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一种用于评估抗菌疗效的免疫健全啮齿类动物肺炎稳健模型S. pneumoniae,H. influenzae,K. pneumoniae,P. aeruginosa或A. baumannii

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DOI：

10.3791/55068

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2017年1月2日

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1Antibacterial Discovery Performance Unit, GlaxoSmithKline

本文内容

摘要

本文介绍了一种在免疫功能健全的啮齿类动物中建立肺部感染的方法。熟练掌握后，该方法可快速、简便地用于诱导由多种S. pneumoniae、H. influenzae、P. aeruginosa、K. pneumoniae和A. baumannii分离株引起的稳定感染。

摘要

候选抗菌治疗方案的有效性必须在感染动物模型中加以验证，作为发现与开发过程的一部分，最好是在能够模拟预期临床适应症的模型中进行。本文描述了一种在免疫功能健全的大鼠和小鼠中诱导严重肺部感染的方法，可用于评估针对由S. pneumoniae、H. influenzae、P. aeruginosa、K. pneumoniae或A. baumannii引起的严重肺炎的治疗效果。实验动物经麻醉后，通过非手术气管插管将基于琼脂的接种物深入递送至肺部。所建立的感染模型具有一致性、可重复性，并且对大多数菌株而言，感染状态至少可持续48小时，最长可达96小时。使用已上市抗菌药物开展的研究表明，该模型中in vivo（体内）疗效与in vitro（体外）敏感性具有良好相关性，且在此模型中确定的药代动力学/药效学（PK/PD）目标与临床公认的目标具有一致性。尽管学习该技术初期需要投入一定时间，但一旦掌握后即可快速高效地操作。该模型的优势包括无需诱导中性粒细胞减少状态、增强的稳健性与可重复性、可研究更多病原体和菌株、实验设计更具灵活性，以及可在免疫功能健全的宿主中建立具有挑战性的感染。

引言

在感染动物模型中评估潜在药物候选物的有效性是抗菌药物发现过程中的关键环节。体内药效研究为整个药物发现过程中的决策提供了重要数据，涵盖从阐明构效关系（SAR）和优化先导化合物系列，到确定化合物的药代动力学-药效学（PK/PD）特征，并支持临床开发和监管审批中的剂量选择。目前文献中已报道了多种用于此类研究的动物感染模型。其中最常见且应用最广泛的模型之一是中性粒细胞减少小鼠大腿感染模型，该模型最初由 Eagle1, 2 建立，后经 Vogelman 与 Craig3, 4 进一步发展。该模型在支持确定细菌敏感性折点以及提供用于指导人类用药剂量的PK/PD靶标方面具有重要价值。已有大量实例证明了该模型的预测能力4-7。然而，大腿感染模型的一个局限性在于其对肺部感染缺乏直接相关性。目前人们更加重视动物模型中感染部位与人类感染部位的一致性；因此，针对肺炎治疗药物的研究，理想的方法是采用动物肺部感染模型。

已报道并用于抗菌疗效研究的实验动物肺部感染诱导方法有多种，包括经鼻吸入法、经口咽部吸入法、气溶胶暴露法以及手术气管内接种法。8在许多情况下，必须首先使动物（尤其是小鼠）处于中性粒细胞减少状态，以建立稳定的肺部感染。尽管处于这种严重免疫缺陷状态，能在啮齿类动物中引起可存活感染的细菌病原体及其菌株仍然有限。例如，成功建立 流感嗜血杆菌 或 鲍曼不动杆菌 在肺炎模型中9, 10，以及毒性更强的病原体，例如 肺炎链球菌，铜绿假单胞菌 和 肺炎克雷伯菌 可能带来挑战 11-13.

1991年，Smith描述了一种在免疫功能健全的断奶大鼠中建立的肺部感染模型，该模型通过简单的非手术气管插管方法将细菌直接注入肺部以建立感染14. 贝里 等随后对该方法进行了改进，用于感染小鼠15使用基于琼脂的接种物，该接种技术可在免疫功能健全的大鼠和小鼠中诱导出强烈的肺部感染 肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌 和 A. baumannii该模型适用于多种分离株，包括携带不同耐药决定因子的菌株以及通过其他接种途径无法产生可存活感染的菌株。同时，该模型可在免疫功能健全的动物体内评估药效，相较于传统的中性粒细胞减少型小鼠模型，更贴近非重度免疫功能低下患者群体的实际情况。该模型在多种病原体和分离株中均表现出良好的一致性和可靠性，因此非常适用于抗菌药物的疗效研究。

方案

所有操作均遵循葛兰素史克机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案，并符合或超过美国实验室动物护理评估认证协会（AAALAC）、美国卫生与公共服务部以及所有地方和联邦动物福利法律的标准。

注意：除非另有说明，所有操作均应采用无菌技术进行。

1. 培养细菌分离株

  1. 准备3至6个琼脂平板，接种S. pneumoniae或H. influenzae，因为液体培养物通常无法提供足够的接种材料。
    1. 从-80 °C保存处取出冻存菌种，完全解冻后，使用标准微生物学技术，将最多100 µL菌液分别划线接种于添加绵羊血的胰蛋白胨大豆琼脂平板（用于S. pneumoniae）或巧克力琼脂平板（用于H. influenzae）。在37 °C下孵育过夜，可加或不加5% CO2。
  2. 使用K. pneumoniae、P. aeruginosa或A. baumannii制备液体培养物。
    1. 从-80 °C保存处取出冻存菌种，完全解冻后，将100 µL菌液转移至50 mL脑心浸液（BHI）培养基中。在37 °C下轻轻振荡（约120 rpm）培养过夜。
    2. [可选] 若需对数生长期培养物，可将过夜培养物1 mL转接至50 mL新鲜BHI培养基中，在37 °C下轻轻振荡（约120 rpm）培养3小时。

