利用拼接技术扩展纳米图案化基底以调控细胞行为的纳米形貌

摘要

本文介绍了一种利用小型纳米图案化模具制备大面积纳米图案化基底的方案，用于研究纳米形貌对细胞行为的调控作用。

摘要

基底纳米形貌已被证明是细胞表型和功能的强效调节因子。为了深入解析纳米形貌对细胞行为的调控作用，需要制备大面积的纳米图案化基底，以便在纳米结构表面培养足够数量的细胞，用于后续的生物化学和分子生物学分析。然而，现有的纳米加工技术在大面积范围内制备高精度纳米图案方面仍存在局限性。本文介绍一种利用拼接技术将小面积、高精度纳米图案扩展至大面积纳米图案化基底的方法。该方法结合了多种技术：首先采用软光刻技术，从结构明确的母模复制出聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具；然后利用拼接技术将多个PDMS模具组装成一个大面积的整体模具；最后通过纳米压印技术在聚苯乙烯（PS）基底上制备出主模具。利用该PS主模具，我们制备了PDMS工作基底，并验证了纳米形貌对细胞铺展的调控作用。该方法为在大面积上制备结构明确的纳米图案提供了一条简单、经济且多功能的技术路径，并有望进一步拓展用于构建具有复合组分的微/纳米级器件。

引言

近期多项研究发现，基底纳米形貌对细胞行为具有显著影响，从细胞黏附、铺展和迁移，到增殖与分化均受其调控^1-6。例如，在深纳米光栅结构上培养的细胞表现出更小的细胞尺寸和更低的增殖速率，甚至引发细胞凋亡，尽管与平面对照组相比，其细胞取向性、伸长和迁移能力得到增强^2,7-10。此外，已有研究表明，纳米形貌可促进干细胞向特定谱系分化，如神经细胞^2,11,12、肌肉细胞¹³和成骨细胞^3,4。同时，由于人们对工程化纳米材料毒性的担忧日益增加^14,15，有必要将纳米形貌整合到生理相关的体外（in vitro）模型中，以实现对纳米材料风险的准确评估。为了开展生物化学和分子生物学分析，需要在大面积纳米图案化基底上培养足够数量的细胞。然而，传统纳米加工技术在大面积范围内制备高精度纳米图案方面存在局限性。

包括胶体光刻¹⁶和聚合物去混相¹⁷在内的自组装方法能够以低成本快速制备大面积纳米结构。由于自组装依赖于组装单元（如胶体颗粒和大分子）之间的相互作用，以及这些单元与基底之间可能存在的相互作用，因此它无法独立用于制备具有精确空间定位和任意形状的纳米结构¹⁸。同时，伴随而来的高密度缺陷也是一个缺点。通过采用模板引导的自组装方法，可实现对纳米图案的精确空间控制，该方法利用自上而下的光刻技术提供....

方案

1. 从电子束光刻模具复制PDMS模具

1. 制备硅模具²⁹
   1. 在尺寸为 1 × 1 cm 的硅（Si）基底上，以 2,500 rpm 的转速旋涂 200 μl 聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）溶液 1 分钟，形成一层薄膜。
   2. 将 Si 基底上的 PMMA 薄膜在 180 °C 下烘烤 2 分钟。
   3. 使用聚焦电子束在 PMMA 薄膜上写入设计的纳米图案，区域剂量为 300 µC/cm²。
   4. 在显影液中显影 PMMA 纳米图案 80 秒。
   5. 使用电子束蒸发仪在 PMMA 纳米图案上沉积一层厚度为 50 nm 的镍层，输出电压为 10 kV，发射电流为 0.5 mA，沉积速率为 0.5 Å/sec。
   6. 在 80 °C 下，将样品置于 20 ml 去胶液中浸泡 20 分钟，剥离 PMMA 部分。
   7. 通过反应离子刻蚀（RIE）将纳米图案刻蚀到 Si 基底中，获得所需深度的 Si 模具。
      ​注意：使用四氟甲烷（CF₄）/氧气（O₂）（90%/10%）混合气体，在电感耦合等离子体（ICP）功率为 400 W、RIE 功率为 150 W 的条件下，将 Si 基底刻蚀至 560 nm 深度。
2. 硅烷化处理 Si 模具
   ....

