我们提出一种无需纯化即可鉴定脂肪酸的方案。该方法结合了三类脂肪酸衍生物的保留时间信息及其质谱数据，这三类衍生物分别为：脂肪酸甲酯（FAMEs）、4,4-二甲基噁唑啉衍生物（DMOX）和3-吡啶基甲醇酯（picolinyl）。
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摘要
摘要
Bacillus 属细菌含有支链和不饱和脂肪酸（FAs），其甲基支链（异构或前异构）及双键位置具有多样性。脂肪酸组成的变化在细菌适应环境过程中起着关键作用。这些修饰涉及异构与前异构支链脂肪酸比例的改变，以及不饱和脂肪酸相对于饱和脂肪酸比例的变化，且双键在特定位置形成。精确鉴定脂肪酸谱对于理解 Bacillus 属物种的适应机制至关重要。
许多来自芽孢杆菌属（Bacillus）的脂肪酸（FAs）尚未商业化供应。本文提出的方法通过结合保留时间信息（通过计算等效碳链长度（ECL））与三类脂肪酸衍生物的质谱数据，实现对脂肪酸的鉴定：脂肪酸甲酯（FAMEs）、4,4-二甲基恶唑啉衍生物（DMOX）以及3-吡啶基甲醇酯（picolinyl）。该方法无需对未知脂肪酸进行纯化即可完成鉴定。
将枯草芽孢杆菌（Bacillus cereus）制备的脂肪酸甲酯（FAME）色谱图谱与商业标准品混合物进行比较，可实现对直链饱和脂肪酸的鉴定、等效碳数（ECL）的计算，并对其他脂肪酸的种类作出推断。支链饱和脂肪酸（如异构或反异构型）的FAME相较于具有相同碳原子数的直链饱和脂肪酸，在ECL上表现出恒定的负向偏移。不饱和脂肪酸的FAME可通过其分子离子质量进行检测，其ECL相对于对应的饱和脂肪酸则呈现正向偏移。
通过分别分析吡啶基和DMOX衍生物的电子轰击电离质谱图，可以确定脂肪酸的支链位置以及不饱和脂肪酸双键的位置。该方法可鉴定出B. cereus提取物中所有未知的饱和支链脂肪酸、不饱和直链脂肪酸和不饱和支链脂肪酸。
引言
脂肪酸甲酯（FAME）气相色谱法（GC）是脂质表征的关键方法。在经过短暂提取步骤后，该方法可快速分离并定量样品中的各种脂肪酸（FA）。甲酯衍生物具有高挥发性、稳定性，并且对色谱柱呈惰性，从而避免了拖尾峰的出现。当样品由已知脂肪酸组成时，其鉴定过程较为直接，因为色谱图谱已有发表或可与标准品进行比对。此外，由于各类脂肪酸对火焰离子化检测器（FID）的响应几乎恒定，因此无需重复进样校准标准品即可实现定量1。
除了火焰离子化检测（FID）外，质谱（MS）检测可提供一组互补信息以确认脂肪酸甲酯（FAMEs）。然而，当采用电子轰击电离（EI）对FAMEs进行电离时，所得质谱图并不总能用于鉴定脂肪酸的精细结构。例如，支链位置（即， 支链甲基难以预测，因为诊断离子难以检测1 且目标离子丰度的特征变化依赖于仪器，导致无法使用质谱库2另一个挑战在于确定双键的位置，因为电子轰击电离（EI）会导致双键迁移。因此，双键位置不同的脂肪酸异构体无法通过其质谱图加以区分。幸运的是，目前已开发出其他用于脂肪酸鉴定的工具。例如，可通过计算等效碳链长度（ECL）来推断脂肪酸中支链或双键的存在及其位置。3.
