ADSC片移植预防食管大面积内镜下黏膜剥离术后狭窄

摘要

本研究报道了一种在猪模型中通过内镜进行脂肪组织来源的基质细胞（ADSC）片移植以预防广泛内镜黏膜下剥离术（ESD）后食管狭窄的成功方法。

摘要

近年来，细胞片构建物在再生医学领域引起了广泛关注，尤其适用于重建外科手术。将脂肪组织来源的基质细胞（ADSCs）与多种生物材料结合的多样化技术的发展，已成功构建出多种组织工程替代物，例如由啮齿类、猪或人源ADSCs衍生的骨、软骨和脂肪组织。广泛的食管内镜黏膜下剥离术（ESD）是导致食管狭窄形成的主要原因。预防狭窄仍具挑战性，目前尚无有效的治疗方法。既往研究报道了在犬模型及人体中进行黏膜细胞片移植的有效性。ADSCs具有抗炎特性、局部免疫调节作用、促进新生血管形成的能力，并可分化为间充质及非间充质谱系。本项原创性研究描述了一种在猪模型中通过内镜移植ADSC组织工程构建物以预防食管狭窄的方法。该ADSC构建物由两层异体ADSC细胞片叠加组成，并置于纸质支撑膜上。ADSCs用PKH67荧光染料标记，以便通过探头式共聚焦激光内镜显微镜（pCLE）进行监测。在移植当天，实施一段5 cm长且呈半周径范围的ESD操作，该操作已知可诱发食管狭窄。随后立即通过内镜将4个ADSC构建物移植至动物体内。经轻柔贴敷10分钟后，ADSC构建物实现完全黏附。所有动物均成功完成移植。移植后第3天通过pCLE评估确认移植成功。与移植组动物相比，对照组动物出现了严重的狭窄，伴有显著的纤维化组织增生、更频繁的进食困难以及体重增长减缓。在本模型中，于广泛ESD术后移植以双层细胞片形式组织的异体ADSCs是可行的，并且与显著降低的食管狭窄发生率密切相关。

引言

随着新型内镜技术的发展，浅表性食管肿瘤的治疗方式已发生改变。目前，内镜下切除术已成为一线治疗方法。事实上，与外科手术相比，该方法具有更低的并发症发生率和死亡率，同时肿瘤学疗效相当^1,2,3。内镜下黏膜切除术（EMR）和内镜下黏膜下剥离术（ESD）是目前应用最广泛的两种技术。对于范围较广的浅表性肿瘤，通常优先选择 ESD。与 EMR 相比，ESD 能够实现无论病灶大小和形状如何的整块切除（en bloc resection）^4,5,6。ESD 术后主要的迟发性并发症是食管狭窄的形成，通常发生在切除术后一至两周内。近期发表的研究表明，狭窄的形成与切除范围的大小相关。日本内镜学会建议避免实施切除范围超过食管周径 ¾ 的 ESD，因为此类操作在超过 90% 的病例中会导致狭窄形成，并引发严重的进食困难以及生活质量的显著下降。

预防食管狭窄仍然具有挑战性。目前对狭窄形成所涉及的机制仅部分明确。狭窄的形成似乎源于两种不同机制的共同作用：（1）促炎性细胞的募集；（2）过度纤维化的发生⁷。已有多种预防性治疗方案被提出，但效果不尽如人意，疗效有限且伴随严重不良反应^8,9。近期，日本Ohki et al.团队提出将自体口腔黏膜细胞的单层细胞片移植至食管瘢痕处，且在内镜黏膜下剥离术（ESD）后立即进行移植^10,11。该团队首先在犬类模型中，随后在患者中验证了这一创新方法的有效性。

脂肪组织来源的基质细胞（ADSCs）在再生医学中具有广阔的应用前景。其在多个领域的应用已显示出令人关注的效果，尤其是在伤口愈合过程中。ADSC治疗具有多种优势，因为这些细胞易于分离，且具有抗炎特性、局部免疫调节作用、促进新生血管形成的能力，以及向间充质和非间充质谱系分化的潜能^12,13,14。

在之前的一项研究中，我们的团队在猪模型中证明了双层脂肪来源间充质干细胞片内镜移植在预防广泛内镜黏膜下剥离术后食管狭窄方面的有效性¹⁵。本文将报道脂肪来源间充质干细胞片的构建及内镜下移植技术。

方案

所有动物的处理均遵循动物研究伦理委员会（法国农业部指南）的规定。该实验方案已获得巴黎笛卡尔大学（法国巴黎巴黎笛卡尔医学院，注册编号MESR 2035.02）授权的当地伦理委员会批准。

