本研究的目的是开发能够成功实现原代自然杀伤（NK）细胞基因转导的技术。通过葡聚糖介导的慢病毒转导方法，可实现人或小鼠原代NK细胞的高效基因表达。该基因转导方法将极大改善NK细胞的遗传操作效果。
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摘要
摘要
将特定基因高效转导至自然杀伤（NK）细胞一直是一个重大挑战。成功的基因转导对于明确目的基因在NK细胞发育、分化及功能中的作用至关重要。近年来，嵌合抗原受体（CARs）在癌症免疫治疗中的进展进一步凸显了建立一种高效方法以将外源基因递送至效应淋巴细胞的迫切需求。目前，慢病毒介导的基因转导在人或小鼠原代NK细胞中的效率仍然显著偏低，这是主要的限制因素。近期研究表明，使用聚凝胺等阳离子聚合物可提高T细胞的基因转导效率。然而，这些试剂未能改善NK细胞的转导效率。本研究显示，右旋糖酐（一种支链葡聚糖多糖）可显著提高人和小鼠原代NK细胞的转导效率。这一高度可重复的转导方法为转导人原代NK细胞提供了有效工具，有望极大提升临床基因递送应用，从而推动基于NK细胞的癌症免疫治疗。
引言
自然杀伤（NK）细胞是先天免疫系统中的主要淋巴细胞群体1。NK细胞在宿主免疫应答中发挥着对抗肿瘤和感染的第一道防线作用2,3,4。NK细胞还通过分泌强效的细胞因子和趋化因子，在耐受性形成过程中发挥核心作用5。由于其靶向并清除肿瘤细胞的强大能力，目前正在进行多项临床试验，以评估供体来源的人NK细胞作为癌症过继性免疫治疗的应用潜力6,7。与T细胞相比，NK细胞的发育生物学尚未被充分阐明8。这一知识的缺乏部分原因在于缺乏能够高效将目的基因导入小鼠或人原代NK细胞的技术。因此，大多数NK细胞研究均在细胞系中进行，而非在原代细胞中开展。因此，建立一种可靠且高效的原代NK细胞转导目的基因的实验方案至关重要。
本研究的总体目标是建立一种稳定且可靠的方法，用于将原代人或小鼠自然杀伤（NK）细胞通过慢病毒或逆转录病毒进行转导。
早期为解决这一问题而开展的研究主要采用原代NK细胞的瞬时转染方法，包括....
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方案
所有动物实验方案均遵循动物人道与伦理处理原则，并经威斯康星医学院（MCW）生物医学研究中心（BRC）的机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。使用人外周血单个核细胞（PBMCs）的研究已获威斯康星血液中心血液研究所机构审查委员会（IRB）批准。
1. 小鼠、细胞系和载体
- 从商业供应商处获取 C57BL/6 小鼠。在无病原体条件下维持小鼠种群，使用 6 至 12 周龄的雌性和雄性小鼠。从经伦理审查委员会（IRB）批准的来源获取去标识化的人外周血单个核细胞（PBMCs）。
- 使用含 20–30%（v/v）异氟烷的丙二醇（1,2-丙二醇，USP 级）混合物对小鼠进行麻醉。在小鼠麻醉期间，向其眼部涂抹兽用眼膏以防止角膜干燥。
- 在麻醉诱导后，通过颈椎脱位法对动物实施安乐死。
- 用一只手牢固抓住小鼠尾根部以固定动物，用另一只手的拇指和食指或一支坚固的笔状物抵住其颈部背部、颅底位置。
- 为实现脱位，将固定头部的手向前推并向下施压，同时用握住尾根的手向后拉。通过触诊颈椎组织是否分离来确认脱位效果。
- 将动物留在密闭室或笼内至少 5 分钟，仅在呼吸活动消失或无法检测到心跳时方可移出。
- 从商业供应商处获取 K562 和 YAC-1 细胞，并将其维持在含有 10% 热灭活胎牛血清（FBS）的 RPMI1640 培养基中。定期检....