其他衍生化方法会产生不同的质谱图，具体取决于双键或支链甲基的位置。4,4-二甲基噁唑啉衍生物（DMOX）4 可用于简便地确定单不饱和脂肪酸双键的位置。3-吡啶基甲醇酯（吡啶甲酯）衍生物则可明确鉴定甲基支链脂肪酸的位置5。结合色谱保留值（ECL）与质谱（DMOX 和吡啶甲酯）信息，可鉴定大多数脂肪酸，而无需采用核磁共振（NMR）谱所需的复杂纯化方法；核磁共振是结构表征的无可争议的方法1。
属于细菌属的 芽孢杆菌属，其中包含一些人类和动物病原体，能够定植于高度多样的生态位，因此在环境中广泛分布6. 其中包括 芽孢杆菌属 属，脂肪酸组成受物种生态位的影响，通过脂肪酸模式的调整以适应广泛的环境变化（例如培养基、温度、pH 等等。)7-9由于属内各物种的脂肪酸模式具有相对的一致性 芽孢杆菌属 在标准化条件下生长期间，脂肪酸组成测定是用于定义的若干关键标准之一 芽孢杆菌属 物种。一个独特的属性是 芽孢杆菌属 属的特征是含有12-17个碳的支链脂肪酸丰度较高10-12 其中异构体与反异构体的比例是适应环境条件的关键决定因素。 芽孢杆菌属 物种还通过改变不饱和脂肪酸的比例来适应环境波动。在某些物种中，例如 蜡样芽孢杆菌， 两种脂肪酸去饱和酶在烷基链的不同位置形成双键13 在适应过程中具有不同作用9示例 芽孢杆菌属 属的分析凸显了准确定位双键位置和脂肪酸支链结构的重要性。综上所述，脂肪酸的鉴定 芽孢杆菌属 FA 模式具有多种实用应用。本文中，我们提出一种新型的 GC-MS 方法用于 芽孢杆菌属 克服经典气相色谱-质谱分析固有局限性的脂肪酸图谱鉴定方法
这种创新方法可直接用于原始生物材料，结合了现有技术：不同脂肪酸衍生物（FAME、DMOX和吡啶基酯）的保留时间（ECL）信息和质谱数据。
我们采用以下脂肪酸命名法。i、a 和 n 分别表示异支链、前异支链和直链脂肪酸。不饱和脂肪酸以 C:d 表示，其中 C 代表脂肪酸中的碳原子数，d 代表双键数目。Δx 表示双键的位置，即从羧基端开始计数，位于第 x 个碳-碳键处。
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方案
1. 细菌培养
- 通过将100 µl在LB（Luria-Bertani培养基）中于30 °C培养过夜的细菌（Bacillus cereus菌株ATCC 14579）培养物均匀涂布于LB琼脂平板表面，制备细菌菌苔。将平板在30 °C下过夜培养。
2. ECL：等效碳链长度
- 按如下公式计算 ECL：
，其中：
i，为目标溶质；
n，为在目标溶质 i 之前洗脱的直链饱和脂肪酸甲酯的碳原子数；
n+1，为在目标溶质 i 之后洗脱的直链饱和脂肪酸甲酯的碳原子数；
Rti、Rtn、Rt(n+1)，分别为上述脂肪酸甲酯（FAME）峰的保留时间。
注意：通过进样直链饱和脂肪酸甲酯标准品混合物（BAME）获得其保留时间。
3. 脂肪酸甲酯的制备与分析
- 为获取脂质脂肪酸，用刮刀从琼脂平板上刮取菌落，收集40 mg（鲜重，相当于109个活菌细胞）细菌样品，转移至带有螺口盖和聚四氟乙烯（PTFE）密封垫的10 ml玻璃试管中。
- 采用如下所述的酯键法进行转酯化反应14,15。
- 向新鲜细菌细胞中加入5 ml含0.2 M KOH的甲醇溶液，于37 °C孵育1小时。该反应为碱性甲醇解反应，可断裂脂质中的酯键，生成脂肪酸甲酯。
- 加入1 ml 1 M乙酸以降低pH至7.0。使用pH试纸检测pH值。
- 加入3 ml正己烷以萃取脂肪酸甲酯（FAMEs）。
- 将上清液（有机相）转移至洁净试管中，在持续氮气流下室温蒸发浓缩，获得约200 µl提取物。将样品转移至带衬管的气相色谱小瓶中。
- 将提取物注入气相色谱-质谱联用（GC-MS）系统中进行分析。
4. 气相色谱/质谱条件
- 将FAME样品注入配备ZB-WAX毛细管柱（长度30 m，内径0.25 mm，膜厚0.25 µm）的气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）中。
- 将进样口设置为不分流模式，温度设为250 °C；以氦气为载气，线性流速为37 cm/sec。程序升温条件如下：柱温初始保持在50 °C，维持1 min，以20 °C/min的速率升至190 °C，再以2 °C/min的速率升至最终温度230 °C。
- 质谱检测采用电子轰击电离（EI）模式，电离能量为70 eV，全离子流扫描范围设定为50–400原子质量单位（amu），扫描速率为2次/秒。
- 如需分析，将DMOX和吡啶基衍生物在相同条件下进样，仅程序升温条件调整如下：
DMOX：50 °C（1 min），以20 °C/min升至210 °C，再以2 °C/min升至240 °C（保持5 min）；
吡啶基衍生物：60 °C（1 min），以20 °C/min升至220 °C，再以2 °C/min升至250 °C（保持20 min）。
5. 由FAME制备吡啶基酯16
- 用氮气流将第3部分的FAME提取物蒸发至干（至少含10 mg干物质），溶于1 ml无水二氯甲烷中。