2. 准备盐水细菌悬液

  1. 在所有悬浮液制备步骤（2.1 至 2.3）中，使用温度介于室温至 37 °C 之间的无菌生理盐水。用无菌接种环从琼脂平板表面刮取过夜培养的 S. pneumoniae 或 H. influenzae 菌落，将收获的菌体转移至 5 mL 无菌生理盐水中，直至形成浑浊、不透明的菌悬液，并轻轻涡旋混匀至均匀状态。
  2. 将用于接种的 K. pneumoniae、P. aeruginosa 或 A. baumannii 最终液体培养物（例如 过夜培养或对数生长期培养物）取 50 mL，在 4,500 × g 条件下离心 5 分钟。用移液器吸除上清液并弃去。将沉淀物重悬于至少 5 mL 无菌生理盐水中，并轻轻涡旋以获得均匀的悬浮液。
  3. 如有必要，使用无菌生理盐水进一步稀释悬浮液，使其浓度达到 8 至 9 log10 菌落形成单位（CFU）/mL 范围。取一份等分试样用于测定 CFU/mL。按照第 7.5 和 7.6 节所述方法进行系列稀释并涂布平板。

3. 准备基于琼脂的接种物

  1. 根据制造商说明配制一小瓶（约 50 mL）营养琼脂，或融化先前配制并储存的固体营养琼脂，冷却至约 50 °C。
  2. 将液态琼脂及感染过程所需的所有工具和设备转移至动物感染操作区域，并在该区域维持一个 42 °C 的小型水浴。
  3. 待琼脂温度降至约 50 °C 后，分装 9 mL 至一支无菌试管中，试管大小应适合放入水浴设备。将该试管置于水浴中，直至琼脂温度平衡至约 42 °C。确保水浴水位足够浸没试管内琼脂液面，但不接触管盖或瓶盖。
  4. 取第 2.3 步制备的 1 mL 细菌盐水悬液，加入水浴中盛有 9 mL 琼脂的试管内。盖紧管盖，反复倒置数次以混匀，然后将试管放回水浴中。

4. 麻醉、插管并接种动物

注意：建议使用体重为100–120 g的SPF级免疫功能健全的雄性Sprague-Dawley大鼠，或体重为20–25 g的雄性CD-1小鼠。所有动物均应提供食物和水 随意摄取 在木屑或其他吸水性垫料上群养，并保持标准的12小时光照-黑暗循环。

