需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

右旋糖酐提高小鼠和人原代NK细胞的慢病毒转导效率

11.2K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/55063

⸱

2018年1月15日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Immunology and Immunotherapy, Blood Research Institute, The Blood Center of Wisconsin, 2Vector Core Lab, Blood Research Institute, The Blood Center of Wisconsin, 3Laboratory of Lymphocyte Biology, Blood Research Institute, The Blood Center of Wisconsin, 4Laboratory of Stem Cell Transcriptional Regulation, Blood Research Institute, The Blood Center of Wisconsin, 5Department of Microbiology and Immunology, The Medical College of Wisconsin, 6Department of Pediatrics, The Medical College of Wisconsin, 7Department of Medicine, The Medical College of Wisconsin

本文内容

摘要

本研究的目的是开发能够成功实现原代自然杀伤（NK）细胞基因转导的技术。通过葡聚糖介导的慢病毒转导方法，可实现人或小鼠原代NK细胞的高效基因表达。该基因转导方法将极大改善NK细胞的遗传操作效果。

摘要

将特定基因高效转导至自然杀伤（NK）细胞一直是一个重大挑战。成功的基因转导对于明确目的基因在NK细胞发育、分化及功能中的作用至关重要。近年来，嵌合抗原受体（CARs）在癌症免疫治疗中的进展进一步凸显了建立一种高效方法以将外源基因递送至效应淋巴细胞的迫切需求。目前，慢病毒介导的基因转导在人或小鼠原代NK细胞中的效率仍然显著偏低，这是主要的限制因素。近期研究表明，使用聚凝胺等阳离子聚合物可提高T细胞的基因转导效率。然而，这些试剂未能改善NK细胞的转导效率。本研究显示，右旋糖酐（一种支链葡聚糖多糖）可显著提高人和小鼠原代NK细胞的转导效率。这一高度可重复的转导方法为转导人原代NK细胞提供了有效工具，有望极大提升临床基因递送应用，从而推动基于NK细胞的癌症免疫治疗。

引言

自然杀伤（NK）细胞是先天免疫系统中的主要淋巴细胞群体1。NK细胞在宿主免疫应答中发挥着对抗肿瘤和感染的第一道防线作用2,3,4。NK细胞还通过分泌强效的细胞因子和趋化因子，在耐受性形成过程中发挥核心作用5。由于其靶向并清除肿瘤细胞的强大能力，目前正在进行多项临床试验，以评估供体来源的人NK细胞作为癌症过继性免疫治疗的应用潜力6,7。与T细胞相比，NK细胞的发育生物学尚未被充分阐明8。这一知识的缺乏部分原因在于缺乏能够高效将目的基因导入小鼠或人原代NK细胞的技术。因此，大多数NK细胞研究均在细胞系中进行，而非在原代细胞中开展。因此，建立一种可靠且高效的原代NK细胞转导目的基因的实验方案至关重要。

本研究的总体目标是建立一种稳定且可靠的方法，用于将原代人或小鼠自然杀伤（NK）细胞通过慢病毒或逆转录病毒进行转导。

早期为解决这一问题而开展的研究主要采用原代NK细胞的瞬时转染方法，包括质粒转染9,10、EB病毒（Epstein-Barr Virus, EBV）/逆转录病毒杂合载体11、痘苗病毒载体12,13以及Ad5/F35嵌合型腺病毒载体14。尽管这些技术具有一定的转导效率，但由于其转导效果为瞬时性，因而不适用于基因修饰NK细胞的长期应用。少数近期研究采用逆转录病毒载体转导NK细胞，但需多次感染循环才能达到可接受的基因表达水平11,15。与逆转录病毒载体不同，慢病毒载体可利用宿主细胞的核输入机制，将病毒前整合复合物转运至细胞核内。这一特性克服了病毒在非分裂细胞（包括原代NK细胞）中复制的主要限制因素。

