Xenopus 卵母细胞：显微注射、去除滤泡细胞层以及电生理实验中快速溶液更换的优化方法

摘要

本文描述了分离单个卵泡、细胞质RNA显微注射、去除周围细胞层以及在Xenopus卵母细胞中进行蛋白质表达的优化步骤。此外，还介绍了一种在配体门控离子通道的电生理实验中快速更换溶液的简便方法。

摘要

Xenopus 卵母细胞作为一种异源蛋白表达系统，最早由 Gurdon et al.¹ 描述，自发现以来已被广泛使用（参考文献2 - 3及其中引用的文献）。该系统适用于外源离子通道表达的一个特点是其内源性离子通道表达水平极低⁴。该表达系统已被证实可用于多种蛋白质的表征，其中包括配体门控离子通道。

本文描述了在Xenopus卵母细胞中表达GABA_A受体并对其进行功能表征的方法，包括卵母细胞的分离、cRNA显微注射、滤泡细胞层的去除，以及电生理实验中的快速溶液置换。这些实验步骤已在本实验室进行了优化^5,6，与常规使用的方法有所不同^7-9。传统方法通常是在室温下用胶原酶长时间处理卵巢叶以获得去膜卵母细胞，随后对其进行mRNA显微注射。采用优化后的方法，已利用该系统成功表达并研究了多种膜蛋白，例如重组GABA_A受体^10-12、人源重组氯离子通道¹³、锥虫钾离子通道¹⁴以及一种myo-肌醇转运蛋白^{15, 16}。

本文所述方法可用于在Xenopus卵母细胞中表达任意目标蛋白，且快速溶液置换技术可用于研究其他配体门控离子通道。

引言

Xenopus 卵母细胞被广泛用作表达系统（参考文献 2 - 3 及其中引用的文献）。它们能够正确组装并将具有功能活性的多亚基蛋白整合到细胞质膜中。利用该系统，可对膜蛋白单独或与其他蛋白联合进行功能研究，以分析突变型、嵌合型或串联蛋白的特性，并可用于潜在药物的筛选。

与其它异源表达系统相比，使用卵母细胞的优势包括易于操作巨大的细胞、表达外源遗传信息的细胞比例高、通过浴式灌流简单地控制卵母细胞的环境，以及对膜电位的控制。

该表达系统的缺点是在许多实验室中观察到的季节性变化^17-20。这种变化的原因尚不明确。此外，卵母细胞的质量也常表现出显著波动。传统方法^7-9包括分离卵巢叶、将卵巢叶暴露于胶原酶中数小时、挑选去颗粒细胞的卵母细胞以及进行卵母细胞显微注射。本文报道了若干替代性的快速操作流程，使我们能够在此表达系统上持续工作超过30年，且未出现季节性变化，卵母细胞质量的差异也极小。

本文所述的卵母细胞分离、cRNA 显微注射以及滤泡细胞层去除的改进方法，可用于在 Xenopus 卵母细胞中表达任何目标蛋白。这种对卵母细胞周围培养液进行快速更换的极为简便的方法，可应用于任何配体门控离子通道及载体蛋白的研究。

方案

动物实验已获得伯尔尼州地方委员会伯尔尼州兽医局（Kantonaler Veterinärdienst Bern）的批准（批准号：BE85/15）。

1. 准备 非洲爪蟾 卵母细胞

1. 将非洲爪蟾（Xenopus laevis）饲养在严格保持20 °C的水中，维持12小时光照/12小时黑暗的光照周期。
2. 从雌性青蛙中取出卵巢叶⁹。
   注意：卵巢叶的切除是一种再生刺激，且手术后卵母细胞的质量通常会有所提高。卵母细胞被卵黄膜、一层滤泡细胞以及含有血管的结缔组织所包裹²¹。整个结构称为"滤泡"。
3. 将富含含有卵母细胞的滤泡的卵巢叶置于无菌 Barth生理盐水（MBS）中⁷（含青霉素和链霉素的改良溶液：88 mM NaCl、1 mM KCl、2.4 mM NaHCO₃、0.82 mM MgSO₄、0.41 mM CaCl₂、0.33 mM Ca(NO₃)₂、10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES），用NaOH调节pH至 7.5，并添加100 µg/mL青霉素和100 µg/mL链霉素）。
4. 分离V-VI期²¹的滤泡。用镊子夹住卵巢叶，将铂金环（图1）置于滤泡上方，然后轻轻提起铂金环，以破坏将滤泡与卵巢组织相连的结缔组织。
   注意：V-VI期²¹滤泡的特征是其大小（直径1.0–1.2 mm）以及深色色素化的动物极与淡黄色的植物极之间具有良好的对比度。
5. 仅使用塑料巴斯德移液管（将管口后端剪至开口直径约1.5 mm）将外观健康的滤泡（即 形态完美呈球形且色素完整）转移至直径为35 mm的培养皿中。