  1. 在进行任何实验之前，获取并灭菌适用于该动物物种的金属导管和聚乙烯导管。准备无菌的一次性1 mL注射器和无菌的一次性25号针头。
    注意：针头和注射器必须始终丢弃在锐器容器中。
    1. 对于大鼠，购买或自制一根长约12 cm、内径0.9–1.0 mm、外径1.0–1.2 mm的金属套管，并将其一端弯曲成约45°角。取一段11至12英寸长的聚乙烯管，内径0.4 mm，外径0.8 mm。（参见 图1A。)
    2. 对于小鼠，购买一支#20动物喂养管。用镊子夹住管端的球状物并用力拉扯，将其移除，然后将管端轻轻弯曲成约45°角。取一段11至12英寸长、内径0.28 mm、外径0.61 mm的聚乙烯管。同时购买并灭菌一支100 µL玻璃微量注射器和一根30号金属微量注射针。（参见 图1B.)
    3. 将金属套管放入玻璃螺口管中，通过标准方法高压灭菌以达到灭菌效果。将裁剪好的聚乙烯导管段浸泡并保存在盛有酒精的带盖烧杯中。
  2. 准备操作台面和插管装置。
    1. 将干净的一次性垫板放置在靠近水浴的工作台面上。将金属导管连同其玻璃储存管一起转移至该台面。取下储存管的盖子，并将导管滑出 "手柄" 将套管的末端连接至管子的开口端。
    2. 使用无菌镊子从烧杯中取出一段聚乙烯导管，将其穿过无菌金属套管的内部，确保导管可自由移动。将无菌一次性25号针头（用于大鼠）或玻璃微量注射器经灭菌的30号金属针头（用于小鼠）套在聚乙烯导管的自由端，使针头向内插入导管数毫米。（参见 图1A 大鼠和 图1B 用于小鼠。
    3. 在金属套管和聚乙烯导管上标记引导线，以指示插管深度。具体操作如下：先在一只已处死的动物上按照下述插管步骤进行操作，打开胸腔以供观察，随后正确放置金属套管，并适当前置聚乙烯导管（如第4.7节所述）。使用永久性记号笔，在金属套管与动物口腔交界处进行标记，同时在聚乙烯导管与金属套管顶端齐平处做标记，以便在后续动物实验中准确放置。
  3. 在通风橱内（或使用适当的废气清除系统），将最多6只动物置于密闭麻醉 chamber 中，以1.5 L/min的氧气为载体通入≤5%异氟烷，直至咽反射消失（约1分钟）。
    注意：在开展任何实验之前，需在所使用的特定条件下确定异氟烷的安全剂量和暴露时间（例如 腔室的尺寸/类型以及动物的体型/物种/品系，以防止意外致死性暴露。
  4. 用无菌的一次性1 mL注射器（适用于大鼠）吸取无菌生理盐水：将无菌针头插入生理盐水中，向后拉动活塞完成充液。按照下述方法填充无菌玻璃微量注射器（适用于小鼠）。将注射器连接至已安装在聚乙烯管上的针头，推动注射器内液体，使全部生理盐水通过管路，直至注射器排空。
    1. 为了填充显微注射器（用于小鼠），完全取出注射器中的金属推杆以及连接在聚乙烯管上的针头，并将两者放置一旁。
    2. 用无菌的一次性1 mL注射器吸取无菌生理盐水（如上所述），并连接一支无菌的一次性25号针头。将针头插入显微注射器顶部（即金属推杆插入的位置），推动一次性注射器的推杆，直至生理盐水充满显微注射器。
    3. 丢弃用于填充显微注射器的一次性注射器和针头，放入锐器容器中。将已连接在聚乙烯导管上的金属显微注射针重新安装到显微注射器尖端，并重新插入金属推杆，下压直至全部生理盐水体积经注射器和导管完全排出。
  5. 从水浴中的容器内吸取琼脂基接种物至注射器中，并将琼脂冲洗通过管路，直至管路完全充满（完成引管）例如 完全填满琼脂。
    1. 对于大鼠，将连接在聚乙烯导管上的25号针头从一次性注射器上取下，并将使用过的注射器丢弃至锐器容器中。将新的无菌一次性1 mL注射器的无菌针头插入水浴中容器内的琼脂接种液，回抽活塞吸取接种液。重新连接带有聚乙烯导管的针头，推动活塞排出琼脂，直至导管完全充满琼脂。
    2. 对于小鼠，从微量注射器上取下连接在聚乙烯导管上的金属微量注射针和金属推杆，并将其放置一旁。使用无菌的一次性1 mL注射器和无菌的一次性25号针头，按照第4.4节所述的填充程序，从水浴中的容器内吸取基于琼脂的接种物，注入微量注射器中。重新安装连接在聚乙烯导管上的金属微量注射针，插入金属推杆，推动琼脂通过导管，直至导管完全充满琼脂为止。
  6. 从麻醉室中取出一只动物，将其仰卧置于一次性垫上，头部朝右，尾部朝左，如图所示 图1C.
  7. 使用插管装置（即 金属套管连接聚乙烯导管），对动物进行插管，并将套管插入左肺的肺大叶（参见 图1D).
    1. 将金属导管的自由端插入动物口腔。旋转导管，使其自由端朝上，轻轻向前推进进入气管，同时以轻微扭转动作小心绕过喉部结构。通过用左手示指触诊气管环，并如图所示轻轻前后滑动导管数次，确认导管进入气管而非食管。 图1C.
    2. 当套管到达气管分叉处（即气管分为左、右支气管的位置）时，轻轻向动物左侧扭转，以确保套管插入左主支气管。推进金属套管，使其末端到达左肺长度的一半至四分之三处，并利用先前标记的参考刻度确认已达到适当深度。
    3. 金属套管就位后，将聚乙烯导管向前推进数毫米。利用导管上预先标记的参考线，确保其推进距离恰好足以从金属套管末端伸出，但不会刺穿肺组织。
  8. 双套管就位后，使用连接的注射器将100 µL（大鼠）或20 µL（小鼠）琼脂悬浮液注入左肺大叶深部（参见 图1D撤出数毫米的聚乙烯导管，然后轻柔地取出完整的插管装置。将其放回玻璃储存管中，并将动物转移至新的笼具中恢复。
  9. 继续对剩余动物进行麻醉、插管和接种。
    1. 在每批麻醉动物之间，将连接在管路末端的针头从注射器上取下。对于大鼠，将使用过的 disposable syringe 置于锐器盒中丢弃，并从水浴中的接种物中吸取新样本，填充一支新的无菌 disposable syringe。对于小鼠，使用第4.4节所述的填充技术，从水浴中的接种物中重新填充同一支玻璃微量注射器。
    2. 如果琼脂开始在插管装置中变稠，用液体将剩余的琼脂全部冲过管路。将针头从注射器上取下（保留针头连接在聚乙烯管路上）。按照第4.4节所述步骤，将温热的无菌生理盐水通过插管装置冲洗，必要时重复操作，直至完全清除堵塞。将注射器中的生理盐水排空，并按照第4.5节所述方法重新制备琼脂接种液。
    3. 根据生理盐水悬浮液测定的菌落形成单位（CFU）（见第2.3节）以及生理盐水悬浮液加入琼脂时的最终稀释倍数，计算每只动物的最终细菌接种量例如 十倍），以及注入动物体内的体积（例如 100 µL（大鼠）或 20 µL（小鼠）