不同细胞表面受体与病毒颗粒之间的相互作用介导了病毒进入细胞的过程。由于病毒包膜蛋白与其相应的宿主受体之间可能存在负电荷排斥，初始结合可能受到限制。许多转导技术的原理在于，添加阳离子聚合物（如多聚素B（Pb）、硫酸鱼精蛋白（PS）或葡聚糖）可使细胞表面受体带正电荷，从而增强病毒包膜蛋白的结合能力。这将提高病毒颗粒与细胞的融合效率及摄取率16。尽管已有报道表明，Pb或PS可在T细胞中提高基因转导效率17，但其在原代自然杀伤（NK）细胞转导效率方面并未显示出作用。此外，目前尚未针对这些试剂在原代NK细胞中的应用进行过比较分析。本研究比较了三种阳离子聚合物的转导效率。结果显示，在这三种阳离子聚合物中，只有葡聚糖能显著提高病毒对小鼠和人原代NK细胞的转导效率。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有动物实验方案均遵循动物人道与伦理处理原则，并经威斯康星医学院（MCW）生物医学研究中心（BRC）的机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。使用人外周血单个核细胞（PBMCs）的研究已获威斯康星血液中心血液研究所机构审查委员会（IRB）批准。

1. 小鼠、细胞系和载体

  1. 从商业供应商处获取 C57BL/6 小鼠。在无病原体条件下维持小鼠种群，使用 6 至 12 周龄的雌性和雄性小鼠。从经伦理审查委员会（IRB）批准的来源获取去标识化的人外周血单个核细胞（PBMCs）。
  2. 使用含 20–30%（v/v）异氟烷的丙二醇（1,2-丙二醇，USP 级）混合物对小鼠进行麻醉。在小鼠麻醉期间，向其眼部涂抹兽用眼膏以防止角膜干燥。
  3. 在麻醉诱导后，通过颈椎脱位法对动物实施安乐死。
    1. 用一只手牢固抓住小鼠尾根部以固定动物，用另一只手的拇指和食指或一支坚固的笔状物抵住其颈部背部、颅底位置。
    2. 为实现脱位，将固定头部的手向前推并向下施压，同时用握住尾根的手向后拉。通过触诊颈椎组织是否分离来确认脱位效果。
  4. 将动物留在密闭室或笼内至少 5 分钟，仅在呼吸活动消失或无法检测到心跳时方可移出。
  5. 从商业供应商处获取 K562 和 YAC-1 细胞，并将其维持在含有 10% 热灭活胎牛血清（FBS）的 RPMI1640 培养基中。定期检测这些细胞系，以排除支原体污染的可能性。

2. 慢病毒载体的制备与滴定

  1. 在含有20 mL RPMI1640培养基（添加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素、1 mM丙酮酸钠、5%的7.5%碳酸氢钠溶液和0.001% β-巯基乙醇）的T75 cm2培养瓶中，将5 × 106个293T细胞过夜培养。将培养瓶置于37 °C、含5.2% CO2的培养箱中。
  2. 使用含0.025%胰蛋白酶和1 mM EDTA的磷酸盐缓冲液（PBS）收集293T细胞。向培养瓶中加入5 mL胰蛋白酶/EDTA溶液，在37 °C培养箱中孵育10分钟，使293T细胞从T75 cm2培养瓶表面脱落。
    1. 收集脱落的细胞，并用PBS洗涤两次以去除残留的胰蛋白酶和EDTA。用血细胞计数板计数细胞，并将细胞浓度调整为每毫升一百万个细胞。
  3. 将3.95 µg psPAX2、1.32 µg pMD2G以及5.26 µg pLEP-GFP-Puro（由BRI内部构建，通过将pWPI中的EF1alpha启动子替换pLenti CMV-GFP-Puro中的CMV启动子获得）19共转染至293T细胞中18。
    1. 配制1 mL 150 mM NaCl溶液，加入63 µL 0.6 mg/mL聚乙烯亚胺（PEI；25,000 kD，线性），充分混匀，随后加入质粒并再次混匀。室温孵育20分钟后，将混合物加入细胞中。
    2. 转染后16小时，更换为新鲜培养基并添加4.5 mM丁酸钠。转染后48小时收集含病毒的上清液，并在5,000 × g条件下离心浓缩过夜。参见材料表。
  4. 通过连续稀释法感染293T细胞，并在转导后72小时采用流式细胞术检测，测定病毒滴度20。以绿色荧光蛋白（GFP）的表达水平作为定量病毒滴度的指标。

