用于肿瘤生长与转移研究的乳腺癌患者来源异种移植瘤的可示踪报告标记

摘要

我们描述了一种利用表达绿色荧光蛋白和荧光素酶报告基因的慢病毒颗粒对患者来源的异种移植瘤（PDXs）进行稳定标记的方法。该方法可用于追踪PDXs在原发部位的生长情况，并能够通过活体成像检测自发性及实验性转移灶。 体内 成像系统

摘要

利用临床前模型研究肿瘤生物学特性及其对治疗的反应是癌症研究的核心。长期以来使用的人类细胞系以及许多转基因小鼠模型往往无法充分模拟人类恶性肿瘤的关键特征。因此，研究人员正在开发能够更好地反映患者肿瘤及其转移灶异质性的替代模型。将手术切除的肿瘤组织移植到免疫缺陷小鼠体内建立的患者来源异种移植（PDX）模型因其可连续多代传代，且比来源于人类癌细胞系的异种移植模型更有效地保留肿瘤异质性，已成为一种具有吸引力的替代方案。PDX模型的一个局限性在于，难以对其进行转染或转导以引入可追踪报告基因或调控基因表达。本实验方案描述了高效转导PDX来源解离肿瘤细胞的方法，以及利用标记后的PDX模型开展乳腺癌转移实验研究的应用。该方案还展示了在实验性转移模型中使用标记PDX模型研究转移级联过程中器官定植的能力。通过活体动物的生物发光成像，或在解剖及离体器官中检测GFP表达，可方便地对不同器官中的转移灶进行可视化观察和定量分析。这些方法为拓展多种类型PDX模型在转移研究中的应用提供了有力工具。

引言

患者来源的肿瘤异种移植模型（PDX）是将手术切除的肿瘤样本直接移植到免疫缺陷小鼠体内而建立的，相较于传统的细胞系异种移植模型具有多项优势，代表了癌症研究领域的重要进展^1,2。PDX模型可通过连续传代进行维持和扩增，且在首代移植后肿瘤的遗传和生物学特性发生极少改变；与来源于人癌细胞系的异种移植模型相比，能更准确地反映肿瘤异质性^3-8。目前，这些模型被广泛用作癌症个体化治疗的研究平台^9,10、药物开发的临床前研究平台^6,11，以及癌症生物学研究的实验工具^4,12。

大多数PDX模型通过皮下植入和传代，可方便地使用游标卡尺随时间测量肿瘤的生长情况。然而，利用PDX模型模拟转移性疾病更具挑战性。对于乳腺癌而言，已有研究报道了能够向不同器官发生转移的异种移植模型。^3,5,13，但其自发扩散至转移部位的频率极低。在已有报道中，转移负荷的鉴定与定量依赖于死后对靶器官进行费时费力的组织学检查。在实验性乳腺癌脑、肺、骨和肝转移模型中，通常采用表达生物发光（荧光素酶，Luc）或荧光（绿色荧光蛋白，GFP）基因报告系统的癌细胞系，通过心内、尾静脉、股骨内或脾脏注射方式进行研究。^14-16尽管这些模型避开了原发性肿瘤的扩散过程，但它们对于研究器官趋向性和转移性定植机制具有重要价值。然而，源自患者原发肿瘤和PDX模型的细胞在使用标准方法时，转染或转导....