1. ADSC 培养与标记

1. 从私人机构获取经确认的脂肪源性间充质干细胞（ADSCs）。在37 °C和5% CO₂条件下，使用含10%胎牛血清和1%抗生素（青霉素和链霉素）的α最低必需培养基培养同种异体ADSCs。
2. 通过标准细胞扩增程序（37 °C和5% CO₂），每只动物获取约24 × 10⁶个ADSCs。使用标准胰酶溶液（T150培养皿使用10 mL）收集ADSCs，并用血细胞计数板进行细胞计数。
3. 在移植前一天使用下述PKH67染色法进行细胞标记。
   注意：染色程序的目的是便于移植后对细胞进行追踪。
   1. 为标记2 × 10⁶个ADSCs，配制溶液A（2 × 10⁶个细胞与100 µL稀释液C混合）和溶液B（4 µL PKH67与1 mL稀释液C混合）。
   2. 将溶液A和溶液B孵育2分钟，然后加入100 µL胎牛血清孵育1分钟。
   3. 用300 µL柠檬酸盐RPMI溶液（298.5 µL RPMI和1.5 µL柠檬酸）洗涤，并在1,500 × g下离心5分钟。重复此操作2次。将标记后的细胞保存并避光，直至进行膜片构建。

2. 双层ADSC片状结构

1. 移植前一天，使用上述细胞培养基，每孔加入4 mL，预先准备12孔温度响应性细胞培养皿，并在PKH标记前将1.5 × 10⁶个PKH标记的细胞接种至每孔中，于37 °C、5% CO₂条件下培养12小时。
2. 移植当天，将培养皿置于室温下孵育30分钟，使融合的细胞片自然脱离。
3. 用移液器轻柔吸取一张ADSC细胞片，将其转移至一张疏水性纸片（直径1.5 cm）上，以此纸片作为支撑膜。
4. 夹取另一张ADSC细胞片，轻柔地叠加在前一张细胞片之上，形成双层结构。
5. 重复上述操作，制备所需数量的ADSC细胞片构建体（每只动物4个）。

3. 食管内镜黏膜下剥离术（ESD）

1. 移植当天，先以 10 mg/kg 剂量的肌内注射氯胺酮对动物进行预处理，再以 8 mg/kg 剂量的静脉注射丙泊酚诱导麻醉。随后行气管插管，并通过吸入 2.5% 异氟烷维持麻醉状态。
2. 动物进入全身麻醉状态后，使用胃镜、视频内镜和电外科设备进行内镜黏膜下剥离术（ESD）。
   1. 使用内镜刀配合软性凝固模式，在距门齿 40 cm 至 45 cm 处的背侧黏膜进行半周环形标记。
   2. 向黏膜下层注射含靛胭脂染料的甘油溶液，以分离黏膜层与肌层。
   3. 采用内镜刀并设置为 endocut I 模式，完成环周切开。
   4. 使用内镜刀并切换至强制凝固模式，从近端切口向远端切口方向进行黏膜下层剥离。
3. ESD 手术结束时，可观察到一处暴露肌层、长度为 5 cm 的半周环形食管瘢痕。

4. 内镜下移植

1. 内镜黏膜下剥离术（ESD）后立即通过内镜将4个双层ADSC片状结构移植到动物体内。
   1. 使用内镜钳夹住一个ADSC片状结构，并在运送至创面部位时，用一个较大的透明内镜帽进行保护。
   2. 将ADSC片状结构的整个表面贴附于溃疡创面床。
   3. 轻柔地压敷ADSC片状结构10分钟，以实现完整且稳定的移植。操作时可使用内镜钳或内镜帽，将ADSC片状结构的整个表面均匀贴附于食管黏膜下层。
2. 每只动物重复此操作四次，以实现四个移植并牢固黏附的双层细胞片状结构。
   注：目标是覆盖约一半的损伤区域。