3. 小鼠原代NK细胞的纯化与扩增

  1. 纯化小鼠原代自然杀伤（NK）细胞21。简言之，将单细胞脾脏悬液通过尼龙毛柱，以去除由B细胞和巨噬细胞组成的贴壁细胞群体。
  2. 将从尼龙毛柱洗脱的非贴壁细胞群体（含小鼠NK细胞）在RPMI1640完全培养基中培养，培养基含1,000 U/mL白细胞介素（IL）-2、10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素、1 mM丙酮酸钠、5%的7.5%碳酸氢钠溶液以及0.001% β-巯基乙醇（RPMI1640完全培养基）。
  3. 在培养第4天更换培养瓶中的培养基，以去除非贴壁的T细胞和NKT细胞；仍贴壁于培养瓶的细胞主要为NK细胞。向培养瓶中加入20 mL新鲜RPMI1640完全培养基和1,000 U/mL IL-2，以补充培养基。
  4. 在培养第7天通过流式细胞术检测小鼠NK细胞培养物的纯度，使用NK细胞特异性标记物20，要求CD3-NK1.1+细胞群体比例超过95%。

4. 人原代NK细胞的纯化与扩增

  1. 通过密度梯度法从健康人类志愿者的血沉棕黄层中分离外周血单个核细胞（PBMCs）。简而言之，将35 mL用HBSS稀释一倍的细胞样本小心地叠加在50 mL标准离心管中的15 mL密度梯度液上方。在20 °C下，使用水平转子以400 × g离心30分钟，离心过程中不启用刹车。
  2. 根据制造商的说明书，使用商用抗体介导的阴性筛选试剂盒纯化人原代自然杀伤（NK）细胞。
  3. 分离完成后，通过免疫荧光分析测定NK细胞制备物的纯度。在4 °C条件下，用2 µg/mL抗-CD3抗体和2 µg/mL抗-CD56抗体对NK细胞制备物染色20分钟。用PBS洗涤细胞两次，通过流式细胞术分析细胞表面CD3阴性且CD56阳性的NK细胞群。
  4. 将细胞制备物在4 °C下与抗体孵育20分钟，用PBS洗涤后进行流式细胞仪分析。基因转导实验应使用纯度高于85%的NK细胞制备物20。