方案

本方案中所有涉及动物使用的步骤均遵循科罗拉多大学动物研究伦理委员会（IACUC）的指导原则。

1. 仪器、培养基及其他试剂的准备

1. 在无菌条件下配制 100 ml 乳腺球培养基，包含 DMEM/F12 培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基与 Ham's F-12 培养基，1:1 混合）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，20 ng/ml）、表皮生长因子（EGF，10 ng/ml）、肝素（4 µg/ml）、1× B27 添加剂、青霉素（100 U/ml）和链霉素（100 µg/ml）。在无菌条件下配制，4 °C 保存，最长可使用 3 个月。
2. 配制上皮细胞富集缓冲液（EEB），包含 pH 7.2 的 PBS、0.5% 牛血清白蛋白（BSA）和 2 mM EDTA。过滤除菌后，4 °C 保存，最长可使用 6 个月。
3. 将消化缓冲液以 5 ml 分装至无菌 15 ml 锥形管中，-20 °C 保存数月。在肿瘤消化前一晚，将消化缓冲液（每 500 mg 肿瘤使用 5 ml）置于冰上或 4 °C 冰箱中解冻。使用前加入 1× 抗生素-抗真菌素混合液。
4. 将至少两把镊子、手术刀和剪刀在 121 °C 下高压灭菌 30 分钟，用于 PDX 组织的解剖。
5. 配制 500 ml 洗涤缓冲液，包含 DMEM:F12 培养基和 5% 胎牛血清（FBS）。4 °C 保存数月。在肿瘤解剖当天，按每份肿瘤 10 ml 分装。
....

结果

该方法描述了使用高滴度慢病毒载体pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro和pHAGE-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W对PDX来源的解离乳腺癌细胞进行转导。这些载体表达荧光标记物，可用于评估转导效率 体外，早在感染后24小时即可观察到图1a）。对于大多数PDX，GFP的表达将在感染后延迟长达72小时图1b），此时通常可观察到细胞聚集体的形成。在富集人源癌细胞后，可实现转导（即， 使用 Lin+ 细胞耗竭法， 图1a）或在粗制PDX解离细胞中（图1b对于血管化程度较高的肿瘤，建议富集肿瘤上皮细胞，因为小鼠血细胞在活细胞总数中所占比例显著。

一旦转导效率得到验证 体外标记的细胞被收集后悬浮于细胞外基质中，并重新植入NSG小鼠体内。标记的肿瘤细.......

讨论

方案中的关键步骤：

高滴度慢病毒颗粒的使用（>10⁸ TU/ml）是本方案成功的关键步骤，因为它能够在培养过程中精确控制培养基的成分 体外 转导。尽管已有多种高滴度病毒颗粒的制备方法被详细描述^18,19；本方案使用按以下详细方法制备的慢病毒颗粒 www.kottonlab.com一种温和的肿瘤消化和癌细胞解离方法对于成功标记肿瘤及培养标记后的肿瘤至关重要。  延长消化时间超过三小时或将消化温度提高至37 °C可增加解离细胞数量，但会降低大多数肿瘤细胞的存活率及标记成功率。

修改与故障排除：

该方案应视为动态流程，需针对不同的患者来源异种移植瘤（PDX）在每一步骤中进行仔细监测并加以调整。尽管该标准方案对大多数异种移植肿瘤效果良好，但仍可能需要进行细微.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM/F12（1:1）	Hyclone	SH30023.01
bFGF	BD 生物科学	354060
EGF	BD 生物科学	354001
肝素	Sigma	H4784
B27	Gibco/Thermo Fisher	17504-44
抗真菌抗生素	Hyclone	SV30010
Accumax	创新细胞技术	AM-105-500	消化缓冲液
FBS	Atlanta Biologicals	S11550
HBSS 红色钙液2+/毫克2+ 自由	Hyclone	SH30031.02
Hepes
10x PBS	Hyclone	SH30258.01
Cultrex	Cultrex	3433-005-01	基底膜提取物（BME）
30 °C 摇床	新不伦瑞克科学公司	Series 25 恒温振荡培养箱
70 μm 滤光片	Falcon	7352350
手术刀	Fisher	22079690
氯己定消毒剂	Durvet	NDC# 30798-624-35
红细胞  细胞裂解试剂	Sigma	R7757
神经氨酸酶	Sigma	N7885-1UN
EpCAM（CD326+）微珠*	Miltenyi Biotec	130-061-101
小鼠谱系细胞耗竭试剂盒*	Miltenyi Biotec	130-090-858
MiniMACS 分离器	Miltenyi Biotec	130-042-102
Mini MACS 磁力架	Miltenyi Biotec	130-042-303
MS色谱柱	Miltenyi Biotec	130-042-201	可使用 MS 或 LS 型柱，根据细胞数量进行调整。
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