Method Article

高分辨率呼​​吸测量，以评估线粒体功能的通透和完整细胞

DOI:

10.3791/54985

⸱

February 8th, 2017

 , 
1Department of Intensive Care Medicine, Inselspital, Bern University Hospital, University of Bern

In This Article

Summary

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高分辨率呼​​吸测量被用于确定线粒体耗氧量。这是一个简单的技术来确定线粒体呼吸链复合物'（I-IV）的呼吸率，最大线粒体电子传递系统容量，和线粒体外膜的完整性。

Abstract

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高分辨率氧合仪是一种用于测量生物样品（完整和透化细胞、组织或分离的线粒体）中细胞耗氧量的装置，具有非常高的分辨率和灵敏度。高分辨率氧合仪设备配备两个腔室，并使用极谱法氧传感器测量氧浓度并计算每个腔室内的耗氧量。使用软件计算耗氧率，并表示为每细胞数每秒皮摩尔。每个高分辨率氧合仪腔室都包含一个带进样口的塞子，这使其成为底物-解偶联剂-抑制剂滴定或去污剂滴定方案的理想选择，以确定质膜透化的有效和最佳浓度。该技术可用于测量多种细胞类型的呼吸，还提供有关线粒体质量和完整性以及最大线粒体呼吸电子传输系统能力的信息。

Introduction

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线粒体履行细胞能量代谢的重要作用，特别是通过使用氧气产生三磷酸腺苷（ATP）。它们被牵连的细胞死亡，并在多种人类疾病。线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）结合一起耗氧量和ATP合成的电子传输链电子传递。线粒体三羧酸（TCA）循环涉及的蛋白质，碳水化合物和脂肪转化为能量丰富化合物作为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FADH 2）。 （I至IV）位于线粒体内膜则NADH和FADH 2的电子被转移到呼吸电子传递链蛋白复合物。此外，另外两个氧化还原途径可以转移电子至电子传输链:ⅰ）线粒体电子转移黄素蛋白（ETF），其位于内线粒体的基质面从脂肪酸β氧化chondrial膜，和供给电子;及ii）线粒体甘油脱氢酶氧化甘油至磷酸二羟丙酮和线粒体电子传递链馈送电子。复合物IV（最终电子受体）的电子传送到一个氧分子，转换氧两份水分子。从呼吸电子传递链复合体I的电子的移动至IV是加上从线粒体基质以它建立跨线粒体内膜的电化学梯度的间空间质子流量。事后，线粒体复合物V（ATP合酶）穿梭氢离子放回线粒体基质并合成ATP分子。 OXPHOS函数可以在体内和体外使用各种技术和各种线粒体呼吸状态可以得到进行评估。在分离线粒体以下respiratoRY状态可测:ⅰ）基底线粒体呼吸（状态1）在加入线粒体呼吸链复合物的特异性底物的后，ⅱ）氧气量（状态2），ⅲ）最大线粒体耗氧量加入饱和浓度的后腺苷二磷酸（ADP）（状态3）和，ⅳ）ADP量（转化为ATP后搁置呼吸）（状态4）。....

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Protocol

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1.细胞培养

  1. 培养人肝癌HepG2细胞6 25厘米的Dulbecco含有10％热灭活的胎牛血清（FBS）和1％青霉素-链霉素，在37℃的恒温箱中（5％CO改良的Eagle培养基（DMEM）2细胞培养烧瓶2，95％空气）（接种密度:1×10每25 6个细胞cm 2的细胞培养瓶中，在37℃培养箱培养时间:48小时，在汇合的细胞密度:每25厘米4-5×10 6细胞2细胞培养瓶）。
  2. 当细胞是90％至95％汇合进行实验。

极谱氧传感器2.高分辨率呼​​吸测量校准

  1. 吸管2.1毫升呼吸缓冲成oxygraph室中，并在37℃下连续地使用存在于所述腔室（700转）磁性搅拌棒1小时，直到稳定的氧通量信号搅拌该缓冲得到极谱氧传感器。
    注:每个oxygraph室测量氧气浓度范围内极谱氧电极和各室中计算耗氧量（光通量）。氧浓度和耗氧速率（流量）正在使用的数据采集和分析软件显示实时在线在计算机中。
  2. 根据制造商的协议14执行极谱氧传感器的空气校准。
    注意:仅每天一次在早晨进行在空气饱和实验温度在呼吸介质和氧气浓度极谱氧传感器在介质的校准。事后媒体可从腔室并重新悬浮于新鲜的呼....