5. 用慢病毒转导小鼠和人原代NK细胞

  1. 将小鼠或人原代 NK 细胞悬浮于 24 孔板中，细胞密度为 0.5 × 105/mL 培养基，并加入 GFP 慢病毒上清液，感染复数（MOI）分别为 5、10 和 20，同时加入 Pb（8 µg/mL）、PS（8 µg/mL）或葡聚糖（8 µg/mL）。
  2. 以 1,000 × g 离心 60 分钟。
  3. 不移除上清液，将细胞在 37 °C、含 5.2% CO2 的培养箱中过夜培养（16–18 小时）。
  4. 用 10 mL PBS 洗涤细胞，重悬于 2 mL 含 IL-2（300 U/mL）的完全 RPMI1640 培养基中。
  5. 通过进行不同效应细胞与靶细胞比例的 51铬（Cr）释放实验，分别检测人和小鼠原代 NK 细胞对 K562 和 YAC-1 细胞的细胞毒性22。
    1. 简要而言，向一百万个靶细胞加入 50 µCi 放射性标记的铬酸钠 51Cr。在 4 小时孵育期间，靶细胞将 51Cr 摄取至细胞蛋白中。孵育结束后，洗涤细胞以去除未结合的放射性标记物。
    2. 根据靶细胞释放的 51Cr 的绝对释放量、自发释放量和实验释放量，计算特异性肿瘤细胞裂解率。
      注：特异性裂解百分比的计算基于五次重复实验，使用以下公式：% 特异性裂解 = ((51Cr 实验组平均释放量 - 51Cr 自发释放量平均值) / (51Cr 最大释放量平均值 - 51Cr 自发释放量平均值)) × 100，其中 "51Cr 自发释放量平均值" 指在无 NK 细胞存在时靶细胞释放的 51Cr 量，"51Cr 最大释放量平均值" 指靶细胞经 2 N 盐酸（HCl）裂解后释放的 51Cr 量。
  6. 在第 7 天轻轻敲击培养瓶，收获转导后的 NK 细胞。
    1. 通过在 96 孔高蛋白吸附性聚苯乙烯板上包被 2.5 µg/mL 的抗 NKG2D 单克隆抗体（A10）过夜，以滴定浓度的板结合抗 NKG2D 单抗激活收获的细胞。
    2. 在加入原代 NK 细胞前，每孔用 100 µL PBS 洗涤三次。
  7. 在激活后 16 至 18 小时，使用多通道移液器收集培养上清液，用于定量检测 IFN-γ 等细胞因子。使用 ELISA 试剂盒中提供的重组细胞因子生成标准曲线。
  8. 采用 Annexin-V/7-氨基放线菌素 D（7-AAD）染色法检测 NK 细胞活力23，并通过流式细胞仪确定转化 NK 细胞中坏死细胞的百分比。
    1. 进行该实验时，在转导后第四天收获小鼠和人 NK 细胞，用 10 mL 冷 PBS 在 500 × g 条件下各洗涤两次，每次 5 分钟，随后使用 Annexin-V（PE）/7-AAD 试剂盒进行孵育。
  9. 使用适当的流式细胞分析软件分析数据。选择活细胞群体，并分析 GFP 表达（FITC 通道）以评估病毒转导效率24。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

右旋糖酐可有效促进慢病毒载体在原代人和小鼠自然杀伤细胞中的基因转导

从外周血单个核细胞（PBMC）中分离并纯化人自然杀伤细胞（NK细胞），纯度超过85%，并在含300 U/mL重组白细胞介素-2（rIL-2）的条件下过夜培养。随后，将这些原代NK细胞在24孔板中用不同感染复数（MOI；分别为每细胞3、10和20感染单位）的GFP慢病毒进行转导，同时加入8 µg/mL的聚苯乙烯（Pb）、聚苯乙烯-磺酸（PS）或葡聚糖（dextran）。细胞在1,000 × g条件下离心60分钟，并在含病毒的CO2培养箱中于37 °C继续培养过夜。之后，细胞经洗涤并重悬于新鲜RPMI1640完全培养基中，含300 U/mL rIL-2，继续培养7天。转导效率通过转导后第7天的GFP表达水平，采用流式细胞术进行评估。结果显示，葡聚糖可增强慢病毒对人NK细胞的转导效率，提高病毒滴度，从而增加转导NK细胞的比例（图1

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本研究表明，使用右旋糖酐作为阳离子聚合物试剂可提高慢病毒对小鼠和人原代自然杀伤（NK）细胞的转导效率。此外，其他阳离子试剂如聚溴化物（Pb）或聚硫酸酯（PS）对慢病毒载体递送至人原代NK细胞并无明显影响。既往研究已证实，Pb可增强慢病毒对人T细胞的基因转导效率17。然而，本研究结果表明，Pb和PS对人原代NK细胞均无类似增效作用。在本研究中，Pb仅对小鼠NK细胞的转导效率有轻微提升。已有研究显示，使用TBK1/IKKɛ抑制剂BX795抑制细胞内抗病毒防御机制，并联合PS作为增强剂，可提高慢病毒转导效率25。然而，实验结果表明，该抑制剂对小鼠或人原代NK细胞的转导效率并无影响（数据未显示）。

