扩大奈米基材使用缝合技术的细胞行为Nanotopographical调制

摘要

提出了一种从小纳米图案模具生产大面积纳米图案衬底的方案，用于研究细胞行为的纳米拓扑结构调节。

摘要

Substrate nanotopography 已被证明是细胞表型和功能的有效调节剂。为了解剖细胞行为的纳米拓扑结构调节，需要大面积的纳米图案底物，以便可以在纳米拓扑结构上培养足够的细胞，用于随后的生化和分子生物学分析。然而，目前的纳米制造技术在大面积上生成高度明确的纳米图案方面存在局限性。在此，我们提出了一种使用缝合技术将纳米图案衬底从小的、高度明确的纳米图案扩展到大面积的方法。该方法结合了多种技术，包括软光刻技术从定义明确的模具中复制聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 模具，将多个 PDMS 模具组装到单个大型模具上的缝合技术，以及纳米压印在聚苯乙烯 （PS） 基材上生成母模。使用 PS 母模，我们生产 PDMS 工作基材并展示细胞铺展的纳米拓扑结构调节。这种方法提供了一种简单、经济但通用的途径，可以在大面积上生成定义明确的纳米图案，并有可能扩展到创建具有混合元件的微/纳米级器件。

引言

最近的一些发现表明，底物纳米拓扑结构对细胞行为有显著影响，从细胞粘附、扩散和迁移，到增殖和分化^1-6。例如，在深纳米格栅上培养的细胞中观察到较小的细胞大小和较低的增殖速率，尽管与平坦对照相比，细胞排列、伸长和迁移得到增强，但甚至导致细胞凋亡^2,7-10。此外，纳米拓扑结构已被证明可以促进干细胞分化为某些谱系，例如神经元^2,11,12、肌肉¹³ 和骨骼^3,4。此外，由于对工程纳米材料毒性的担忧日益增加^14,15，因此需要将纳米拓扑结构纳入生理相关的体外模型中，以便对纳米材料进行准确的风险评估。为了满足生化和分子生物学分析，需要在大面积的纳米图案基质上生长足够的细胞。然而，传统的纳米制造技术在大面积上生成高度明确的纳米图案方面存在局限性。

自组装包括胶体光刻¹⁶ 和聚合物混炼¹⁷ 可以很容易地以低成本生成大面积纳米结构。由于自组装依赖于组装元件（如胶体颗粒和大分子）之间的相互作用，以及这些元件与衬底之间可能的相互作用，因此它不能成为生产具有精确空间定位和任意形状的纳米结构的独立方法¹⁸。伴随的高密度缺陷也是一个缺点。纳米图案的精确空间控制可以通过采用模板化自组装来实现，它使用自上而下的光刻方法提供地形和/或化学模板来指导组装元件的自下而上组装^19-21。已经开发了替代纳米制造技术，例如步进和闪光光刻²² 和卷对卷纳米压印光刻²³，但由于其复杂的工艺或需要专用设备，其用途受到限制。然而，模板化或替代纳米制造技术需要具有明确纳米级图案的模板或母模。

这种模板和母模通常是通过使用聚焦电子、离子或光子束光刻技术生成的。例如，电子束光刻 （EBL）²⁴ 和聚焦离子束光刻²⁵ 可以生成分辨率低于 5 nm 的定义图案。双光子光刻技术已证明其特征尺寸小至 30 nm²⁶。尽管聚焦光束光刻技术能够产生明确的纳米级结构，但资本投资和耗时、昂贵的过程限制了它们在学术研究中的广泛使用²⁷。因此，非常需要开发支持且经济实惠的技术来生产高保真度的大面积纳米图案表面。

我们报道了一种简单、经济高效的缝合技术，用于从定义明确的小模具中生成大面积的纳米图案表面²⁸。该协议提供了从使用 EBL 写入模式复制聚（二甲基硅氧烷）（PDMS）模具，到将多个 PDMS 模具组装到单个大模具中，到在聚苯乙烯 （PS） 基材等聚合物上生成母模，再到生产工作基材的分步程序。使用扩增的纳米图案化底物，我们证明了细胞铺展的纳米拓扑结构调节。