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结果
右旋糖酐可有效促进慢病毒载体在原代人和小鼠自然杀伤细胞中的基因转导
从外周血单个核细胞（PBMC）中分离并纯化人自然杀伤细胞（NK细胞），纯度超过85%，并在含300 U/mL重组白细胞介素-2（rIL-2）的条件下过夜培养。随后，将这些原代NK细胞在24孔板中用不同感染复数（MOI；分别为每细胞3、10和20感染单位）的GFP慢病毒进行转导，同时加入8 µg/mL的聚苯乙烯（Pb）、聚苯乙烯-磺酸（PS）或葡聚糖（dextran）。细胞在1,000 × g条件下离心60分钟，并在含病毒的CO2培养箱中于37 °C继续培养过夜。之后，细胞经洗涤并重悬于新鲜RPMI1640完全培养基中，含300 U/mL rIL-2，继续培养7天。转导效率通过转导后第7天的GFP表达水平，采用流式细胞术进行评估。结果显示，葡聚糖可增强慢病毒对人NK细胞的转导效率，提高病毒滴度，从而增加转导NK细胞的比例（图1
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讨论
本研究表明，使用右旋糖酐作为阳离子聚合物试剂可提高慢病毒对小鼠和人原代自然杀伤（NK）细胞的转导效率。此外，其他阳离子试剂如聚溴化物（Pb）或聚硫酸酯（PS）对慢病毒载体递送至人原代NK细胞并无明显影响。既往研究已证实，Pb可增强慢病毒对人T细胞的基因转导效率17。然而，本研究结果表明，Pb和PS对人原代NK细胞均无类似增效作用。在本研究中，Pb仅对小鼠NK细胞的转导效率有轻微提升。已有研究显示，使用TBK1/IKKɛ抑制剂BX795抑制细胞内抗病毒防御机制，并联合PS作为增强剂，可提高慢病毒转导效率25。然而，实验结果表明，该抑制剂对小鼠或人原代NK细胞的转导效率并无影响（数据未显示）。
结果表明，葡聚糖可有效诱导人和小鼠原代NK细胞的转导，而PS和Pb则无此作用。结果还显示，葡聚糖不影响NK细胞的效应功能，如抗肿瘤细胞毒性和促炎性细胞因子的产生。因此，这些结果证实葡聚糖的使用并未改变这些原代NK细胞的存活能力。
多项研究分析并比.......
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披露
作者声明不存在经济利益冲突。
致谢
感谢Lucia Sammarco及其Lulu's Lemonade Stand提供的灵感、动力和支持。本工作部分由以下机构资助：NIH R01 AI102893 和 NCI R01 CA179363（S.M.）；NHLBI-HL087951（S.R.）；NIH-CA151893-K08（M.J.R.）；NCI 1R01CA164225（L.W）；Alex Lemonade Stand基金会（S.M.）；MACC基金HRHM项目（S.M.；S.R.；M.S.T）；Nicholas家族基金会（S.M.）；Gardetto家族（S.M.）；现代学者计划（M.S.T.）；现代希望之轮（S.R.）；MACC基金（M.S.T. 和 S.M.）；儿童研究所，MCW（S.R.）；以及Kathy Duffey Fogerty奖（M.J.R.）。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 葡聚糖 | Sigma-Aldrich | 90-64-91-9 | |
| 聚凝胺（Pb） | Sigma-Aldrich | TR-1003 | |
| 硫酸鱼精蛋白（PS） | Sigma-Aldrich | p3369 | |
| 胰蛋白酶 | Corning | 25-052-CI | |
| RPMI1640 | Corning | 10-040-CV | |
| 胎牛血清 | ATALANTA | S11150 | |
| 青霉素 | Corning | 30-001-CI | |
| β-巯基乙醇 | SIGMA | M3148 | |
| 丙酮酸钠 | Corning | MT25000CI | |
| 干扰素γ（IFN-γ） | eBioscience | 14-7311-85 | |
| 碘化丙啶染色液 | BD | 51-66211E | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher | L3000015 | |
| 异氟烷 | PHOENIX | NDC 57319-559-05 | |
| NK细胞阴性筛选试剂盒 | Stem Cell | 19855 | |
| Yac-1 | ATCC | TIB-160 | |
| K562 | ATCC | CCL-243 | |
| 小鼠 | Jakson | 664 | |
| 293T细胞 | ATCC | CRL-3216 | |
| T75培养瓶 | Cornnig | 430641U | |
| 基于抗体的阴性筛选试剂盒 | Stem Cell | 19055 | |
| 51铬（Cr）释放实验 | Perkin Elmer | NEZ030 | |
| ELISA试剂盒 | Ebioscience | 00-4201-56 | |
| 丁酸钠 | Sigma | 5887-5G | |
| 线性聚乙烯亚胺 | Polysciences | 23966-2 | |
| 菲可尔 | GE Life Science | 17-1440-03 | |
| HBSS | Corning | 21-022-CV |
参考文献
- Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T., Ugolini, S. Functions of natural killer cells. Nat. Immunol. 9, 503-510 (2008).
- Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nat. Rev. Immunol. 6, 715-727 (....
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