- 配制 1.0 M 的氯化钾溶液 ter四氢呋喃中的叔丁醇钾
- 将FAME提取物和0.2 ml 3-吡啶甲醇加入0.1 ml步骤5.2中制备的溶液中。
- 加热溶液 40 °C 在密闭小瓶中孵育30分钟。
- 冷却至室温后，加入纯化去离子水（2 ml，参见 材料表）和正己烷（4 ml）。涡旋混合，静置分相，收集有机相。
- 加入无水硫酸钠直至有机相完全澄清，干燥。转移至洁净离心管中，随后蒸发至干。 200 µl将样品转移至带有内插管的气相色谱小瓶中。
6. 由脂肪酸甲酯制备DMOX衍生物17
- 用氮气流将第3节中的脂肪酸甲酯（FAME）提取物蒸发至干（至少含10 mg干物质）。
- 向FAME干提取物中加入250 mg的2-氨基-2-甲基-1-丙醇。用氮气吹扫容器，加盖密封后，置于190 °C加热块中过夜。
- 冷却至室温后，向试管中加入3 ml二氯甲烷和5 ml纯化去离子水（参见材料表）。
- 振荡以实现相分离，然后移除水相。
- 用5 ml水洗涤有机相。振荡以实现相分离，然后移除水相。
- 加入无水硫酸钠干燥有机相，直至其完全澄清，然后转移至洁净试管中。用氮气流吹干，浓缩至体积为200 µl。将样品转移至带内插管的GC小瓶中。
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结果
细菌细胞中脂肪酸鉴定的策略如图1所示。每个步骤提供互补的光谱信息或色谱保留信息。步骤1使用标准溶液进行脂肪酸的初步鉴定。步骤2通过解析脂肪酸甲酯（FAME）的电子轰击电离（EI）质谱及其等效链长（ECL），对产物进行初步鉴定。步骤3确定支链脂肪酸中支链的确切位置。最后，步骤4确定不饱和脂肪酸中双键的精确位置。
脂肪酸甲酯和电子碰撞电离
BAME混合物使我们能够鉴定出一系列直链饱和脂肪酸（n12至n17）以及一些甲基支链脂肪酸（i15、a15、i16、i17）。然而，在我们的样品中仅检测到极少数B. cereus特异性的脂肪酸，这说明了开发下述鉴定方法的必要性。
无论碳...
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讨论
表1中所示的脂肪酸（FAs）色谱图谱对应于在琼脂平板表面培养的B. cereus ATCC 14579。当该细菌在相同温度下于通气的液体培养基中培养时，也获得了相似的图谱8。对于在液体培养基中培养的细菌，可通过离心收集菌体生物量，并可根据既定的实验方案，依据不同的培养条件进行洗涤8,19。对B. cereus产生的各类脂肪酸进行鉴定，使得在某些对低温生长至关重要的基因发生突变的菌株中，脂肪酸比例的细微变化得以被检测到7,9。
通常，ECL 是根据在固定温度下（使用恒温控制的色谱柱 oven）测得的校正保留时间的对数值来计算的20。此处由于采用了非恒温 oven 以实现目标脂肪酸甲酯（FAME）的优化分离，所采用的计算方法为先前报道的线性保留指数计算方法3,21。
本研究的目的并非将计算得到的ECL值与文献中描述的数值进行比较，而是基于这些保留数据和光...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者感谢 Thomas Mison 提供的技术支持，以及 Rachel Kopec 对稿件的修改。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 气相色谱-质谱联用仪（GC/MS） | Shimadzu | QP2010 | |
| 毛细管色谱柱 ZB WAX | Phenomenex | 7HG-G007-11 | 30 m x 0.25 mm x 0.25 µm |
| 色谱纯甲醇（Methanol Lichrosolv） | VWR | 1.06018.2500 | |
| 氢氧化钾 | Aldrich | P1767 | |
| 四氢呋喃（THF） | Hipersolv Chromanorm | 28559.320 | |
| 二氯甲烷 | Hipersolv Chromanorm | 23373.320 | |
| 正己烷 | Hipersolv Chromanorm | 24575.320 | |
| 3-吡啶甲醇（3-pyridinemethanol） | Aldrich | P6-680-7 | |
| 叔丁醇钾 | Aldrich | 156671 | |
| 2-氨基-2-甲基-1-丙醇 | A-9879 | ||
| MilliQ Academic 超纯水系统 | Millipore | ZMQS50001 | |
| 细菌脂肪酸甲酯（BAME）混合标准品 | Sigma-Aldrich | 47080-U Supelco |
参考文献
- Christie, W. W., Han, X. Lipid Analysis 4th Edition. , Oily press. (2010).