5. 评估动物是否存在潜在的误接种或其他不良事件

  1. 在插管、琼脂接种及麻醉恢复期间，需仔细观察所有动物，以评估是否存在接种失误的可能。若动物出现出血、呼吸异常（如呼吸困难或喘息）、在笼内活动不正常，或麻醉恢复后精神状态不佳、眼睛无神等现象，应立即依据当地IACUC指南实施安乐死。
  2. 若发生自主呼吸停止（通常因接种物未注入足够深度而阻塞气道所致），应通过观察确认动物死亡，并实施二次安乐死方法（如颈椎脱位或开胸术）。
  3. 应尽量缩短动物暴露于异氟烷的时间，因为麻醉仅需维持数分钟以完成操作。若使用注射类麻醉剂，须持续观察动物直至其完全清醒。使用注射麻醉剂时，应将动物（尤其是小鼠）置于加温环境中恢复。
  4. 在研究期间，每天至少观察动物两次，注意是否存在以下呼吸道疾病症状：明显呼吸异常、竖毛、活动减少及体温降低。若动物处于濒死状态、出现呼吸困难或呼吸窘迫、触摸时发现体温明显下降、无法或不愿移动，或无法接触食物和饮水，应立即依据当地IACUC指南实施安乐死。

6. 给予测试处理

  1. 根据预定的研究设计配制并给予试验处理。在感染后1至2小时开始给药（若需要更高的基础细菌负荷，可进一步延迟给药时间）。由于试验处理的配制与给药方式取决于研究目的及各处理本身的特性，无法提供具体细节。（可参考图3作为示例。）
  2. 保留一组感染但未接受治疗的动物作为基线对照。在其他组开始治疗时，按照第7节所述步骤，测定这些动物肺部的细菌负荷量。
  3. 对于药代动力学/药效学（PK/PD）分析，应评估所给予的治疗药物在感染动物血液和/或组织中的药代动力学特征。具体的药代动力学研究方法不在本文讨论范围之内。

7. 计数肺部可存活细菌

  1. 在其他组开始治疗时，对一组未经处理的动物实施安乐死（基线），并在研究期结束时（通常为感染后24、48或96小时），对所有剩余动物通过密闭容器中逐渐升高浓度的二氧化碳吸入法，或按照当地IACUC指南推荐的替代方法实施安乐死。通过观察确认死亡，并实施二次安乐死方法（如颈椎脱位或开胸术）。
  2. 将动物仰卧置于干净的一次性垫上，并用酒精充分浸湿胸部区域的毛发。
  3. 使用无菌剪刀，沿胸骨平行方向剪开皮肤、下方肌肉层及肋骨，以打开胸腔。用无菌镊子轻轻夹住肺脏并拉出，必要时用剪刀将其与气管分离。将肺组织置于无菌纱布上，以吸收多余血液。若心脏已被取出，将其解剖分离并弃去。
  4. 用无菌剪刀在肺组织上剪出小切口以暴露内部区域，然后用无菌镊子将肺组织（包括任何意外剪下的碎片）放入实验室均质器袋底部。用粗圆物体（如笔或记号笔）在外壁轻轻滚动，压碎组织。用移液器向袋内加入1 mL无菌生理盐水，将袋子放入实验室均质器中，以高速运行2分钟。
  5. 使用移液器将均质化样品从混合袋中转移至离心管或培养板中。取1份均质液加入9份生理盐水进行10倍稀释（例如，将100 µL均质液加入900 µL生理盐水中）。以相同方式将所得悬液再次进行10倍稀释。继续对每一步新获得的悬液依次进行10倍系列稀释，直至从原始均质液起至少完成6次连续稀释。
  6. 从所有稀释液中分别吸取20 µL，每份做三个复孔，接种于添加绵羊血的胰蛋白酶大豆琼脂平板上肺炎链球菌（S. pneumoniae）、肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）、铜绿假单胞菌（P. aeruginosa） 或 A. baumannii）或接种到巧克力琼脂平板上（H. influenzae）。在37 °C下孵育过夜，可选择是否添加CO2。（参见 图1E （以展示最终培养板的一个示例。）
  7. 在三个重复样本中，计数第一个稀释度中含有的菌落数量 "可计数的" 数量（即 菌落数量不宜过多，以便能够合理计数。计算三个重复样本的平均值。将该平均值乘以50（因接种了1 mL匀浆液中的20 µL），再乘以原始匀浆液的最终稀释倍数，从而计算出每对肺组织的CFU数。

结果

所需的工具、动物的体位以及插管深度如图1所示。图中还展示了肺组织匀浆样本经连续稀释和三重涂布后，在琼脂平板上生长的典型菌落。大多数细菌分离株感染后即使在感染96小时时，仍可在肺组织中观察到较基线对照组高出数个log10 CFU的细菌负荷量，且动物间差异较小（图2）。对于某些H. influenzae菌株，菌落生长可能较少；但在48或96小时的时间范围内，感染不应开始自限性消退（图2B）。该肺部感染模型可用于先导化合物系列的优化，以支持构效关系（SAR）研究，如图3中两个不同系列代表性化合物所示16, 17。该模型为在免疫功能健全动物中评估药代动力学/药效学（PK/PD）提供了稳定且可重复的方法，并已用于确定游离药物浓度-时间曲线下面积与最低抑菌浓度之比（fAUC/MIC）与新型多肽脱甲酰基酶（PDF）抑制剂对S. pneumoniae和H. influenzae的疗效之间的相关性（图4）。此外，针对11株S. pneumoniae和5株H. influenzae分离株，确定了实现细菌生长抑制（stasis）及较基线对照组CFU降低1个log10的fAUC/MIC目标值（表1）18。将此感染模型与药物递送系统结合，可在大鼠中模拟人类药代动力学特征，从而成为临床研究前评估人类给药方案的有力工具。一个应用实例总结于表2，表明对于MIC值升高的病原体，阿莫西林-克拉维酸的缓释制剂比现有给药方案更有效19。