结果表明，葡聚糖可有效诱导人和小鼠原代NK细胞的转导，而PS和Pb则无此作用。结果还显示，葡聚糖不影响NK细胞的效应功能，如抗肿瘤细胞毒性和促炎性细胞因子的产生。因此，这些结果证实葡聚糖的使用并未改变这些原代NK细胞的存活能力。

多项研究分析并比...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明不存在经济利益冲突。

致谢

感谢Lucia Sammarco及其Lulu's Lemonade Stand提供的灵感、动力和支持。本工作部分由以下机构资助：NIH R01 AI102893 和 NCI R01 CA179363（S.M.）；NHLBI-HL087951（S.R.）；NIH-CA151893-K08（M.J.R.）；NCI 1R01CA164225（L.W）；Alex Lemonade Stand基金会（S.M.）；MACC基金HRHM项目（S.M.；S.R.；M.S.T）；Nicholas家族基金会（S.M.）；Gardetto家族（S.M.）；现代学者计划（M.S.T.）；现代希望之轮（S.R.）；MACC基金（M.S.T. 和 S.M.）；儿童研究所，MCW（S.R.）；以及Kathy Duffey Fogerty奖（M.J.R.）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
葡聚糖Sigma-Aldrich90-64-91-9
聚凝胺（Pb）Sigma-AldrichTR-1003
硫酸鱼精蛋白（PS）Sigma-Aldrichp3369
胰蛋白酶Corning25-052-CI
RPMI1640Corning10-040-CV
胎牛血清ATALANTAS11150
青霉素Corning30-001-CI
β-巯基乙醇SIGMAM3148
丙酮酸钠CorningMT25000CI
干扰素γ（IFN-γ）eBioscience14-7311-85
碘化丙啶染色液BD51-66211E
Lipofectamine 3000Thermo FisherL3000015
异氟烷PHOENIXNDC 57319-559-05
NK细胞阴性筛选试剂盒Stem Cell19855
Yac-1ATCCTIB-160
K562ATCCCCL-243
小鼠Jakson664
293T细胞ATCCCRL-3216
T75培养瓶Cornnig430641U
基于抗体的阴性筛选试剂盒Stem Cell19055
51铬（Cr）释放实验Perkin ElmerNEZ030
ELISA试剂盒Ebioscience00-4201-56
丁酸钠Sigma5887-5G
线性聚乙烯亚胺Polysciences23966-2
菲可尔GE Life Science17-1440-03
HBSSCorning21-022-CV

