 °C的真空烘箱中，以防止水分重新进入PS板。
    2. 将拼接的PDMS模具纳米压印到PS板上
      1. 将PS板放入置于3英寸硅晶圆上的铝制垫片中。
        ​注意：垫片的内尺寸与PS板相同，因此PS板可恰好嵌入垫片中。
      2. 在热板上以250 °C加热PS板30分钟。
      3. 将带有纳米图案的拼接PDMS模具正面朝下放置在熔融的PS板上。
        注意：应先使PDMS模具的一侧接触PS板表面，再逐渐放下另一侧，使其与PS表面接触，以避免界面处产生气泡。
        ​警告：热板表面温度很高。在进行纳米压印操作时需佩戴耐热手套。
      4. 在拼接PDMS模具的玻璃片上放置一块铝板。
      5. 通过在铝板上放置金属块施加12.5 kPa的压缩压力，并保持3分钟。
        ​注意：确保铝板不倾斜。
      6. 抬起并更换铝板上的金属块，将压缩压力增加至25 kPa。
      7. 重复步骤3.1.2.6，将压力进一步增加至50 kPa。
        ​注意：此步骤旨在排除PDMS模具与PS板之间夹带的空气。
      8. 在50 kPa的恒定压力下，将热板温度维持在240至250 °C之间，持续15分钟。
      9. 关闭热板，使整个装置冷却。
        ​注意：可使用风扇加速冷却过程。
      10. 当温度降至50 °C以下后，移除金属块，并小心地将拼接的PDMS模具从PS板上剥离。
        ​注意：PS基底上已形成反向纳米图案，可用作主模具以制备工作用PDMS基底。
  2. 在聚苯乙烯（PS）薄膜上制备主模具
    1. 制备聚苯乙烯（PS）薄膜
      1. 在通风橱中将1 g PS溶解于10 ml甲苯中。
        ​警告：甲苯可能引起皮肤刺激和严重眼损伤，长期或反复接触可能造成器官损害。请穿戴适当的个人防护装备（PPE）。
      2. 在2英寸晶圆上以2,500 rpm转速旋涂1 ml PS溶液1分钟，形成约1 μm厚的PS薄膜。
      3. 将涂有PS薄膜的硅晶圆置于通风橱中3天，使甲苯完全挥发。
      4. 在真空烘箱中80 °C下退火过夜。
    2. 在PS薄膜上进行PDMS模具纳米压印
      1. 将具有纳米形貌的拼接PDMS模具正面朝下放置在置于热板上的PS薄膜上。
      2. 在PDMS模具的玻璃侧放置金属块，施加12 kPa的压缩压力。
      3. 将热板温度升至180 °C，并维持15分钟。
        ​警告：熔融的PS薄膜可能起到润滑作用。请注意防止金属块滑落。
      4. 关闭热板，使整个装置冷却。
        ​注意：可使用风扇加速冷却过程。
      5. 当温度降至50 °C以下后，移除金属块，并小心地将拼接的PDMS模具从PS薄膜上剥离。
        ​注意：图案化的PS薄膜将作为主模具用于制备工作用PDMS基底。

4. 细胞行为的纳米形貌调控

注意：培养人上皮细胞于代表性纳米形貌表面，以展示纳米形貌对细胞铺展的调控作用。

  1. 根据应用需求，使用第3.1或3.2步制备的主模具浇铸PDMS工作基底。
  2. 使用空心钢制拱形冲头，将纳米图案化的PDMS基底切割成圆片，以适配特定多孔板的构型（例如，24孔板）。
  3. 使用镊子将PDMS圆片放入多孔板的孔中。
  4. 使用70%乙醇对PDMS基底进行30分钟灭菌，随后进行30分钟紫外照射灭菌。
  5. 用1×无菌磷酸盐缓冲液（PBS）清洗PDMS基底三次。
  6. 用细胞外基质蛋白包被 PDMS 基底（即，20 µg/ml 纤连蛋白）室温孵育30分钟。
  7. 用无菌 PBS 将 PDMS 基底冲洗三次，每次 5 分钟。
  8. 将人肺癌细胞A549悬浮于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，并使用血细胞计数板对细胞进行计数。
  9. 以每平方厘米2,000个细胞的接种密度接种细胞2 在PDMS基底上培养细胞，并于含5% CO₂的湿润环境中37 °C培养2 一天。
  10. 用 PBS 洗涤细胞三次。
  11. 在 PBS 中含有 4% 多聚甲醛和 2% 戊二醛的混合液中固定细胞 4 小时，并使用 CO₂ 临界点干燥法对细胞进行脱水2 用于扫描电子显微镜观察的临界点干燥仪29.
    注意：多聚甲醛和戊二醛可能导致严重皮肤灼伤和眼睛损伤。应在化学通风橱中操作，并穿戴适当的个人防护装备。