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图1： 非手术气管插管法。 图中展示了用于大鼠（A）和小鼠（B）的插管工具。麻醉后，若操作者为右利手，则应将动物按图C所示位置摆放，头部朝右，尾部朝左。用左手食指轻轻按压喉部，以触诊气管软骨环，确认导管位置正确。接种物应注入左肺深部，如大鼠肺脏腹面观所示（D）。样品经连续稀释并涂布于琼脂平板后，菌落生长情况应与图E所示相似。图1D，版权 © Gill Smith [《实验动物》，第25卷（1991年），G. Smith，《一种建立大鼠呼吸道感染的简单非手术支气管内灌注方法》，第46–49页]14。经许可转载。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图2： 感染动物肺部细菌生长的代表性示例。 显示了每组 N=5 只动物的平均值±标准差CFU数据，分别针对S. pneumoniae (A)、H. influenzae (B)、P. aeruginosa (C)、K. pneumoniae (D) 和 A. baumannii (E) 的不同分离株。每对柱状图中的第一根柱（浅灰色）表示感染后1或2小时的基线细菌负荷，第二根柱表示研究结束时的生长对照，分别为感染后48小时（深灰色）或96小时（黑色）。未采用任何数据删失方法，因此这些结果包含了每组全部5只动物的数据。请点击此处查看该图的放大版本。

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图3： 评估先导化合物优化过程中不同化学系列的效效 利用所述技术建立的肺部感染模型，用于研究非细菌性IIA型拓扑异构酶项目的构效关系。对喹诺酮类敏感的菌株，评估了有前景的化合物7和化合物1 （A）16 或喹诺酮耐药 （B）17 分离株 S. pneumoniae，分别。每个符号代表一只大鼠肺组织中测定的菌落形成单位（CFU），线条表示组均值及标准差。定量下限（LLQ）为1.7 log10 CFU/肺。将化合物称重（56 或 112 mg 纯游离母体分子），溶于 9 mL 无菌水中，取 3 mL 加入 3 mL 水中（1:1 稀释），按 1 mL/125 g 大鼠的剂量经口灌胃给药，每日两次（间隔 6–7 小时），持续 2 天，自感染后 1 小时开始给药。未治疗对照组（NTC）在感染后 1 小时取样以获取基线值，或以生理盐水处理并在研究结束时（48 小时）取样作为生长对照。图 3A 改编自 Bioorganic & 药物化学快报, 第21卷，T.J. Miles 等人， 新型环己基酰胺类化合物作为靶向细菌IIA型拓扑异构酶的强效抗菌剂，第7483–7488页，版权所有 (2011)16，经Elsevier许可。图3B重印自Bioorganic & 药物化学快报, 第26卷，T.J. Miles 等人， 新型三环类化合物（例如 GSK945237）作为细菌IIA型拓扑异构酶的强效抑制剂，第2464 - 2469页，版权所有 (2016)17，经Elsevier许可。 请点击此处以查看此图的放大版本。

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图4： 一种新型PDF抑制剂的药代动力学/药效学表征。 使用免疫功能正常的小鼠肺部感染 S. pneumoniae（A）或 H. influenzae（B）分离株后的剂量-效应数据建立Emax模型，以确定一种新型PDF抑制剂的药代动力学/药效学靶标18。圆圈表示每组4-5只小鼠在接受不同剂量化合物治疗后的平均细菌负荷。分析了疗效与游离药物24小时AUC（空心圆圈）或AUC/MIC（实心圆圈）之间的相关性。经美国微生物学会许可转载，版权所有 © [《抗菌药物与化疗》，第60卷，2016年，第180 - 189页]18。 请点击此处查看该图的放大版本。

静止期1-log10 减少
生物体MIC
(µg/mL)		拟合直线的
R2 (%)		fAUCfAUC/MICfAUCfAUC/MIC最大杀菌效果
(log10 减少)
S. pneumoniae
     101270.2599.92.08.13.614.42.8
     1316009S0.2596.16.526.015.160.31.8
     ATCC108130.51008.416.922.244.51.2
     1307007S195.816.116.120.120.12.7
     ATCC6303199.819.819.824.824.82.8
     1629210015.87.921.210.62.4
     298443299.926.513.231.015.52.3
     3368082868.24.219.09.52.6
     338860299.52.91.56.73.42.8
     340449294.68.04.014.97.42.1
     L1125921007.13.59.04.52.0
          平均值 ± 标准差NAaNA11.0 ± 7.511.0 ± 7.917.0 ± 8.219.5 ± 17.82.3 ± 0.5
          中位数NANA8.28.119.014.42.4
H. influenzae
     1998-100-126H199.77.37.313.413.42.9
     503-008H199.87.17.113.913.92.7
     08003H299.914.57.216.78.32.7
     H128296.615.37.626.013.02.7
     19001H491.914.83.737.39.33.0
          平均值 ± 标准差NANA11.8 ± 4.26.6 ± 1.621.5 ± 10.211.6 ± 2.62.8 ± 0.1
          中位数NANA14.57.216.713.02.7
a NA，不适用。