参考文献

  1. Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T., Ugolini, S. Functions of natural killer cells. Nat. Immunol. 9, 503-510 (2008).
  2. Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nat. Rev. Immunol. 6, 715-727 (2006).
  3. Arina, A., et al. Cellular liaisons of natural killer lymphocytes in immunology and immunotherapy of cancer. Expert. Opin. Biol. Ther. 7, 599-615 (2007).
  4. Manilay, J. O., Sykes, M. Natural killer cells and their role in graft rejection. Curr. Opin. Immunol. 10, 532-538 (1998).
  5. Raulet, D. H., Vance, R. E. Self-tolerance of natural killer cells. Nat. Rev. Immunol. 6, 520-531 (2006).
  6. Chouaib, S., et al. Improving the outcome of leukemia by natural killer cell-based immunotherapeutic strategies. Front Immunol. 5, 95(2014).
  7. Dulphy, N., et al. Underground Adaptation to a Hostile Environment: Acute Myeloid Leukemia vs. Natural Killer Cells. Front Immunol. 7, 94(2016).
  8. Tran, J., Kung, S. K. Lentiviral vectors mediate stable and efficient gene delivery into primary murine natural killer cells. Mol. Ther. 15, 1331-1339 (2007).
  9. Maasho, K., Marusina, A., Reynolds, N. M., Coligan, J. E., Borrego, F. Efficient gene transfer into the human natural killer cell line, NKL, using the Amaxa nucleofection system. J. Immunol. Methods. 284, 133-140 (2004).
  10. Trompeter, H. I., Weinhold, S., Thiel, C., Wernet, P., Uhrberg, M. Rapid and highly efficient gene transfer into natural killer cells by nucleofection. J. Immunol. Methods. 274, 245-256 (2003).
  11. Becknell, B., et al. Efficient infection of human natural killer cells with an EBV/retroviral hybrid vector. J. Immunol. Methods. 296, 115-123 (2005).
  12. Jiang, K., et al. Syk regulation of phosphoinositide 3-kinase-dependent NK cell function. J. Immunol. 168, 3155-3164 (2002).
  13. Burshtyn, D. N., et al. Conserved residues amino-terminal of cytoplasmic tyrosines contribute to the SHP-1-mediated inhibitory function of killer cell Ig-like receptors. J. Immunol. 162, 897-902 (1999).
  14. Schroers, R., et al. Gene transfer into human T lymphocytes and natural killer cells by Ad5/F35 chimeric adenoviral vectors. Exp. Hematol. 32, 536-546 (2004).
  15. Imai, C., Iwamoto, S., Campana, D. Genetic modification of primary natural killer cells overcomes inhibitory signals and induces specific killing of leukemic cells. Blood. 106, 376-383 (2005).
  16. Denning, W., et al. Optimization of the transductional efficiency of lentiviral vectors: effect of sera and polycations. Mol. Biotechnol. 53, 308-314 (2013).
  17. Lamers, C. H., Willemsen, R. A., Luider, B. A., Debets, R., Bolhuis, R. L. Protocol for gene transduction and expansion of human T lymphocytes for clinical immunogene therapy of cancer. Cancer Gene Ther. 9, 613-623 (2002).
  18. Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PLoS. ONE. 4, e6529(2009).
  19. Segura, M. M., Garnier, A., Durocher, Y., Ansorge, S., Kamen, A. New protocol for lentiviral vector mass production. Methods Mol. Biol. 614, 39-52 (2010).
  20. Rajasekaran, K., et al. Signaling by Fyn-ADAP via the Carma1-Bcl-10-MAP3K7 signalosome exclusively regulates inflammatory cytokine production in NK cells. Nat. Immunol. 14, 1127-1136 (2013).
  21. Regunathan, J., Chen, Y., Wang, D., Malarkannan, S. NKG2D receptor-mediated NK cell function is regulated by inhibitory Ly49 receptors. Blood. 105, 233-240 (2005).
  22. Awasthi, A., et al. Rap1b facilitates NK cell functions via IQGAP1-mediated signalosomes. J. Exp. Med. 207, 1923-1938 (2010).
  23. Rajasekaran, K., et al. Transforming Growth Factor-{beta}-activated Kinase 1 Regulates Natural Killer Cell-mediated Cytotoxicity and Cytokine Production. J Biol. Chem. 286, 31213-31224 (2011).
  24. Wolkowicz, R., Nolan, G. P., Curran, M. A. Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells. Methods Mol. Biol. 246, 391-411 (2004).
  25. Sutlu, T., et al. Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy. Hum. Gene Ther. 23, 1090-1100 (2012).
  26. Cornetta, K., Anderson, W. F. Protamine sulfate as an effective alternative to polybrene in retroviral-mediated gene-transfer: implications for human gene therapy. J. Virol. Methods. 23, 187-194 (1989).
  27. Toyoshima, K., Vogt, P. K. Enhancement and inhibition of avian sarcoma viruses by polycations and polyanions. Virology. 38, 414-426 (1969).
  28. Jensen, M., et al. The bi-specific CD3 x NCAM antibody: a model to preactivate T cells prior to tumour cell lysis. Clin. Exp. Immunol. 134, 253-263 (2003).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

右旋糖酐提高小鼠和人原代NK细胞的慢病毒转导效率
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。