方案

1.从EBL模具硅橡胶模具的复制

1. 制造硅模具²⁹
   1. 旋涂200μl的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）以2,500转1分钟1×1 4cm的硅（Si）的基片上的解决方案，以形成薄膜。
   2. 烘烤，在180℃的Si衬底2分钟在PMMA膜。
   3. 通过在300μC/ cm ²的面积的剂量使用聚焦电子束写在PMMA膜中的设计的纳米图案。
   4. 开发开发商PMMA纳米图案为80秒。
   5. 沉积的PMMA纳米图案并在厚度使用电子束蒸发器在10千伏，0.5mA的发射电流和0.5埃/秒的沉积速率的输出电压的50纳米的镍层。
   6. 剥离在20ml卸妆聚甲基丙烯酸甲酯部分在80℃下进行20分钟。
   7. 反应离子刻蚀（RIE）的纳米图案到Si衬底来获得所需的深度的Si模具。
      注意:四面体的混合气体afluoromethane（CF _4），在150瓦400瓦和RIE功率的感应耦合等离子体（ICP）功率/氧（O _{2）（90％/} 10％）被用于蚀刻硅衬底，以560纳米的深度。
2. Silanize思模
   1. 放的玻璃盖玻片和Si模具在100毫米的PS培养皿并在位于通风橱的玻璃干燥器转移它们。
   2. 滴在盖玻片10微升1H，1H，2H，2H-Perfluorooctyltrichlorosilane。
      注意:1H，1H，2H，2H-Perfluorooctyltrichlorosilane可能会导致皮肤腐蚀和严重眼损伤。穿戴合适的个人防护装备（PPE）。
   3. 部分覆盖培养皿。
   4. 保持在真空下的干燥器5小时在通风橱以完成硅模具的硅烷化。
3. 准备PDMS预聚物
   1. 称取10克PDMS树脂和1.05克固化剂在一次性称量舟。
   2. 用塑料勺子调匀的PDMS预聚物。
   3. 直到观察到澄清的混合物脱气在真空下一个塑料干燥器的PDMS预聚物为约20分钟。
4. 复制模具硅橡胶
   1. 把硅烷化硅模具在60毫米的培养皿。
   2. 倒在培养皿硅模具中的PDMS预聚物。
   3. 放置在一个塑料干燥器和脱气培养皿约10分钟，直至所有的气泡消失。
   4. 转移培养皿到烤盘并在70℃固化的PDMS预聚物4小时。
   5. 通过仔细用镊子剥离从硅模具的PDMS模具。
      注:PDMS模具可以存储在环境条件下长达一周。固化后，也有在与PDMS模具³⁰的一些未交联的PDMS树脂分子和残留的固化剂。低分子量的分子将逐渐扩散出来，并在表面上的时间累积。这会影响PDMS表面³¹的地形和机械性能。该DIF融合不是一个星期内显著。

2.拼接PDMS模具投入大，单一的模具

1. 通过重复步骤1.4准备多个的PDMS模具。
   注:称取同样量的PDMS混合物的每次获得相同厚度的PDMS模具。
2. 确定的各向异性PDMS纳米图案的取向，如在光学显微镜下nanogratings并标记上的PDMS模具用记号笔的背面。
   注意:这是没有必要来标记各向同性纳米形貌的取向，如纳米支柱。
3. 在通风橱中清洗用乙醇Si衬底并用压缩空气干燥。
4. 修剪过用刀片每个PDMS模具的无图案的区域。
   注:对于将被放置在缝合模具的周边的PDMS模具，仅在与他人接触的无图案区应修剪掉。
5. 将修剪PDMS模具的纳米图案面朝下的所述Si衬底的镜侧然后对齐靠近但不接触周围的模具（多个）其它模具。
6. 准备PDMS粘合层
   1. 投1克脱气的PDMS预聚物（PDMS树脂和固化剂的比例:10:1.05）在一个干净的载玻片（7.5厘米* 2.5厘米），以形成0.5mm厚层。
   2. 烘烤，在100℃上3-5分钟热板的PDMS层。用针触摸层和确保该层被部分地而不是完全固化。
      注:部分固化的PDMS不能流动像固化PDMS预聚体，但与固化硅橡胶相比，它已被置顶。
7. 放置在对准的PDMS模具的背侧的PDMS层，并迅速反转此组件，并将其转移到加热板上。
8. 上使用组件的顶部的金属块，以确保与PDMS粘合层和PDMS模具的背面之间具有良好的接触，并且固化所述PDMS粘合层在100℃下1小时施加压缩力（5千帕）。
   注意:小心地调整金属块的位置，避免组件的倾斜。
9. 去除金属块和剥离从Si基板的单一的，缝合的PDMS模具。

