通过瞬时转染293T细胞生产复制缺陷型逆转录病毒

摘要

该技术展示了一种高效制备编码人癌基因的复制缺陷型逆转录病毒储备液的方法，并可用于在小鼠模型中诱导骨髓增殖性疾病。

摘要

我们的实验室研究由癌基因（如 Bcr-Abl 或生长因子受体来源的癌基因 ZNF198-FGFR1、Bcr-PDGFRα 等）诱导的人类骨髓增殖性疾病。通过将先前感染了表达特定癌基因的逆转录病毒的小鼠骨髓细胞移植到小鼠模型中，我们能够在小鼠体内模拟并研究类似人类的疾病。通过瞬时转染 293T 细胞（一种由腺病毒 E1A 基因产物转化的人肾上皮细胞系）的方案，可产生携带人类癌基因及标记基因（如 GFP、RFP 或抗生素抗性基因等）的复制缺陷型逆转录病毒。293 细胞具有一种独特的高转染特性，可通过磷酸钙（CaPO₄）法实现高达 50–80% 的转染效率。在此过程中，我们将表达目标癌基因的逆转录病毒载体与表达 gag-pol-env 包装功能的质粒（例如单基因组包装构建体 kat 或 pCL，本实验中使用 EcoPak 质粒）共同转染至 293 细胞中。初始转染效率可通过添加氯喹进一步提高。转染后 48 小时收集的培养上清液即为嗜鼠病毒原液，可储存于 -80°C，用于细胞系的转化和体外研究，或用于感染小鼠骨髓等原代细胞，随后将这些细胞用于小鼠模型的移植实验。

方案

1. 转化前一天晚上，将293T细胞以3-5×10⁵个细胞/皿的密度接种于培养皿中。⁶ 细胞/6 cm 组织培养板
   
   注意：我们使用293T细胞，因为其转染操作简便，并且作为病毒生产细胞具有高效性。这些细胞在缺乏辅助质粒的情况下，无法有效包装病毒。
   
   
2. 第一天早晨，轻柔吸除培养基，更换为含25 mM氯喹的4 ml 293T细胞培养基，放入培养箱孵育1小时。
   
   注意：培养板应达到约80%汇合度。
   
   
3. 同时，每次在5 ml离心管中为2块培养板制备病毒制备混合液：
   1. 2 x 10 mg 逆转录病毒质粒构建体
   2. 2 x 5 mg 包装结构（EcoPak）
   3. 2 × 62 ml CaCl
   4. 用无菌 ddH₂O 定容至 1 ml₂O
      
      注意：逆转录病毒质粒编码目的癌基因和标记基因，EcoPak 编码 gag-pol-env。与 293T 细胞共同作用时，将产生一种特异性感染小鼠细胞的嗜鼠逆转录病毒（RV），但不能感染人类细胞。氯喹和 CaCl₂₂ 已被证明可提高转染效率。
      
      
4. 向混合物中逐滴加入1 ml 2x无菌HBS，同时轻轻涡旋振荡试管。
5. 立即向2个培养皿中分别加入1 ml该溶液，轻轻逐滴加入。
6. 放入培养箱孵育7至11小时。
7. 傍晚（7至11小时后），轻柔地吸出培养基，并非常轻柔地更换为5 ml新鲜的293T培养基。放入培养箱中，至次日中午。
   
   注意：此步骤非常重要，因为需要去除细胞中的氯喹。如果长时间保留，氯喹具有毒性。由于转染混合物形成极细微的粉尘状沉淀，培养板中的溶液看起来有些浑浊。
   
   
   注意：由于细胞已被氯喹致敏，容易从培养板上脱落，因此更换培养基时务必格外轻柔。
   
   
8. 次日，在收集病毒前18至24小时（约中午时分），轻柔吸除培养基，非常轻柔地更换为3 ml新鲜的293T培养基，放回培养箱中过夜培养。
9. 第三天早晨（18至24小时后），使用配有18号针头的10 ml注射器轻轻吸出培养板中的培养基。此上清液含有逆转录病毒。
10. 更换针头为45 mm注射器滤器，倒置注射器数次以充分混匀溶液，将上清液通过滤器过滤，分装至冻存管中
    
