高分辨率呼吸测定法评估透化细胞与完整细胞中的线粒体功能

摘要

高分辨率呼吸测定法用于测定线粒体的耗氧量。该方法是一种简单直接的技术，可用于测定线粒体呼吸链复合物（I-IV）的呼吸速率、线粒体电子传递系统最大容量以及线粒体外膜的完整性。

摘要

高分辨率氧电极仪是一种用于在封闭式系统中以极高分辨率和灵敏度测量生物样品（完整细胞、通透化细胞、组织或分离的线粒体）细胞耗氧量的装置。该高分辨率氧电极仪配备两个检测腔室，利用极谱式氧传感器测定每个腔室中的氧浓度，并计算耗氧量。耗氧速率通过软件计算，表示为每秒每细胞数量的皮摩尔数（pmol/s/细胞数）。每个高分辨率氧电极仪腔室均配有带注射口的密封塞，因此非常适用于底物-解偶联剂-抑制剂滴定实验，或用于确定细胞膜通透化所需有效及最佳浓度的去垢剂滴定方案。该技术可应用于多种细胞类型的呼吸作用测定，同时可提供有关线粒体质量与完整性以及线粒体呼吸电子传递系统最大呼吸能力的信息。

引言

线粒体在细胞能量代谢中发挥着重要作用，尤其是通过利用氧气生成三磷酸腺苷（ATP）。线粒体还参与细胞死亡过程，并与多种人类疾病相关。线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）将电子传递链上的电子传递、氧气消耗与ATP合成过程耦合在一起。线粒体三羧酸（TCA）循环参与将蛋白质、碳水化合物和脂肪转化为富含能量的化合物，如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FADH₂）。NADH和FADH₂中的电子随后被转移至位于线粒体内膜上的呼吸链电子传递蛋白复合物（I至IV）。此外，还有另外两条氧化还原途径可将电子传递至电子传递链：i）位于线粒体内膜基质侧的线粒体电子转移黄素蛋白（ETF），其提供来自脂肪酸β-氧化的电子；ii）线粒体甘油磷酸脱氢酶，该酶将甘油磷酸氧化为二羟丙酮磷酸，并将电子输入线粒体电子传递链。复合物IV（最终的电子受体）将电子传递给一个氧分子，将氧气转化为两分子水。电子从呼吸链复合物I向复合物IV的传递过程与质子从线粒体基质向膜间隙的转移相偶联，从而在线粒体内膜两侧建立起电化学梯度。随后，线粒体复合物V（ATP合酶）将氢离子重新转运回线粒体基质，并合成ATP分子。OXPHOS功能可通过多种技术在体内（in vivo）和体外（vitro）进行评估，并可获得不同的线粒体呼吸状态。在分离的线粒体中，可测定以下呼吸状态：i）基础线粒体呼吸（状态1）；ii）加入线粒体呼吸链复合物特异性底物后的耗氧量（状态2）；iii）加入饱和浓度的二磷酸腺苷（ADP）后....

方案

1. 细胞培养

1. 在37 °C、5% CO₂、95%空气的培养箱中，使用含10%热灭活胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），在25 cm²细胞培养瓶中培养人肝癌HepG2细胞⁶（接种密度：每25 cm²细胞培养瓶接种1 × 10⁶个细胞，37 °C培养箱中培养时间：48小时，汇合时细胞密度：每25 cm²细胞培养瓶4-5 × 10⁶个细胞）。
2. 当细胞融合度达到90%至95%时进行实验。

2. 极谱氧传感器的高分辨率呼吸测定校准

1. 用移液器将 2.1 ml 呼吸缓冲液加入氧电极测量室中，并在 37 °C 下使用测量室内磁力搅拌子持续搅拌（700 rpm）1 小时，直至极谱氧传感器获得稳定的氧通量信号。
   注意：每个氧电极测量室内的极谱氧电极用于测定氧浓度，并计算各测量室内的氧消耗量（通量）。氧浓度和氧消耗速率（通量）通过数据采集与分析软件在计算机上实时在线显示。
2. 根据制造商的操作规程对极谱氧传感器进行空气校准¹⁴。
   注意：呼吸介质中极谱氧传感器的校准以及实验温度下介质在空气饱和时的氧浓度测定，....

