我们提出一种无需纯化即可鉴定脂肪酸的方案。该方法结合了三类脂肪酸衍生物的保留时间信息及其质谱数据，这三类衍生物分别为：脂肪酸甲酯（FAMEs）、4,4-二甲基噁唑啉衍生物（DMOX）和3-吡啶基甲醇酯（picolinyl）。
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摘要
摘要
Bacillus 属细菌含有支链和不饱和脂肪酸（FAs），其甲基支链（异构或前异构）及双键位置具有多样性。脂肪酸组成的变化在细菌适应环境过程中起着关键作用。这些修饰涉及异构与前异构支链脂肪酸比例的改变，以及不饱和脂肪酸相对于饱和脂肪酸比例的变化，且双键在特定位置形成。精确鉴定脂肪酸谱对于理解 Bacillus 属物种的适应机制至关重要。
许多来自芽孢杆菌属（Bacillus）的脂肪酸（FAs）尚未商业化供应。本文提出的方法通过结合保留时间信息（通过计算等效碳链长度（ECL））与三类脂肪酸衍生物的质谱数据，实现对脂肪酸的鉴定：脂肪酸甲酯（FAMEs）、4,4-二甲基恶唑啉衍生物（DMOX）以及3-吡啶基甲醇酯（picolinyl）。该方法无需对未知脂肪酸进行纯化即可完成鉴定。
将枯草芽孢杆菌（Bacillus cereus）制备的脂肪酸甲酯（FAME）色谱图谱与商业标准品混合物进行比较，可实现对直链饱和脂肪酸的鉴定、等效碳数（ECL）的计算，并对其他脂肪酸的种类作出推断。支链饱和脂肪酸（如异构或反异构型）的FAME相较于具有相同碳原子数的直链饱和脂肪酸，在ECL上表现出恒定的负向偏移。不饱和脂肪酸的FAME可通过其分子离子质量进行检测，其ECL相对于对应的饱和脂肪酸则呈现正向偏移。
通过分别分析吡啶基和DMOX衍生物的电子轰击电离质谱图，可以确定脂肪酸的支链位置以及不饱和脂肪酸双键的位置。该方法可鉴定出B. cereus提取物中所有未知的饱和支链脂肪酸、不饱和直链脂肪酸和不饱和支链脂肪酸。
引言
脂肪酸甲酯（FAME）气相色谱法（GC）是脂质表征的关键方法。在经过短暂提取步骤后，该方法可快速分离并定量样品中的各种脂肪酸（FA）。甲酯衍生物具有高挥发性、稳定性，并且对色谱柱呈惰性，从而避免了拖尾峰的出现。当样品由已知脂肪酸组成时，其鉴定过程较为直接，因为色谱图谱已有发表或可与标准品进行比对。此外，由于各类脂肪酸对火焰离子化检测器（FID）的响应几乎恒定，因此无需重复进样校准标准品即可实现定量1。
除了火焰离子化检测（FID）外，质谱（MS）检测可提供一组互补信息以确认脂肪酸甲酯（FAMEs）。然而，当采用电子轰击电离（EI）对FAMEs进行电离时，所得质谱图并不总能用于鉴定脂肪酸的精细结构。例如，支链位置（即， 支链甲基难以预测，因为诊断离子难以检测1 且目标离子丰度的特征变化依赖于仪器，导致无法使用质谱库2另一个挑战在于确定双键的位置，因为电子轰击电离（EI）会导致双键迁移。因此，双键位置不同的脂肪酸异构体无法通过其质谱图加以区分。幸运的是，目前已开发出其他用于脂肪酸鉴定的工具。例如，可通过计算等效碳链长度（ECL）来推断脂肪酸中支链或双键的存在及其位置。3.
其他衍生化方法会产生不同的质谱图，具体取决于双键或支链甲基的位置。4,4-二甲基噁唑啉衍生物（DMOX）4 可用于简便地确定单不....
