爪蟾卵母:显微注射方法优化，滤泡细胞层的去除，并在电生理实验快速变化的解决方案

Summary

描述了

描述了非洲爪蟾卵母细胞中分离单个卵泡、细胞质 RNA 显微注射、去除周围细胞层和蛋白质表达的优化程序。此外，还提出了一种在电生理实验中使用配体门控离子通道快速更换溶液的简单方法。

Abstract

非洲爪蟾卵母细胞作为异源表达系统用于蛋白质，首先由Gurdon 等人所述。 ¹并已发现以来被广泛使用（参考文献2 - 3，和其中的参考文献）。这使得外国通道表达卵母细胞有吸引力的一个特点是内生的离子通道⁴的丰度差。这种表达系统已被证明对于许多蛋白质，其中配体门控离子通道的特征是有用的。

GABA _A受体在爪蟾卵母细胞和其功能特性的表达被这里描述，包括卵母细胞，用的cRNA，去除滤泡细胞层，并在电生理实验快溶液变更显微注射的隔离。的过程被在这个实验室^5,6-优化，从常规使用^7-9的那些偏离。传统上，裸卵准备用在RT延长胶原酶处理卵巢裂片的，并且这些裸露的卵母细胞显微注射用的mRNA。采用优化方法，多元膜蛋白已表达并研究了该系统中，如重组GABA _A受体^10-12，人重组氯通道^13，锥虫钾通道^14，和一个肌醇转运^15,16。

这里详细描述的方法可以应用于在爪蟾卵母选择的任何蛋白质的表达，并迅速解变化可以用来研究其它配体门控离子通道。

Introduction

爪蟾卵母被广泛用作表达系统（参考文献2 - 3，和其中的参考文献）。它们能够正确地组装和整合功能活性多亚基蛋白到其质膜。使用该系统，有可能在功能调查膜蛋白单独使用或与其它蛋白质组合，为了研究突变，嵌合的，或连接在一起的蛋白质的性质，以及筛选潜在药物。

使用的卵母细胞比其它异源表达系统的优点包括巨细胞的简单处理，表达外源遗传信息，卵母细胞的环境的通过浴灌注装置的简单的控制的细胞的比例高，和膜电位的控制。

该表达系统的缺点是在许多实验室^17-20中观察到的季节变化。这样做的原因变异目前尚不清楚。此外，卵母细胞的质量经常观察到强烈变化。传统方法^7-9包括卵巢瓣的隔离，卵巢瓣的暴露于胶原酶一些小时，裸露的卵母细胞的选择，以及卵母细胞注射。在这里，一些替代方案，快速程序报道，使我们能够用这个表达系统工作超过30年，在卵母细胞质量无季节变化和变化不大。

此处描述了用于卵母细胞的分离，微注射用的cRNA，并除去滤泡细胞层的改性，改进的方法，可用于选择的任何蛋白在非洲爪蟾卵母细胞中的表达。周围的卵母细胞的培养基中快速解的变化非常简单的方法可以应用于任何配体门控离子通道和载流子的的研究。

Protocol

动物实验已通过了伯尔尼州Kantonstierarzt的地方委员会，KantonalerVeterinärdienst伯尔尼（BE85 / 15）。

1. 爪蟾卵母的制备

1. 保持在12小时/ 12小时光照/黑暗中水的循环是严格保持在20℃，蛙（ 爪蟾 ）。
2. 从雌蛙⁹取出卵巢的叶。
   注意:凸起的除去是用于再生的刺激，并经常在卵母细胞的质量与手术改善。卵母细胞被卵黄层，卵泡细胞的层，并且含有血管²¹结缔组织覆盖。整个结构被称为"毛囊"。
3. 放置被密集用含有无菌巴特的盐^7（MBS）的卵母细胞补充有青霉素和链霉素（88毫摩尔NaCl，1mM的氯化钾，2.4毫毛囊卵巢的裂片的NaHCO _3，0.82毫_硫酸镁 ，0.41毫_氯化钙 ，0.33毫米的Ca（NO _3）2，10毫4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸; HEPES（pH值7.5，氢氧化钠），100微克/毫升青霉素和100微克/ mL链霉素）。
4. 单出阶段V-VI ²¹卵泡。握住钳子卵巢叶。降低铂环（ 图1）在卵泡并轻轻撤回循环扰乱含有从卵巢组织卵泡结缔组织。
   注:第五阶段^-Ⅵ21卵泡的特征在于它们的尺寸（1.0 - 1.2毫米直径），并通过暗着色动物半球和淡黄色植物性半球之间的良好的对比度。
5. 通过塑料巴斯德吸管（切回1.5mm的开口直径）的装置仅传送看起来健康的卵泡（ 即完美的球形，并用完整的色素沉着）到35毫米直径的培养皿。