    注意：或者，如果你正在制备3个或以上的病毒板，将相同病毒的所有上清液收集到一个50 ml 圆底管中。充分混匀，然后通过过滤将含有逆转录病毒的上清液分装至冻存管中。
    
    
11. 含有病毒上清液的管子保存在 -80°C 冰箱中，直至使用。

讨论

确保优质病毒储备液成功的四个关键点：
   

1. 293T 生产细胞必须非常健康，即需定期传代，从未过度生长，并以每 6 cm 组织培养皿 350 万至 500 万个细胞的优化密度接种，使其在转染当天早晨达到培养皿 80% 的密度。 
   
2. 添加氯喹可通过稳定细胞溶酶体并增加到达细胞核的 DNA 比例，使转染效率和后续病毒滴度提高约 3 至 5 倍。也可使用丁酸钠（另一种溶酶体稳定剂）达到此目的。氯喹可以省略，此时转染后 7 至 11 小时无需更换培养基。
   
3. DNA 质量至关重要。载体和包装质粒 DNA 的最佳纯化方法是经氯化铯-溴化乙锭梯度密度离心法纯化两次。我们希望 DNA 浓度至少达到 1 mg/ml，OD 260/280 比值应在 1.75–1.90 之间。Qiagen 纯化的 DNA 也可使用，但在作者的操作中，效果略差。需注意 DNA 溶液的总体积应较小（< 每最终毫升总体积 50 µl），以避免 Tris 和 EDTA（TE 缓冲液）对磷酸钙沉淀产生不利影响。
   
4. 逆转录病毒载体的选择以及包装结...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
293T 细胞	细胞系			每 3 天以 1:3 至 1:4 的比例传代一次，否则细胞在重新接种时容易发生聚团，转染效率也会降低。
293T 细胞培养基				DMEM/高糖 + 10% FBS + 1% 青霉素-链霉素 + 1% L-谷氨酰胺（1% 非必需氨基酸，可选）。我们的组织培养试剂购自 CellGro。
编码 DNA 质粒				经 CsCl 两次纯化。使用 MSCV 骨架，编码目的癌基因及筛选标记（如 Neo、GFP 等）。
EcoPak				又称 pMCV-Ecopac：嗜同性包装质粒，编码 gag-pol-env。
2x HBS				配制 500 ml：8.0 g NaCl + 0.37 g KCl + 106.5 mg Na2HPO4（无水；若为七水合物则为 201.1 mg）+ 1.0 g 右旋糖（D-葡萄糖）+ 5.0 g HEPES 粉末。溶于 450 ml 去离子水（milli-Q 水），用 NaOH 调节 pH 至 7.05，再加去离子水定容至 500 ml。经 0.45 μ 滤膜无菌过滤。室温保存，瓶盖需拧紧。
2M CaCl2		Sigma-Aldrich
milliQ H2O				经无菌过滤
氯喹				1000 倍储存液为 25 mM，溶于不含 Ca²⁺/Mg²⁺ 的 PBS 中，-20°C 保存。使用时新鲜加入培养基。
6 cm 培养皿				用于组织培养
培养箱				用于组织培养。设定为 37°C、10% CO₂。
10 cc 无菌注射器				无菌。每种病毒各用一支。
18G 针头				一次性使用，每种病毒各用一支。
45 μm 注射器滤器
5 ml 塑料离心管				无菌，用于混合转染溶液，每次最多处理 2 个培养皿（2 ml）。我们使用 Falcon 管。
50 ml 锥形离心管
冻存管				2 ml 和 4 ml，用于分装病毒。
转染所用的所有试剂必须经无菌过滤（CaCl2、2x HBS、milliQ H2O），并保持无菌状态。