表1：一种新型PDF抑制剂针对S. pneumoniae和H. influenzae分离株的PK/PD靶标。在肺部感染并接受化合物治疗的免疫功能健全小鼠模型中，针对11株S. pneumoniae和5株H. influenzae，测定了游离药物AUC及AUC/MIC在细菌计数达到静态抑制以及较基线减少1-log10 CFU时的药效靶标值18。这些数据被用于指导临床开发中的人体剂量选择。本表格经美国微生物学会许可改编并重印，版权所有 © [《抗菌药物与化疗》，第60卷，2016年，第180–189页]18。

治疗组a平均对数10 S. pneumoniae (CFU/肺)b ± AMX/CA MIC 药敏试验的 SD
05010S
(2 µg/mL)		16001Sc
(4 µg/mL)		16001S
(4 µg/mL)		30005S
(4 µg/mL)		20009S
(4 µg/mL)		05003S
(8 µg/mL)		404053
(8 µg/mL)		47003S
(8 µg/mL)
对照7.3 ± 0.47.0 ± 0.85.7 ± 1.27.1 ± 0.77.1 ± 0.46.4 ± 0.66.8 ± 0.46.0 ± 0.3
AMX/CA
     2,000/125 mg 每日两次（比例 16:1）≤ 1.7**2.8 ± 1.2**2.2 ± 0.8**2.3 ± 0.9**2.5 ± 0.9**2.0 ± 0.9**3.8 ± 1.4**1.8 ± 0.2**
     1,000/125 毫克 每日三次（比例 8:1）NTNT2.8 ± 0.5**2.7 ± 1.3**3.3 ± 0.9**4.9 ± 0.5**6.6 ± 1.34.7 ± 0.7**
     875/125 mg 每日三次（比例 7:1）NTNT3.0 ± 1.3*2.1 ± 0.7**3.2 ± 0.4**5.2 ± 0.9*6.4 ± 0.64.9 ± 0.4**
     875/125 mg 每日两次（比例 7:1）NTNT4.5 ± 1.2*5.6 ± 1.3*5.2 ± 0.7**6.3 ± 0.76.4 ± 0.75.5 ± 0.4
     500/125 mg 每日三次（比例 4:1）3.1 ± 1.3**4.5 ± 0.9**NTNTNTNTNTNT
阿奇霉素，1,000/500 mg 每日一次NTNTNT5.8 ± 2.07.1 ± 0.93.1 ± 1.0**6.6 ± 0.46.0 ± 0.6
左氧氟沙星，500 mg 每日一次NTNT4.2 ± 0.8*5.7 ± 0.8*4.9 ± 0.8**3.0 ± 1.3**3.5 ± 0.2**3.9 ± 0.8**
治疗组d平均对数10 H. influenzae (CFU/肺) ± 菌株的标准差：
H128
(β-内酰胺酶阳性）		切斯特菲尔德
(ββ-内酰胺酶阴性，氨苄青霉素耐药
对照6.4 ± 0.66.7 ± 0.6
AMX/CA
     2,000/125 mg 每日两次（比例 16:1）2.0 ± 0.7**3.1 ± 0.9**
     1,000/125 毫克 每日三次（比例 8:1）2.1 ± 1.0**3.6 ± 1.1**
     875/125 mg 每日三次（比例 7:1）2.8 ± 1.3**3.8 ± 1.3**
     875/125 mg 每日两次（比例 7:1）2.0 ± 0.8**5.1 ± 1.1**
阿奇霉素，1,000/500 mg 每日一次3.2 ± 1.7*5.8 ± 1.1
左氧氟沙星，500 mg 每日一次≤ 1.7**≤ 1.7**
a AMX/CA，阿莫西林-克拉维酸；b.i.d.，每日两次；t.i.d.，每日三次；o.d.，每日一次。
b 检测限为 <1.7；*，与对照组相比显著不同（P ≤ 0.05）；**，与对照组相比显著不同（P ≤ 0.01）；NT，未检测。
c 菌株16001S在两个独立的实验中进行了测试。
d 阿莫西林-克拉维酸 500/125 mg（4:1）每日三次未针对该 H. influenzae 菌株

表2： 不同阿莫西林/克拉维酸给药方案下重建人血浆暴露谱的有效性 在肺部感染了分离株的免疫功能健全大鼠中生成的数据 S. pneumoniae 或 H. influenzae 使用该模型表明，阿莫西林-克拉维酸的增强制剂（2,000/125 mg，每日两次）对产酶水平升高的分离株的疗效优于标准给药方案 体外 易感性19此表格经改编并获准重印，版权所有 © 美国微生物学会，《抗菌剂与化疗》，第49卷，2005年，第908–915页19.

讨论

为成功重现该感染模型，应考虑以下额外建议：通过传代2-3次可增强新分离株的毒力 体内 在用于研究之前，冷冻细菌菌种应始终从原始培养物中制备 体内-衍生来源，尽量减少使用原始材料，并不建议重新冷冻或重复使用已解冻的储备液。使用近期从肺炎患者中分离的临床菌株，和/或在对数生长期制备培养物，也有助于提高感染建立的成功率。将菌液以五倍稀释后加入琼脂（例如 2 mL生理盐水悬浮液加入8 mL琼脂）可替代十倍稀释法以增加细菌接种量，且接种体积可根据动物体型大小进行调整（例如 每只动物通常接种 200 µL（用于 250 g 大鼠）。在将生理盐水菌悬液加入琼脂之前（即 在步骤2.3中，可通过目视检查、麦氏比浊标准或光密度测量来预测或估算细菌浓度。熟悉这些方法是有帮助的 体外 每株分离物在进行实验前的生长特性 体内 实验。保持生长和操作的一致性可对任何给定分离菌株的细菌密度进行最准确的估算。可根据需要采用与所述方法不同的标准微生物学方法，例如使用替代培养基和组织匀浆器，以制备接种物及对感染组织中的细菌进行计数。