2。 mRNA的显微注射进入细胞质

注:此处描述的显微注射系统是从由Kressmann和Birnstiel ^22日报道的。

1. 准备从相应的cDNA 通过体外转录_A受体，增加了一个多聚（A ^+）尾和RNA定量的用凝胶电泳²³编码的_α4β2δGABA的亚基的cRNA。
2. 从使用微量牵拉硼硅玻璃毛细管（1.0外径（OD），0.58内径（ID），100毫米长）制备显微注射移液器。断的玻璃毛细管的尖端使用显微和微丝创建12的顶端直径，在显微镜下 - 15微米与斜尖。
3. 回填用10毫升的注射器石蜡油显微注射吸管，然后装入显微注射吸管到一个自制的MICRoinjection装置（ 图2）。
   注:自制液压油喷射装置包括一个脚踏开关控制烧烤电机。一个附加的开关改变马达的转动模式。该电机驱动的推进或缩回10μL玻璃注射器的柱塞螺旋测微计（0.5毫米/转）。注射是在约3 rpm的速度和0.5转弯对应于50 NL注射到毛囊。注射器的前端连接到本身由非常短的一块Tygon管的连接到注射针厚壁聚四氟乙烯管材。加样毛细管是由一个由显微控制的钻夹头保持。整个系统充满了石蜡油。任何气泡应该避免，因为它们会损害喷射系统。设置点亮了冷光源。立体显微镜需要光学控制。卵泡在冷光可视化与stereomicroscope需要（40X放大倍率）。注射设定的性能由注射放射性示踪剂进入爪蟾卵母测试。 45卷 - 55 NL应该每次注射交付。
4. 使用移液管，用无菌塑料尖端，通过将无菌水滴到耐湿热塑性（2×2厘米）的清洁内部测试设置。沉浸注射吸管到该液滴的前端，然后转动电机缩回柱塞（注射吸管内部负压力）。
   注:水应该进入吸管和形成与油中的可视界面。
5. 退离液滴的吸管尖和施加正压到注射移液管的内部。水滴应该形成在注射吸管尖。
6. 粘到PE的底部:通过衬里它们与植物性磁极在尼龙网的空隙（0.8毫米G）的朝上准备毛囊的喷射三菜（60 MM）覆盖着MBS。
7. 使用移液管，用无菌塑料尖端到热塑性的清洁内部分配mRNA的2微升。通过施加负压到注射移液管的内部取的mRNA向上进入注射针。
8. 注射针在使用显微单个毛囊的位置。
9. 插入注射针进入植物极的中心与通过施加正压力，以移液管的内部注入mRNA的50 NL以0.6微升/分钟的流速。从毛囊取出注射枪头，以避免逃跑的mRNA前10秒 - 等待5。
   注:基因应注入的植物（淡黄）极，以避免注射到细胞核中，它位于在动物半球。
10. 传输所注入的毛囊填充有2毫升的MBS的新的培养皿（35毫米）。放置盘成酒冷却器设定为18℃。孵育1注入的卵泡 -记录前7天，这取决于新表达的蛋白的身份。

3.卵泡剥离（图3）

注:如上所述，由卵黄层，卵泡细胞，结缔组织，其中包含血管²⁴所覆盖的卵母细胞，被称为"毛囊"。除了卵黄层，它提供机械稳定性不妨碍到细胞表面的解决方案的进入所有的层，必须电生理实验之前被移除。周围无细胞层卵泡先前已称为"洁净"卵母细胞^25。此步骤通常在同一天的电生理实验进行。

1. 转移10注入卵泡到含有0.5毫升的MBS，1毫克/毫升胶原酶和0.1mg / ml胰蛋白酶抑制剂的硼硅玻璃管。浸入管保持在36℃水浴。孵育20分钟卵泡和动摇管偶尔。
2. 通过将它们转移到含有1毫升的MBS在RT第二管冲洗卵泡。让他们在管约10秒。
3. 转移卵泡到包含含有4mM乙二醇双（2-氨基乙醚）加倍浓缩的MBS 0.5mL的第三管- N，N，N'，N'-四乙酸（EGTA），并孵育他们在4分钟RT。偶尔摇管。
   注:高渗溶液（加倍浓缩MBS）用于诱导卵泡细胞层内的卵母细胞，从而分离从卵母细胞滤泡细胞层的收缩率加入EGTA以抑制胶原酶活性。
4. 通过将它们转移到含有1毫升的MBS在RT第二管冲洗卵泡。让他们在管约10秒。
5. 转移的卵母细胞，以含2毫升的MBS培养皿（35毫米直径）。在立体显微镜，通过分开毛囊外封套简单地推裸卵母细胞离开使用铂环。
   注:卵母细胞的外信封牢牢粘在培养皿，并可以从卵母细胞容易地分离。有些卵母细胞会自发地失去他们的外封套，将被回收裸卵。此过程导致用于保存的卵母细胞的球形外观相对稳定的制剂。