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结果

缝合技术能够高保真地制备大面积的纳米图案化基底。图1a和1b分别展示了从拼接的PDMS模具转印到PS板以及Si基底上PS薄膜的大面积纳米图案。原始EBL写入模具（图1c）与最终PDMS工作基底（图1d）的对比表明，EBL写入的纳米图案可被忠实地转移至工作基底上。不同几何形状和尺寸的纳米拓扑结构可用于调控细胞行为。如图2所示，以A549（一种腺癌源性基底上皮细胞系）作为模型细胞，各向异性纳米光栅可使细胞沿纳米光栅方向伸长，而A549细胞在各向同性纳米柱上则呈现多极形态。

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讨论

我们提出一种简单、经济且多功能的方法，用于制备大面积的纳米图案化基底。为了精确扩展高度定义的纳米图案，需特别关注若干关键步骤。第一步是修整多个聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具。需要去除PDMS模具上的无图案区域，同时应尽可能垂直地切割模具侧壁，以最大限度减少模具之间的间隙，从而降低最终拼接模具中无图案区域的比例。第二步是在硅基底上对准这些PDMS模具的纳米图案表面，且不得产生任何形变。由于PDMS纳米结构容易变形，因此必须将纳米图案表面轻柔且均匀地贴合在硅基底的镜面一侧（避免在PDMS模具与硅表面之间夹入空气）。PDMS模具应尽可能紧密排列，但彼此之间不得接触，以进一步减小最终拼接模具中的无图案区域；否则，在纳米压印过程中接触的纳米结构会发生变形。第三步是PDMS模具的厚度可能在不同批次之间存在差异，因此除了在PDMS浇铸前通过精确调平小型硅模具来确保每个模具自身厚度均匀外，还必须使各模具之间的厚度保持一致。尽管可通过调节涂布在玻璃载片上的PDMS预聚物（粘合层）厚度来补偿PDMS模具间的厚度差异，但过厚的预聚物层可能引发问题：毛细作用力可能将预聚物从PDMS模具之间的缝隙拉至图案表面，从而损坏纳米图案。通过在从电子束光刻（EBL）模具复...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作部分由美国国家科学基金会（NSF）CBET 1227766项目、NSF CBET 1511759项目以及Byars-Tarnay基金资助。我们衷心感谢西弗吉尼亚大学共享研究设施的使用支持，这些设施部分由NSF EPS-1003907项目资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
JEOL 场发射扫描电子显微镜JEOLJSM-7600FEBL
电子束蒸发仪Kurt J. Lesker型号：LAB 18 e-beam 蒸发仪镍沉积
Trion Minilock III ICP/RIE 刻蚀系统Trion Technology型号：Minilock-phantom III
压片机PHI 液压压片机型号：SQ-230H
旋涂仪Laurell Technologies型号：WS-400A-6NPP-LITE
CO2 临界点干燥仪Tousimis型号：Autosamdri-815
硅片University Wafer1080
铝板McMaster-carr9057K123
聚四氟乙烯片材McMaster-carr8711K92
100 mm 培养皿FALCON353003
60 mm 培养皿FALCON353004
玻璃盖玻片Fisher Scientific12-542-B
载玻片Fisher Scientific12-550-34
一次性称量舟Fisher Scientific13-735-743
玻璃干燥器Fisher Scientific02-913-360
塑料干燥器Bel-Art 产品F42025-000
加热板Fisher Scientific1110049SH
镊子Ted Pella, inc.5726
刀片Fisher ScientificS17302
金属块McMaster-carr
打孔器Brettuns Village 皮革工艺用品拱形打孔器
聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）MicroChem495 PMMA A4
聚二甲基硅氧烷（PDMS）Dow CorningSylgard 184 试剂盒
聚苯乙烯Dow ChemicalStyron 685D
1H,1H,2H,2H-全氟辛基甲基二氯硅烷Oakwood Chemical7142
显影液MicroChemMIBK/IPA 按 1:3 比例混合
剥离液MicroChemRemover PG
乙醇Fisher ScientificBP2818500
甲苯Fisher ScientificT324-500
磷酸盐缓冲液（PBS）Sigma AldrichD8537
Dulbecco’s 改良伊格尔培养基（DMEM）Sigma AldrichD5796
胎牛血清Atlanta BiologicalsS11550
多聚甲醛电子显微镜科学公司15712-S
戊二醛 Fisher ChemicalG151-1
纤连蛋白Corning356008
A549 细胞ATCCATCC CCL-185

参考文献

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