结果

缝合技术能够高保真地制备大面积的纳米图案化基底。图1a和1b分别展示了从拼接的PDMS模具转印到PS板以及Si基底上PS薄膜的大面积纳米图案。原始EBL写入模具（图1c）与最终PDMS工作基底（图1d）的对比表明，EBL写入的纳米图案可被忠实地转移至工作基底上。不同几何形状和尺寸的纳米拓扑结构可用于调控细胞行为。如图2所示，以A549（一种腺癌源性基底上皮细胞系）作为模型细胞，各向异性纳米光栅可使细胞沿纳米光栅方向伸长，而A549细胞在各向同性纳米柱上则呈现多极形态。

讨论

我们提出一种简单、经济且多功能的方法，用于制备大面积的纳米图案化基底。为了精确扩展高度定义的纳米图案，需特别关注若干关键步骤。第一步是修整多个聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具。需要去除PDMS模具上的无图案区域，同时应尽可能垂直地切割模具侧壁，以最大限度减少模具之间的间隙，从而降低最终拼接模具中无图案区域的比例。第二步是在硅基底上对准这些PDMS模具的纳米图案表面，且不得产生任何形变。由于PDMS纳米结构容易变形，因此必须将纳米图案表面轻柔且均匀地贴合在硅基底的镜面一侧（避免在PDMS模具与硅表面之间夹入空气）。PDMS模具应尽可能紧密排列，但彼此之间不得接触，以进一步减小最终拼接模具中的无图案区域；否则，在纳米压印过程中接触的纳米结构会发生变形。第三步是PDMS模具的厚度可能在不同批次之间存在差异，因此除了在PDMS浇铸前通过精确调平小型硅模具来确保每个模具自身厚度均匀外，还必须使各模具之间的厚度保持一致。尽管可通过调节涂布在玻璃载片上的PDMS预聚物（粘合层）厚度来补偿PDMS模具间的厚度差异，但过厚的预聚物层可能引发问题：毛细作用力可能将预聚物从PDMS模具之间的缝隙拉至图案表面，从而损坏纳米图案。通过在从电子束光刻（EBL）模具复.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
JEOL 场发射扫描电子显微镜	JEOL	JSM-7600F	EBL
电子束蒸发仪	Kurt J. Lesker	型号：LAB 18 e-beam 蒸发仪	镍沉积
Trion Minilock III ICP/RIE 刻蚀系统	Trion Technology	型号：Minilock-phantom III
压片机	PHI 液压压片机	型号：SQ-230H
旋涂仪	Laurell Technologies	型号：WS-400A-6NPP-LITE
CO2 临界点干燥仪	Tousimis	型号：Autosamdri-815
硅片	University Wafer	1080
铝板	McMaster-carr	9057K123
聚四氟乙烯片材	McMaster-carr	8711K92
100 mm 培养皿	FALCON	353003
60 mm 培养皿	FALCON	353004
玻璃盖玻片	Fisher Scientific	12-542-B
载玻片	Fisher Scientific	12-550-34
一次性称量舟	Fisher Scientific	13-735-743
玻璃干燥器	Fisher Scientific	02-913-360
塑料干燥器	Bel-Art 产品	F42025-000
加热板	Fisher Scientific	1110049SH
镊子	Ted Pella, inc.	5726
刀片	Fisher Scientific	S17302
金属块	McMaster-carr
打孔器	Brettuns Village 皮革工艺用品	拱形打孔器
聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）	MicroChem	495 PMMA A4
聚二甲基硅氧烷（PDMS）	Dow Corning	Sylgard 184 试剂盒
聚苯乙烯	Dow Chemical	Styron 685D
1H,1H,2H,2H-全氟辛基甲基二氯硅烷	Oakwood Chemical	7142
显影液	MicroChem	MIBK/IPA 按 1:3 比例混合
剥离液	MicroChem	Remover PG
乙醇	Fisher Scientific	BP2818500
甲苯	Fisher Scientific	T324-500
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma Aldrich	D8537
Dulbecco’s 改良伊格尔培养基（DMEM）	Sigma Aldrich	D5796
胎牛血清	Atlanta Biologicals	S11550
多聚甲醛	电子显微镜科学公司	15712-S
戊二醛	Fisher Chemical	G151-1
纤连蛋白	Corning	356008
A549 细胞	ATCC	ATCC CCL-185