2. 将 mRNA 微注射到细胞质中

注意：此处描述的显微注射系统源自 Kressmann 和 Birnstiel²² 报道的方法。

1. 从编码α亚基的相应cDNA制备cRNA₄β₂δ GABA_A 受体通过 体外 转录，添加poly (A⁺尾部，以及通过凝胶电泳进行RNA定量²³.
2. 使用显微拉针仪，从硼硅酸盐玻璃毛细管（外径（OD）1.0 mm，内径（ID）0.58 mm，长度100 mm）制备显微注射针。在显微镜下使用显微操作器和微细丝断裂玻璃毛细管尖端，制成斜面尖端，直径为12 – 15 µm。
3. 使用10 mL注射器用石蜡油回填显微注射移液管，然后将显微注射移液管安装到自制的显微注射装置上（图2).
   注意：自制的油压注射装置由一个通过脚踏开关控制的齿轮马达组成。另一个开关用于改变马达的旋转方向。该马达驱动一个千分尺螺杆（每转0.5 mm），推动或回撤10 µL玻璃注射器的活塞。注射速度约为每分钟3转，半圈（0.5转）对应向卵泡内注射50 nL液体。注射器尖端连接至厚壁聚四氟乙烯管，后者再通过一段极短的泰龙（Tygon）管连接至注射针头。注射毛细管由钻夹头固定，夹头由显微操作器控制。整个系统充满石蜡油，应避免任何气泡，因为气泡会干扰注射系统的正常运行。装置使用冷光源照明，需配备体视显微镜进行光学观察。在冷光源下使用体视显微镜（40倍放大）观察卵泡。通过向卵泡内注射放射性示踪剂来测试注射装置的性能 非洲爪蟾 卵母细胞。每次注射应递送45 - 55 nL的体积。
4. 使用带有无菌塑料吸头的移液器，将一滴无菌水滴加到防潮热塑性材料（2 cm × 2 cm）洁净的内表面，以测试装置。将注射移液器的尖端浸入该液滴中，然后转动电机使活塞回缩（注射移液器内部产生负压）。
   注意：水应进入移液管，并与油形成可见的界面。
5. 将移液管尖端从液滴中抽出，并对注射移液管内部施加正压。此时注射移液管尖端应形成一个水滴。
6. 在直径为60 mm的培养皿底部粘贴孔径为0.8 mm的尼龙网，并在其中加入MBS溶液，将卵泡按植物极朝上的方向排列于尼龙网的孔隙中，以准备注射。
7. 使用带有无菌塑料吸头的移液器，将2 µL mRNA滴加到热塑性材料的洁净内表面。通过向注射移液管内部施加负压，将mRNA吸入注射移液管中。
8. 使用显微操作仪将注射毛细管置于单个卵泡上方。
9. 将注射针插入植物极中心，通过向移液管内施加正压，以0.6 µL/min的流速注入50 nL的mRNA。注射完成后，等待5–10秒再将注射针尖从卵泡中移出，以避免mRNA外泄。
   注意：应将 mRNA 注射到植物极（黄色区域），以避免注入位于动物半球的细胞核。
10. 将已注射的卵泡转移至一个新的培养皿（35 mm）中，内含2 mL MBS。将培养皿置于设定为18 °C的葡萄酒冷却器中。根据新表达蛋白的种类，将注射后的卵泡孵育1–7天后再进行记录。

3. 毛囊剥离（图3）

注意：如上所述，被卵黄膜、滤泡细胞和含有血管的结缔组织包裹的卵母细胞²⁴，被称为“"滤泡"”。在进行电生理实验之前，必须去除除卵黄膜以外的所有外层结构；卵黄膜可提供机械稳定性，同时不影响溶液接触细胞表面。此前已将去除周围细胞层后的滤泡称为“"去滤泡细胞"”卵母细胞²⁵。该步骤通常在进行电生理实验的当天完成。

1. 将十个已注射的卵泡转移至含有0.5 mL MBS、1 mg/mL 胶原酶和0.1 mg/mL 胰蛋白酶抑制剂的硼硅酸盐玻璃管中。将试管浸入维持在36 °C的水浴中，孵育卵泡20分钟，并偶尔摇动试管。
2. 将卵泡转移至另一含有1 mL室温MBS的试管中进行清洗，静置约10秒。
3. 将卵泡转移至第三个含有0.5 mL双倍浓度MBS并添加4 mM乙二醇双(2-氨基乙基醚)N,N,N',N'-四乙酸（EGTA）的试管中，在室温下孵育4分钟，期间偶尔摇动试管。
   注意：高渗溶液（双倍浓度MBS）用于诱导卵泡细胞层内的卵母细胞收缩，从而使其与卵母细胞分离；添加EGTA以抑制胶原酶活性。
4. 将卵泡转移至另一含有1 mL室温MBS的试管中进行清洗，静置约10秒。
5. 将卵母细胞转移至一个含有2 mL MBS的培养皿（直径35 mm）中。在体视显微镜下，用铂金环轻轻推动裸露的卵母细胞，使其与外层包膜分离。
   注意：卵母细胞的外层包膜会牢固地粘附在培养皿上，因而可轻松与卵母细胞分离。部分卵母细胞会自发失去其外层包膜，从而以去颗粒细胞卵母细胞的形式被回收。该操作可获得形态保持球形、相对稳定的卵母细胞样本。