周围的卵母细胞4.快速变化的解决方案

1. 进行电压钳实验中，如所描述^9,26。
2. 通过根据需要由试验转动灌注开关改变重力供给灌注系统的解决方案。
   1. 用玻璃毛细管1.35毫米，口，其中放置约0.4mm从卵母细胞表面的内径施加在6毫升/分钟的灌注溶液，以允许围绕卵母细胞的激动剂浓度的快速变化。
      注意:变化率一直此前估计ð在小于0.5秒²⁷的70％。

Results

爪蟾卵母细胞进行机械挑出使用铂环（ 图1）。的卵母细胞显微注射用的mRNA编码GABA _A受体亚单位_{α4，β2，δ，0.5:0.5:2.5}飞摩尔/卵母细胞（ 图2）。后4天，滤泡细胞层除去（ 图3）。卵母细胞电压钳制在-80毫伏和暴露于1μM的3α，21-二羟基5α孕-20-酮（THDOC），一种有效的正变构调节剂的存在增加γ氨基丁酸（GABA）的浓度GABA _A受体。 图4A示出记录在这样一个实验原始电流痕迹。 图4B示出了根据不同的GABA的浓度引起电流幅度。这允许这个亚基朝向GABA组合的灵敏度的测定。的单个曲线分别安装和标准化I _MAX，随后取平均值。使用的方程为一 （c）= I _最大 /（1+...

Discussion

在这篇文章中描述的方法，从那些传统使用的^7-9偏离。它是标准的对卵巢的裂片暴露于1至2小时胶原酶处理^8;隔离损坏，裸卵;与使用商业注射装置的mRNA注入它们。此经典程序具有以下缺点:1）卵母细胞很可能是由长曝光于高浓度的胶原酶被损坏。 2）不稳定裸露的卵母细胞必须被存储，直到实验。 3）裸卵更有可能比注射过程中的卵泡挨。商业喷射设备使用大直径（约20微米）注射针，可能造成损坏的相对高的速率。这里描述的改进的过程的优点如下:暴露于胶原酶限于20分钟，裸露的卵母细胞不必被存储，并且所述移液器的小尖端直径 - 用于microinjecti（约12 15微米）上不需要事先毛囊为与mRNA注射的"defolliculation"。单个关键步骤是，在胶原酶溶液卵泡培养温度应仔细调整到36℃，并应不超过它。

在电生理实验溶液的变化，经常在测量室中的溶液被改变，这需要的大量时间，这取决于该腔室的尺寸和灌注速度。使用避免了这种灌注毛细管。

离子通道的爪蟾卵母中表达的主要缺点是它们的巨...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma	71380
KCl	Sigma	P-9541
NaHCO3	Sigma	S6014
MgSO4	Sigma	M-1880
CaCl2	Sigma	223560
Ca（NO3）2	Sigma	C1396
HEPES	Sigma	H3375
青霉素/链霉素	Gibco	15140-148	100 μg 青霉素/mL 和 100 μg 链霉素/mL
铂线环	自制
微量移液器拉拔器	Zeitz-Instruments GmBH	DMZ
汉密尔顿注射器	汉密尔顿	80300	10 μL型， 701N
型厚壁聚四氟乙烯管	Labmarket GmBH		外径 1.0 mm
石蜡油	Sigma	18512
尼龙网，G： 0.8 mm	ZBF Zü更丰富的 Beuteltuchfabrik AG
硼硅酸盐玻璃管	康宁	99445-12	PYREX
胶原酶 NB 标准级	SERVA	17454
胰蛋白酶抑制剂 I-S	型 Sigma	T-9003
EGTA	Sigma	E3389
玻璃毛细管	Jencons （Scientific ） LTD.	H15/10	1.35 内径 mm（用于灌注），替代公司：Harvard Apparatus Limited
硼硅酸盐玻璃毛细管	Harvard Apparatus Limited	30-0019	1.0 外径 x  0.58 内径 x 100 长度 mm（用于显微注射）
硼硅酸盐玻璃毛细管	哈佛仪器有限公司	30-0044	1.2 外径 x 0.69 内径 x 100 长度毫米（用于两电极电压夹）
&γ;-氨基丁酸 （GABA）	Sigma	A2129
3&α;，21-二羟基-5&α;-孕聚糖-20-酮 （THDOC）	Sigma	P2016
烧烤电机	Faulhaber		直流微电机 2230 型，带齿轮 22/2 型
千分尺 螺钉	Kiener-Wittlin	10400	TESA， AR 02.11201
无菌塑料移液管	Saint-Amand  Mfg.	222-20 秒