5. 术后评估与随访

1. 每只动物在ESD术后需进行镇痛处理，第一天起每日三次肌肉注射吗啡0.2 mg/kg，并持续28天使用埃索美拉唑（40 mg/天）进行抗酸治疗。术后使用阿莫西林（1 g/天）进行为期7天的抗生素预防。术后第1天允许摄入液体，次日可摄入固体食物。
2. 对动物进行为期28天的随访，每日进行临床评估，采用Mellow Pinkas吞咽困难评分¹⁶并记录体重变化。
3. 多模态狭窄评估：在预定的第3、14和28天，在全身麻醉下进行多模态狭窄发生评估。
   1. 通过内镜评估瘢痕情况、测量狭窄程度并检测纸基支撑膜的存在。使用胃镜通过狭窄部位以测量狭窄程度（胃镜直径为8 mm）。观察瘢痕，注意其炎症表现（黏膜充血、黏膜水肿及黏膜自发性出血），并判断瘢痕内是否存在纸基支撑膜。
   2. 将pCLE绿色探头经胃镜操作通道直接置入瘢痕床，寻找与PKH67标记的ADSC片层结构移植相一致的自发性且有序的绿色信号。
   3. 采用钡剂食管造影，在放射学环下进行两个正交投照位（前后位和左侧位）。保留最狭窄的投照位用于狭窄评估（狭窄程度（%）= [1－（狭窄处短轴长度／狭窄处正常轴长度）× 100]）^17,18。
4. 动物安乐死。
   1. 在第28天随访期结束时实施动物安乐死。动物仍处于全身麻醉状态下，静脉注射苯巴比妥100 mg/kg。通过临床检查确认心跳和呼吸运动消失，以确保动物死亡。
   2. 行胸骨切开并暴露器官后，取出每只安乐死动物的食管组织（以10%中性缓冲福尔马林固定，石蜡包埋，切片厚度为4 µm）。切片采用苏木精-沙弗兰染色¹⁵，数字化切片用于计算机分析，并对各动物组进行比较¹⁵。

结果

ADSCs 的培养及 ADSC 片的制备过程如图所示 图1. 图2 显示移植物的构建过程，该移植物由两层ADSC细胞片在滤纸支撑膜上相互叠加而成。ADSCs先前已用PKH67荧光染料标记，以实现后续追踪 体内 使用pCLE进行移植物监测 图3 展示了食管内镜下黏膜下剥离术的各个步骤，最终形成一条5厘米长的半周性食管瘢痕。 图4 展示了内镜下移植手术过程。所有动物在轻柔操作10分钟后均成功完成移植。 图5 显示第3天pCLE评估呈阳性，证实移植手术成功。

随访期允许进行多模态的狭窄分析。不同的评估结果如以下图示和表格所示。与对照组动物相比，移植组动物在第28天时消化道问题发生频率更低，体重增加更明显。移植组中有一只动物出现严重的食管狭窄，而对照组所有动物均未出现类似情况...

讨论

在此猪模型中，ADSC片移植在技术上是成功的，且 体内 pCLE评估可用于监测细胞植入情况。临床、内镜、影像学和组织学评估均证实，内镜下ADSC片在预防广泛ESD术后食管狭窄方面具有有效性。

含有靛胭脂染料的脂肪来源间充质干细胞（ADSC）甘油溶液的内镜下移植是再生医学中的一种创新方法。Ohki et al. 首次描述了该内镜移植操作。在他们的研究中，细胞片结构由口腔黏膜上皮细胞片层叠于聚偏二氟乙烯（PVDF）薄膜上构成，后者作为支撑膜使用^10,11,19。通过内镜钳夹持支撑膜，并将其小心地放置于溃疡创面。经轻柔按压10分钟后，细胞片即可实现黏附。该操作尚未被其他研究团队成功复现。在本研究中，出于多种考虑采用了双层ADSC细胞片结构进行移植。选择ADSC的原因在于多项研究已证实其具有抗炎能力，尤其在皮肤修复过程中表现显著。已知ADSC可调节角质形成细胞与成纤维细...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
透明内窥镜帽 Q180 兼容型	Olympus Optical Co
GIF-Q180 胃镜	Olympus Optical Co
Exera II 视频内镜系统	Olympus Optical Co
18 G 注射针	Olympus Optical Co
ERBE ICC 350 电外科工作站	ERBE Technology
1% 吲哚菁蓝	Life
内镜混合刀	Life
Minisonde Z pCLE 绿色探头	Mauna Kea Technology		您必须学习如何使用该探头，操作可能较为困难。
胎牛血清	Sigma Aldrich	12105C
胰蛋白酶	Sigma Aldrich	T146
α 最低必需培养基	Thermo Fisher	22561-021
磷酸盐缓冲液	Thermo Fisher	10010-023
PKH67 荧光染料试剂盒	Sigma Aldrich	Mini67-KT
12 孔温敏细胞培养皿	Upcell Thermo Scientific	174900	接种细胞前 30 分钟，每孔加入 4 mL 标准培养基
埃索美拉唑 40 mg	Biogaran
硫酸吗啡 50 mg/mL	Lavoisier
阿莫西林 1 g	Biogaran
氯胺酮 250 mg/5 mL	Panpharma
丙泊酚 10 mg/mL	Fresenius
疏水纸	Carrefour