4. 卵母细胞周围溶液的快速更换

1. 进行电压钳实验，具体方法如文献^9,26所述。
2. 根据实验需要，通过切换重力驱动灌流系统的灌流开关来更换灌流液。
   1. 使用内径为1.35 mm的玻璃毛细管，以6 mL/min的速度施加灌流液，将毛细管口置于卵母细胞表面约0.4 mm处，以实现卵母细胞周围激动剂浓度的快速更换。
      注意：此前估计浓度更换速率在0.5秒内可达70%以上²⁷。

结果

Xenopus 卵母细胞使用铂金环进行机械分离（图 1）。将编码 GABA_A 受体亚基 α₄、β₂、δ 的 mRNA 以 0.5:0.5:2.5 fmol/卵母细胞的比例显微注射至卵母细胞中（图 2）。注射后 4 天，去除卵泡细胞层（图 3）。将卵母细胞在 -80 mV 膜电位下进行电压钳制，并在存在 1 µM 3α,21-二羟基-5α-孕烷-20-酮（THDOC，一种强效的 GABA_A 受体正向别构调节剂）的条件下，暴露于浓度递增的 γ-氨基丁酸（GABA）中。图 4A 显示了此类实验中记录的原始电流轨迹。图 4B 显示了诱发电流幅度随 GABA 浓度变化的关系。由此可确定该亚基组合对 GABA 的敏感性。各条曲线经拟合并标准化至 I_max 后进行平均。所用方...

讨论

本文所述方法与传统方法^7-9有所不同。传统方法通常将卵巢小叶暴露于胶原酶中处理1至2小时⁸，分离出完整且去滤泡细胞的卵母细胞，再使用商用注射装置注入mRNA。该经典流程存在以下缺点：1）卵母细胞因长时间暴露于高浓度胶原酶中而容易受损；2）去滤泡细胞后的卵母细胞在实验前需储存，稳定性差；3）与卵泡相比，去滤泡细胞的卵母细胞在显微注射过程中更易受损。此外，商用注射装置所用的注射针直径较大（约20 µm），可能导致较高的细胞损伤率。本文所述改进方法具有以下优势：胶原酶处理时间缩短至20分钟，无需储存去滤泡细胞的卵母细胞，且显微注射所用移液管的尖端直径较小（约12–15 µm），在进行mRNA注射时无需预先对卵泡进行"去滤泡"处理。其中唯一关键步骤是：卵泡在胶原酶溶液中的孵育温度必须精确调节至36 °C，且不得超出此温度。

在电生理实验中进行溶液更换时，通常需要更换测量室中的溶液，这一过程耗时较长，具体时间取决于测量室的大小和灌流速率。使用灌流毛细管可避免这一问题。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NaCl	Sigma	71380
KCl	Sigma	P-9541
NaHCO₃3	Sigma	S6014
MgSO₄4	Sigma	M-1880
CaCl2	Sigma	223560
Ca(NO3)2	Sigma	C1396
HEPES	Sigma	H3375
青霉素/链霉素	Gibco	15140-148	100 μg 青霉素/mL 和 100 μg 链霉素/mL
铂金丝环	自制
微移液管拉制仪	Zeitz-Instruments GmBH	非军事区
哈密顿注射器	Hamilton	80300	10 μL，701N 型
厚壁聚四氟乙烯管	Labmarket GmBH		1.0 mm 外径
石蜡油	Sigma	18512
尼龙网，孔径：0.8 mm	ZBF Züricher Beuteltuchfabrik AG
硼硅酸盐玻璃管	康宁	99445-12	PYREX
胶原酶 NB 标准级	SERVA	17454
胰蛋白酶抑制剂 I-S 型	Sigma	T-9003
EGTA	Sigma	E3389
玻璃毛细管	Jencons (Scientific) LTD.	H15/10	1.35 ID mm（用于灌注），替代公司：Harvard Apparatus Limited
硼硅酸盐玻璃毛细管	哈佛仪器有限公司	30-0019	1.0 OD x  0.58 ID × 100 长度 mm（用于显微注射）
硼硅酸盐玻璃毛细管	哈佛仪器有限公司	30-0044	1.2 OD × 0.69 ID × 100 长度 mm（用于双电极电压钳）
γγ-氨基丁酸（GABA）	Sigma	A2129
3α,21-二羟基-5α-孕烷-20-酮（THDOC）	Sigma	P2016
烤架电机	Faulhaber		DC 微型电机 Type 2230，配齿轮箱 Type 22/2
千分尺螺杆	Kiener-Wittlin	10400	TESA, AR 02.11201
无菌塑料移液管	Saint-Amand  制造	222-20S