3. PS基板母模的生成

注意:固定在载玻片上的缝合的PDMS模具可被用来生成对一PS板或PS薄膜，从该工作纳米图案基板可以制造母模。

1. 产生于PS版母模
   1. 准备一个PS版
      1. 干燥在真空烘箱中在PS粒料在80℃两天。
      2. 在230℃预热的压机。
      3. 组装的铝板，聚四氟乙烯（PTFE）片和铝间隔中从底部顺序到顶部。
      4. 负载3.5克聚苯乙烯粒料于铝垫片具有方形开口3厘米（长）×3厘米（宽）×0.3厘米（高）。
         注:该间隔是约0。1厘米比PDMS模具厚，并因此最终纳米图案的PS基底为约0.1厘米厚。
      5. 广场上的铝间隔另一四氟板，然后又铝板。
      6. 将组件压机。
      7. 预热，在230℃下的PS粒料30分钟。
      8. 应用在组件的压缩压力（0.1MPa）下5分钟。
      9. 释放压力，然后重新应用0.5兆帕上装配一个压缩的压力。
      10. 重复步骤3.1.1.9 0.5兆帕的压力增加，直到1.5兆帕的所需压力为止。
      11. 关闭压机的加热器，并在1.5MPa的压力恒定冷却下来低于70℃。
      12. 取组件出并在真空烘箱中在PS板存储于80℃，以防止重新进入PS板水分。
   2. 纳米压印缝合PDMS模具放入PS版
      1. 放置PS版的铝垫片一个3英寸的硅晶片上设置的。
         注:隔板的内部尺寸是相同的PS版，使PS版适合直接在间隔物。
      2. 加热上，在250℃的加热板上30分钟的PS板。
      3. 把缝合PDMS模具上的熔融PS版纳米图案面朝下。
         注意:与PDMS模具的一侧放置在触摸与PS板的表面的第一和另一侧中与PS表面接触逐渐降低，以避免气泡的界面处形成。
         注意:烤盘表面是热的。在纳米压印过程中佩戴thermogloves。
      4. 将铝板上缝合PDMS模具的搏命。
      5. 通过使用该铝板金属板施加压缩压力（12.5千帕），并等待3分钟。
         注:确保铝板没有倾斜。
      6. 提起并从该铝板代替金属块和我现象越来越多压压到25千帕。
      7. 重复步骤3.1.2.6与压力提高到50千帕。
         注意:此步骤是除去捕集的PDMS模具和PS板之间的空气。
      8. 保持50千帕的15分钟的稳定的压力下240和250℃之间的加热板的温度。
      9. 关闭电磁炉和冷却整个安装。
         注:风扇可以用来加速冷却过程。
      10. 除去金属板的温度低于50℃后，小心地剥离从PS板缝合的PDMS模具。
          注:PS衬底具有反向纳米图案和可以用作一个母模制作工作的PDMS衬底。
2. 生成一个PS薄膜的母模
   1. 准备PS薄膜
      1. 溶解在10ml甲苯1克PS在通风橱中。
         注意:甲苯可引起皮肤irritation和严重眼损伤，并可能导致长期或反复接触器官造成伤害。穿戴合适的个人防护装备。
      2. 在2500转1分钟上的2合晶片旋涂1毫升PS溶液，以形成约1微米厚的聚苯乙烯薄膜。
      3. 通过在通风橱中3天设置硅晶片上的聚苯乙烯薄膜蒸发从膜甲苯。
      4. 在80℃退火在真空烘箱中在PS薄膜过夜。
   2. 纳米压印在PS薄膜的PDMS模具
      1. 把缝合的PDMS模具与PS上的薄膜，它是在电炉上设置纳米形貌面朝下。
      2. 通过使用上的PDMS模具的玻璃侧金属板施加12千帕的PDMS模具的压缩压力。
      3. 提高热板的温度升高到180℃，并保持它为15分钟。
         注意:熔融聚苯乙烯薄膜可以作为润滑剂的作用。要注意防止金属块滑落。
      4. 关闭烤盘和冷却整个安装。
         注:风扇可以用来加速冷却过程。
      5. 除去金属板的温度降至50℃以下之后，并小心地剥离从PS膜缝合的PDMS模具。
         注:该纳米图案化的聚苯乙烯薄膜将作为母模生产工作PDMS基板。

4.细胞行为Nanotopographical调制

注意:人的上皮细胞是培养的代表nanotopographies展示的细胞扩散nanotopographical调制。

1. 从任一步骤3.1或3.2取决于应用程序生成的母模铸造PDMS基板工作。
2. 使用中空钢拱冲床，剪奈米PDMS基板刻录到光盘上，以适应特定的多孔板（ 例如 ，24孔板）的配置。
3. 用镊子将PDMS光盘放入井中Ø发多孔板。
4. 通过使用70％的乙醇中，然后UV曝光，每次30分钟进行消毒的PDMS衬底。
5. 洗用1×无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）的三倍的PDMS衬底。
6. 涂层与细胞外基质蛋白（ 即 ，20微克/毫升纤连蛋白）在室温下30分钟的PDMS衬底。
7. 冲洗的PDMS衬底用无菌PBS清洗3次，每次5分钟。
8. 暂停人肺癌细胞A549中的Dulbecco用10％胎牛血清改良Eagle培养基和使用血球计数细胞。
9. 板以2,000个细胞/ cm ²的对PDMS衬底并进行培养的接种密度将细胞于37℃在含有5％CO ₂的一天的潮湿气氛中。
10. 洗细胞用PBS洗3次。
11. 固定细胞在PBS中的4％多聚甲醛和2％戊二醛的混合物4小时，使用CO ₂临界婆脱水细胞INT机扫描电子显微镜观察^29。
    注意:多聚甲醛和戊二醛可能引起严重的皮肤灼伤和眼睛损伤。工作在化学罩和穿戴适当的个人防护装备。