强烈建议在实验前一天配制或融化琼脂，并将其置于设定为 50 °C 的独立水浴中过夜保存。这样可简化操作流程，并防止在感染时琼脂温度过高。41–42 °C 的温度能够在保持琼脂液态的同时，避免因温度过高而影响细菌的短期存活，达到良好的平衡。作为营养琼脂的一种可能替代品，某些实验已成功使用贵族琼脂（noble agar）。通常情况下，一管琼脂接种物足以完成整个实验（也推荐如此），但若需感染大量动物（e.g. 超过 60 只）或接种过程耗时超过 30–45 分钟，则可制备多管接种物。若需使用多管接种物，应在需要时再将生理盐水细菌悬液加入各管琼脂中。此举可降低细菌在接种前因长时间暴露于较高温度而导致存活率和/或适应性下降的风险。需要注意的是，使用多管接种物可能还需额外的动物随机化步骤。应尽可能使用同一批次的接种物完成所有动物的感染。建议根据当前对该技术的熟练程度，合理设计实验规模。

熟练的科研人员可在30秒内完成动物的插管和接种操作，每批次可接种5至6只动物。即 使用一支装满琼脂接种物的注射器）。对于初学者而言，操作速度至关重要，因为琼脂会开始凝固；然而，准确的接种物放置比速度更为重要。初始每批次可处理1至2只动物，随着技术熟练程度提高再逐步增加。动物在插管过程中仍保持呼吸，因此接种的时间窗口取决于动物从异氟烷麻醉中恢复的速度，通常约为2–3分钟。若动物在操作过程中苏醒，可重新麻醉并再次尝试，但不建议反复进行。一旦技术熟练，几乎100%的动物均可在首次尝试中成功接种。需注意，建议先使用大鼠学习该技术，因为小鼠更为脆弱，且若操作不够迅速，较小的工具更易因琼脂凝固而发生堵塞。预先将注射器、导管和生理盐水预热，并将插管装置置于温暖（非高温）表面（如调至低档的加热垫），有助于防止琼脂凝固。在学习该技术时，可先使用深色染料（如浓缩亚甲蓝）代替含细菌的琼脂悬浮液进行练习，以掌握正确的接种位置。操作步骤与正式实验相同，但在染料接种后立即实施安乐死（不使动物在麻醉与安乐死之间恢复）。随后解剖动物以确定染料分布位置，并据此调整操作技术。

该模型的主要终点指标是感染肺组织中的菌落形成单位（CFU）。生存率不能准确反映细菌负荷，不推荐作为终点指标。在药效学研究中，建议每组动物数量（N）为5至6只，因为该样本量预计可检测到≥1 log的差异。10 组间CFU差异具有至少90%的检验效能。动物可按笼分组感染，使同笼动物保持在一起，也可采用完全随机化分组方法。需注意，若按笼分配组别，则各组应以随机顺序进行感染，且末期生长对照组应在最后感染（以确认细菌存活能力/适应性未因在水浴中暴露于较高温度的时间延长而受到影响）。通常无需采用数据删失方法，也不建议使用，除非在研究开始时（任何处理实施前）发现明显接种错误的动物应立即剔除。在研究结束前实施安乐死的动物应进行取样，其结果应纳入数据集，除非事先已确定存在合理的排除依据。即 与感染或治疗无关的事件）。药物残留可能影响部分样本，这是在所有实验中都需要重点考虑的问题 在体 感染模型。如果一种化合物给药频繁，且接近安乐死时间点，或具有较长的半衰期，则可能在组织匀浆中以足够高的浓度存在，从而继续杀灭细菌 离体 在细菌计数过程中（样品稀释和涂布或在琼脂平板上过夜培养期间），应防止活性成分对细菌生长的抑制作用。为避免此问题，可在样品均质化前添加活性炭和/或能够降解活性分子但不损害细菌细胞的添加剂。其他方法包括离心样品以去除大部分活性化合物（该化合物应保留在上清液中），以及采用不同的稀释和涂布方案，将活性化合物充分稀释至无抑制浓度。

如图2所示，该模型可在啮齿类动物中成功诱导由多种病原体引起的肺部感染，包括那些在其他模型中生长不良的病原体（例如流感嗜血杆菌）。这些感染具有一致性和可重复性，从而降低了因模型失败或特定分离株在模型中表现不佳而需要重复实验的可能性。尽管动物具有完整的免疫功能，但它们无法快速清除感染，甚至完全无法清除。这使得研究周期的设置更具灵活性，因为许多分离株可在至少96小时内维持可存活的感染状态，而无需反复注射以维持中性粒细胞减少状态。既往已有研究指出，在免疫功能健全的动物中研究抗菌疗效具有潜在优势20, 21，并且有证据表明，对于某些化合物（例如噁唑烷酮类），来自非中性粒细胞减少型啮齿类动物的数据可能比中性粒细胞减少型动物更准确地预测人体暴露靶标5。该模型的多功能性在图3和图4以及表1和表2中得到了体现。这些研究是大量已发表和未发表数据的一部分，这些数据已利用该模型生成，用于支持先导化合物优化工作16, 17, 22-24、比较和验证拟定的人体给药方案19, 25-29，以及进行药代动力学/药效学（PK/PD）特征分析18, 30-32。尽管与经鼻吸入法相比，该模型初始操作较为复杂，但其具备上述诸多优势。通过练习和常规使用，相关技术操作将变得简便易行。