- HÜbschmann, H. -J. Handbook of GC-MS: fundamental and application. Third edition. , Wiley-vch. (2015).
- Sasser, M. Identification of Bacteria by Gas Chromatography of Cellular Fatty Acids. MIDI Technical note. 101, 1-6 (1990).
- Spitzer, V. Structure analysis of fatty acids by gas chromatography - Low resolution electron impact mass spectrometry of their 4,4-dimethyloxazoline derivatives - A review. Prog Lipid Res. 35 (4), 387-408 (1996).
- Harvey, D. J. Advances in lipid methodology. Volume 1. Christie, W. W. , Oily press. Dundee. 19-80 (1992).
- Diomande, S. E., Nguyen-The, C., Guinebretière, M. -H., Broussolle, V., Brillard, J. Role of fatty acids in Bacillus environmental adaptation. Front Microbiol. 6, (2015).
- Brillard, J., et al. Identification of Bacillus cereus Genes Specifically Expressed during Growth at Low Temperatures. Appl Environ Microbiol. 76 (8), 2562-2573 (2010).
- de Sarrau, B., et al. Influence of Anaerobiosis and Low Temperature on Bacillus cereus Growth, Metabolism, and Membrane Properties. Appl Environ Microbiol. 78 (6), 1715-1723 (2012).
- Diomandé, S. E., et al. Involvement of the CasK/R two-component system in optimal unsaturation of the Bacillus cereus fatty acids during low-temperature growth. Int J Food Microbiol. 213, 110-117 (2015).
- Berkeley, R. C. W., Heyndrickx, M., Logan, N., De Vos, P. Applications and Systematics of Bacillus and Relatives. Berkeley, R. C. W. , Blackwell Science Publ. 1-7 (2002).
- Kämpfer, P. Limits and Possibilities of Total Fatty Acid Analysis for Classification and Identification of Bacillus Species. System. Appl. Microbiol. 17 (1), 86-98 (1994).
- Kaneda, T. Fatty-acids of genus bacillus - example of branched-chain preference. Bacteriol Rev. 41 (2), 391-418 (1977).
- Chazarreta Cifre, L., Alemany, M., de Mendoza, D., Altabe, S. Exploring the Biosynthesis of Unsaturated Fatty Acids in Bacillus cereus ATCC 14579 and Functional Characterization of Novel Acyl-Lipid Desaturases. Appl Environ Microbiol. 79 (20), 6271-6279 (2013).
- Sasser, M., et al. Identification of Bacillus anthracis from culture using gas chromatographic analysis of fatty acid methyl esters. J AOAC Int. 88 (1), 178-181 (2005).
- Schutter, M. E., Dick, R. P. Comparison of fatty acid methyl ester (FAME) methods for characterizing microbial communities. Soil Sci Soc Am J. 64 (5), 1659-1668 (2000).
- Destaillats, F., Angers, P. One-step methodology for the synthesis of FA picolinyl esters from intact lipids. J Am Oil Chem Soc. 79 (3), 253-256 (2002).
- Fay, L., Richli, U. Location of double-bonds in polyunsaturated fatty-acids by gas-chromatography mass-spectrometry after 4,4-dimethyloxazoline derivatization. J Chromatogr. 541 (1-2), 89-98 (1991).
- Zhang, J. Y., Yu, Q. T., Liu, B. N., Huang, Z. H. Chemical modification in mass spectrometry IV-2-alkenyl-4,4-dimethyloxazolines as derivatives for the double bond location of long-chain olefinic acids. Biol Mass Spect. 15 (1), 33-44 (1988).
- de Sarrau, B., et al. Unsaturated fatty acids from food and in the growth medium improve growth of Bacillus cereus under cold and anaerobic conditions. Food Microbiol. 36 (2), 113-122 (2013).
- Miwa, T. K., Mikolajczak, K. L., Earle, F. R., Wolff, I. A. Gas chromatographic characterization of fatty acids.Identification constants for mono- and dicarboxylic methyl esters. Anal Chem. 32 (13), 1739-1742 (1960).
- van Den Dool, H., Kratz, P. A generalization of the retention index system including linear temperature programmed gas-liquid partition chromatography. J Chromatogr A. 11, 463-471 (1963).
- Stransky, K., Jursik, T., Vitek, A. Standard equivalent chain length values of monoenic and polyenic (methylene interrupted) fatty acids. J High Res Chromatogr. 20 (3), 143-158 (1997).
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