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方案
1. 细菌培养
- 通过将100 µl在LB（Luria-Bertani培养基）中于30 °C培养过夜的细菌（Bacillus cereus菌株ATCC 14579）培养物均匀涂布于LB琼脂平板表面，制备细菌菌苔。将平板在30 °C下过夜培养。
2. ECL：等效碳链长度
- 按如下公式计算 ECL：
，其中：
i，为目标溶质；
n，为在目标溶质 i 之前洗脱的直链饱和脂肪酸甲酯的碳原子数；
n+1，为在目标溶质 i 之后洗脱的直链饱和脂肪酸甲酯的碳原子数；
Rti、Rtn、Rt(n+1)，分别为上述脂肪酸甲酯（FAME）峰的保留时间。
注意：通过进样直链饱和脂肪酸甲酯标准品混合物（BAME）获得其保留时间。
3. 脂肪酸甲酯的制备与分析
- 为获取脂质脂肪酸，用刮刀从琼脂平板上刮取菌落，收集40 mg（鲜重，相当于10
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结果
细菌细胞中脂肪酸鉴定的策略如图1所示。每个步骤提供互补的光谱信息或色谱保留信息。步骤1使用标准溶液进行脂肪酸的初步鉴定。步骤2通过解析脂肪酸甲酯（FAME）的电子轰击电离（EI）质谱及其等效链长（ECL），对产物进行初步鉴定。步骤3确定支链脂肪酸中支链的确切位置。最后，步骤4确定不饱和脂肪酸中双键的精确位置。
脂肪酸甲酯和电子碰撞电离
BAME混合物使我们能够鉴定出一系列直链饱和脂肪酸（n12至n17）以及一些甲基支链脂肪酸（i15、a15、i16、i17）。然而，在我们的样品中仅检测到极少数B. cereus特异性的脂肪酸，这说明了开发下述鉴定方法的必要性。
无论碳.......
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讨论
表1中所示的脂肪酸（FAs）色谱图谱对应于在琼脂平板表面培养的B. cereus ATCC 14579。当该细菌在相同温度下于通气的液体培养基中培养时，也获得了相似的图谱8。对于在液体培养基中培养的细菌，可通过离心收集菌体生物量，并可根据既定的实验方案，依据不同的培养条件进行洗涤8,19。对B. cereus产生的各类脂肪酸进行鉴定，使得在某些对低温生长至关重要的基因发生突变的菌株中，脂肪酸比例的细微变化得以被检测到7,9。
通常，ECL 是根据在固定温度下（使用恒温控制的色谱柱 oven）测得的校正保留时间的对数值来计算的20。此处由于采用了非恒温 oven 以实现目标脂肪酸甲酯（FAME）的优化分离，所采用的计算方法为先前报道的线性保留指数计算方法3,21。
本研究的目的并非将计算得到的ECL值与文献中描述的数值进行比较，而是基于这些保留数据和光.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者感谢 Thomas Mison 提供的技术支持，以及 Rachel Kopec 对稿件的修改。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 气相色谱-质谱联用仪（GC/MS） | Shimadzu | QP2010 | |
| 毛细管色谱柱 ZB WAX | Phenomenex | 7HG-G007-11 | 30 m x 0.25 mm x 0.25 µm |
| 色谱纯甲醇（Methanol Lichrosolv） | VWR | 1.06018.2500 | |
| 氢氧化钾 | Aldrich | P1767 | |
| 四氢呋喃（THF） | Hipersolv Chromanorm | 28559.320 | |
| 二氯甲烷 | Hipersolv Chromanorm | 23373.320 | |
| 正己烷 | Hipersolv Chromanorm | 24575.320 | |
| 3-吡啶甲醇（3-pyridinemethanol） | Aldrich | P6-680-7 | |
| 叔丁醇钾 | Aldrich | 156671 | |
| 2-氨基-2-甲基-1-丙醇 | A-9879 | ||
| MilliQ Academic 超纯水系统 | Millipore | ZMQS50001 | |
| 细菌脂肪酸甲酯（BAME）混合标准品 | Sigma-Aldrich | 47080-U Supelco |
参考文献
- Christie, W. W., Han, X. Lipid Analysis 4th Edition. , Oily press. (2010).
- HÜbschmann, H. -J. Handbook of GC-MS: fundamental and application. Third edition. , Wiley-vch. (2015).
- Sasser, M.
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重印与许可