结果

细胞透化最适皂苷浓度的确定：皂苷滴定实验

通过毛地黄皂苷滴定实验确定HepG2细胞透化处理的最佳浓度。在本实验中，在存在鱼藤酮、琥珀酸（线粒体复合体II底物）以及饱和浓度ADP（以诱导复合体II依赖性的状态3呼吸）的条件下，对完整细胞进行毛地黄皂苷梯度滴定，并在基础状态及每次滴定后测定呼吸速率（图1A和图1B）。实验结果显示，在未添加毛地黄皂苷时，细胞呼吸水平极低，且完整未透化细胞在存在线粒体底物和ADP的情况下呼吸未被激活。然而，随着毛地黄皂苷逐步加入，细胞质膜被透化，线粒体呼吸（复合体II依赖性的状态3呼吸）随之增强，直至达到完全透化状态，此时琥珀酸和ADP可自由进入细胞。结果表明，8–12 µM毛地黄皂苷浓度下的透化处理对HepG2细胞的ADP刺激性呼吸最为理想。然而，若使用过量毛地黄皂苷，可能导致线粒体外膜完整性受损。如图1所示，过量毛地黄皂苷会导致.......

讨论

本方案的目的是利用高分辨率呼吸测定法测量线粒体呼吸链复合物（I-IV）的呼吸速率、线粒体电子传递系统最大容量以及线粒体外膜完整性。

本实验方案中存在若干关键步骤。首先，细胞耗氧率通常需根据细胞数量进行标准化（pmol/[sec × 细胞数量]）。因此，在监测细胞耗氧之前，使用一种能够准确且可靠地测定细胞数量的设备至关重要。在本方案中，采用了自动细胞计数仪（方案步骤3.7及材料表）。第二个关键步骤，尤其是在透化细胞实验中，是选择用于重悬透化细胞的呼吸缓冲液（方案步骤3.6）。由于细胞透化可能导致细胞内离子流失，因此在透化过程中所使用的介质必须与细胞内环境相容。因此，呼吸缓冲液的组成和渗透压应同时反映细胞内和细胞外环境（表1）¹³。此外，为了实现最佳且有效的细胞透化，必须针对每种细胞类型以及每种细胞密度滴定皂苷毒毛旋花素（digitonin）的浓度，以确定其最佳且最低的有效浓度。若digitonin浓度过低，则细胞无法被充分透化；相反，若细胞暴露于过量的digitonin中，则会损伤线粒体外膜。因此，另一.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ADP	Sigma	A 4386	化学试剂
抗霉素A	Sigma	A 8674	化学试剂，溶于乙醇
抗坏血酸	Merck	1.00127	化学试剂
牛血清白蛋白	Sigma	A 6003	化学试剂
FCCP	Sigma	C 2920	化学试剂，溶于乙醇
Countess 自动细胞计数仪	Thermo Fisher Scientific	n/a	自动细胞计数仪器
细胞色素c	Sigma	C 7752	化学试剂
皂苷	Sigma	D 5628	化学试剂，溶于DMSO
DMEM	Gibco	31966021	培养基
EGTA	fluka	3779	化学试剂
胎牛血清	Gibco	26010-074	培养基组分
谷氨酸	Sigma	G 1626	化学试剂
HEPES	Sigma	H 7523	化学试剂
KCl	Merck	1.04936	化学试剂
KH2PO4	Merck	1.04873	化学试剂
乳酸钾	Sigma	L 2398	化学试剂
MgCl2	Sigma	M 9272	化学试剂
O2k-Core: Oxygraph-2k	Oroboros Instruments	10000-02	高分辨率呼吸测量仪
寡霉素	Sigma	O 4876	化学试剂，溶于乙醇
青霉素-链霉素	Gibco	15140122	化学试剂
叠氮化钠	Sigma	S2002	化学试剂
鱼藤酮	Sigma	R 8875	化学试剂，溶于乙醇
琥珀酸	Sigma	S 2378	化学试剂
牛磺酸	Sigma	T 8691	化学试剂
TMPD	Sigma	T 3134	化学试剂
胰蛋白酶	Sigma	T 4674	化学试剂