结果

线圈技术可以产生具有高保真纳米图案基板的大面积。 图1a和1b分别显示从缝合的PDMS模具PS板和PS薄膜的Si衬底上转移，纳米图案的大的面积。原始EBL写入模具（ 图1c）和工作基板（ 图1d）的最终的PDMS之间的比较证实，EBL写纳米图案可以忠实地转印到工作衬底。各种几何形状和尺寸的纳米形貌可以用于调节细胞行为。如在图2与A549证明，一个adenocarcinomic基底上皮细胞系作为模型细胞，各向异性nanogratings可伸长细胞随着多极化形态是A549细胞上各向同性纳米柱显示相比nanograting方向。

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图 大面积使用缝合技术，纳米图案化衬底...

讨论

我们提出了一个简单，经济实惠，还没有通用的方法来生成纳米图案化衬底的大面积。要忠实地扩大高度定义的纳米图案，极具应注意的几个关键步骤。第一个是修剪多个PDMS模具。与PDMS模具的无图案的区域需要被去除。此外，模具的侧壁应切垂直地尽可能完美以最小化模具之间的间隙。总的来说，未图案化的区域中的最后一针模的部分可以减小。其次，需要没有在硅衬底上的任何扭曲对齐这些PDMS模具的纳米图案表面。因为PDMS纳米结构容易变形，这是至关重要的纳米图案的表面放置针对轻轻和均匀的硅基板的镜侧（避开PDMS模具和硅表面之间捕集的空气）。将PDMS模具将尽可能接近对齐，但不触及NEIghboring模具进一步减少最终线圈模具的无图案部分。否则，所触摸的纳米结构将纳米压印期间变形。第三，PDMS模具的厚度可以变化批次，因此至关重要的是使除了厚度均匀，由PDMS铸造之前完全整平小的Si模具使每个模具均匀的厚度。虽然在整个的PDMS模具厚度的变化可以通过调整的PDMS预聚物（粘合剂）的厚度来补偿层浇注在玻璃片上，一个厚的预聚物层可能是有问题的。所述预聚物可以通过与PDMS模具由毛细管力的图案化表面之间的空隙中被拉出，并因此损坏纳米图案。厚度变化可以通过从EBL模具...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
JEOL 场发射 SEM	JEOL	JSM-7600F	EBL
电子束蒸发器	Kurt J. Lesker	型号：LAB 18 电子束蒸发器	镍沉积
Trion Minilock III ICP/RIE	Trion 技术	型号：Minilock-phantom III
压力机	PHI 液压机	模具：SQ-230H
旋涂机	Laurell技术	型号： WS-400A-6NPP-LITE
CO2 关键干燥机	型号	： Autosamdri-815
硅片	大学晶圆	1080
铝板	McMaster-carr	9057K123
特氟龙板	McMaster-carr	8711K92
100 mm 培养皿	FALCON
60 mm 培养皿	FALCON	353004
玻璃盖玻片	Fisher Scientific	12-542-B
载玻片	Fisher Scientific	12-550-34
一次性称重船	Fisher Scientific	13-735-743
玻璃干燥器	Fisher Scientific	02-913-360
塑料干燥器	Bel-Art Products	F42025-000
Hotplate	Fisher Scientific	1110049SH
镊子	Ted Pella， inc.	5726
刀片	Fisher Scientific	S17302
金属块	McMaster-carr
Punch	Brettuns Village 皮革工艺用品	Arch punch
聚（甲基丙烯酸甲酯）	MicroChem	495 PMMA A4
PDMS	道康宁	Sylgard 184 套件
聚苯乙烯	陶氏化学	Styron 685D
1H，1H，2H，2H-全氟辛基甲基二氯硅烷	Oakwood Chemical	7142
显影	MicroChem	MIBK/IPA 按1：3的比例
剂	MicroChem	去除剂 PG
乙醇	Fisher Scientific	BP2818500
甲苯	Fisher Scientific	T324-500
磷酸盐缓冲盐水	Sigma Aldrich	D8537
Dulbecco's 改良鹰培养基	Sigma Aldrich	D5796
胎牛血清	Atlanta Biologicals	S11550
多聚甲醛	电子显微镜科学	15712-S
戊二醛	Fisher Chemical	G151-1
纤连蛋白	Corning	356008
A549 细胞	ATCC	ATCC CCL-185