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Results

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最佳毛地黄皂苷含量的测定细胞透:毛地黄皂苷滴定实验

毛地黄皂苷滴定被执行以确定用于HepG2细胞透化的最佳浓度。对于这些实验，毛地黄皂苷是在完整细胞滴定在鱼藤酮，琥珀酸盐（线粒体复合物II衬底）和ADP的饱和量的存在下，和呼吸率在基线和之后每个测量（到复合体II依赖性状态3诱导）滴定（ 图1A和1B）。该实验的结果表明，在不存在毛地黄皂苷的，细胞呼吸很低，完整的，非透化的细胞的呼吸线粒体基板和ADP的存在是不刺激。然而，在逐步加入毛地黄皂苷的，蜂窝质膜透化和mitochondrial呼吸（复合体II依赖性状态3）增加至充分透时琥珀酸和ADP进入细胞。结果表明，透在8-12微米的毛地黄皂苷浓度是最佳的HepG2细胞的ADP刺激呼吸。然而，如果采用毛地黄皂苷过量线粒体外膜的完整性可受到损害。正如图1所示，毛地黄皂苷过量诱导复合物II依赖性状态3呼吸指示损害线粒体外.......

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Discussion

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本议定书的目标是利用高分辨率的呼吸测量，测量线粒体呼吸链复合物"（I-IV）呼吸频率，最大线粒体电子传递系统的容量和线粒体外膜的完整性。

还有，本协议中的一些关键步骤。第一，蜂窝式氧消耗率通常标准化为细胞数目（皮摩尔/ [细胞秒×号]）。因此，监测蜂窝氧消耗之前，重要的是使用的设备，使细胞的数目的精确和可靠的测量。在本协议的自动细胞计数器已使用（步骤材料的协议和表3.7）。第二个关键的一步，尤其是在渗透细胞，是呼吸缓冲区中透细胞悬浮（步骤协议的3.6）的选择。由于细胞通透性能诱导intracellula损失ř离子，这是很关键的是透过程中使用的培养基是与细胞内的环境相容。因此，呼吸缓冲器应包含的组合物和摩尔渗透压浓度反映两个细胞内和细胞外环境（ 表1）13。此外，对于最佳和有效的细胞透化，关键的是要滴定毛地黄皂苷浓度不仅对每种细胞类型，而且对于每个小区的密度，以确定其最佳的最低有效浓度。如果毛地黄皂苷浓度过低，则细胞不会被透化。与此相反，细胞对大量毛地黄皂苷的曝光会损伤线粒体外膜。因此，另一个重要的一点.......

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Disclosures

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作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

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这项研究得到了瑞士国家科学基金会 （Grant nº 32003B_127619） 的支持。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ADPSigmaA 4386化学
抗霉素 ASigmaA 8674化学试剂，溶于乙醇
抗坏血酸Merck1.00127化学
BSASigmaA 6003化学
FCCPSigmaC 2920化学试剂，溶于乙醇
Countess 自动细胞计数仪 Thermo Fisher Scientificn/a自动细胞计数仪
细胞色素 cSigmaC 7752化学
洋地黄皂苷SigmaD 5628化学试剂，溶于
DMSO DMEMGibco31966021培养基
EGTAfluka3779化学
FBSGibco26010-074培养基成分
谷氨酸SigmaG 1626化学
HepesSigmaH 7523化学
KCl默克1.04936化学
KH2PO< sub>4Merck1.04873化学
乳糖酸钾SigmaL 2398化学
MgCl2SigmaM 9272化学
O2k-Core：Oxygraph-2k Oroboros Instruments10000-02高分辨率呼吸测定仪
寡霉素SigmaO 4876化学试剂，溶于乙醇
青霉素-链霉素Gibco15140122化学
试剂 叠氮化钠SigmaS2002化学
鱼藤酮SigmaR 8875化学试剂，溶于乙醇
琥珀酸盐SigmaS 2378化学
牛磺酸SigmaT 8691化学
TMPDSigmaT 3134化学
胰蛋白酶SigmaT 4674化学
试剂 试剂 成分 试剂 试剂 试剂 试剂 试剂 试剂

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435 (2), 297-312 (2011).
  2. Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).
  3. Zhang, J., et al.

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High resolution RespirometryMitochondrial FunctionPermeabilized CellsIntact CellsOxygen ConsumptionSubstrate TitrationInhibitor TitrationDigitonin PermeabilizationMitochondrial IntegrityRespiratory Chain

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