需要注意的是，在一些研究中，基线时的细菌负荷低于其他肺部感染模型通常设定的目标值。这在很大程度上是由于需要将细菌稀释至琼脂中以及攻毒体积较小，尤其是在小鼠中更为明显。然而，也应注意，即使初始细菌负荷相对较低，在所有情况下仍可观察到细菌增殖。目标基线细菌载量为6至6.5 log10 CFU/肺（6.8 至 7.3 log）10 基于小鼠平均肺重量的每克组织菌落形成单位（CFU/g），相当于重症肺炎患者中估计的细菌密度33较高的基线负荷可通过进一步浓缩细菌接种物或延迟化合物给药的起始时间以允许细菌更多生长来实现；然而，过度增加攻击负荷可能导致异常严重且急性的疾病即 24小时内死亡）且对所有抗菌治疗均不敏感，无论其药敏结果如何。尽管最初将接种物优先注入动物的左肺，但感染通常会扩散至双侧肺部。常可观察到进行性肺部疾病、细菌播散至其他器官以及最终出现病态。 肺炎链球菌，肺炎克雷伯菌 和 P. aeruginosa值得注意的是，感染与 H. influenzae 和 A. baumannii 通常局限性较强，在规定的细菌接种量下极少导致死亡。

该模型获得的疗效结果与 体外 敏感性谱型以及明确的药代动力学/药效学（PK/PD）靶标。对于被判定为对该受试药物敏感的菌株，通常可观察到细菌负荷的降低；而被判定为耐药的菌株则未见变化或出现超过基线水平的细菌生长。16, 17, 19, 24-29在大鼠中利用该模型评估两种喹诺酮类药物和一种大环内酯类药物的研究32 已表明，实现1-log的PK/PD目标所需10 减少 S. pneumoniae 与中性粒细胞减少小鼠中测定的目标相关，更重要的是，与社区获得性细菌性肺炎的临床目标相关6, 7, 34, 35. Gepotidacin是一种新型作用机制抗生素，已针对多种 S. pneumoniae 并需要达到相似的PK/PD目标以实现1-log的降低10 该肺部感染模型中的减轻31 相当于实现1-log所需的要求10 中性粒细胞减少性大腿模型中的减少36 当考虑肺部渗透性时（数据存档）。类似地，在小鼠中确定的GSK2251052的PK/PD靶值 P. aeruginosa 在停滞期、1-log 和 2-log 阶段结果一致10 该肺模型中CFU的减少30 以及在考虑肺部渗透时的中性粒细胞减少性大腿感染模型37, 38. 采用鼻内接种的中性粒细胞减少性肺部感染模型相关性较差；然而，在该研究中，GSK2251052并未产生超过抑菌效果的反应38这可能归因于较高的细菌接种量，即8 log10 每只小鼠的菌落形成单位（CFU）与6 log相比10 每只小鼠中性粒细胞减少性大腿中的菌落形成单位37 和经气管插管30 模型。此类数据的收集对于基准测试至关重要，因为它能够与现有模型进行直接比较，并与临床数据相关联，以评估其转化预测能力。更广泛地使用经气管插管肺部感染模型将为这类分析提供更多的数据支持。

该免疫活性肺炎模型存在若干局限性。首先，该模型不太适合用于评估自发耐药性的出现，因为此类研究通常需要较高的细菌接种量，而这会导致感染过于严重。在尝试使基线细菌负荷达到 7 或 8 log10 CFU 时，即使已彻底清洗接种物以去除预先存在的毒素（数据存档），仍观察到动物迅速出现病态（即 在不到 24 小时内进入濒死状态）。可能通过使用体型更大的啮齿类动物来克服这一问题。大鼠，尤其是体重较重的大鼠（> 250 g），相比小鼠更能耐受较高的接种量，可能更适合此类研究。第二个局限性在于，使用琼脂作为感染增强剂可能会限制该模型用于评估某些宿主与病原体之间的相互作用。据认为，琼脂可在肺部感染完全建立之前提供一个受保护的局部焦点。可通过将接种物悬浮于生理盐水而非琼脂中来尝试克服此问题；但需注意，这种方法仅对部分分离株能成功建立感染。第三，掌握该技术需要经历较陡峭的学习过程。该操作较为精细，尤其在小鼠中更为困难。金属套管容易误插入食管，而过度用力则可能导致食管或气管穿孔。接种物的准确放置也至关重要，否则动物可能无法恢复或感染不充分。然而，只要具备耐心和毅力，操作者完全能够熟练掌握该技术，并快速、流畅且准确地完成操作。

通过取消对中性粒细胞减少症的要求，提高实验的稳健性和可重复性，允许研究人员研究更多病原体和分离株，增强实验设计的灵活性，并为表征肺炎药物的药效学提供具有挑战性的感染模型，这种免疫功能健全的肺部感染模型为抗生素发现领域带来了重要价值。更多研究人员对该模型的进一步使用将有助于提供必要的基准数据，推动其获得更广泛的认可，并持续为科学合理的结果解读提供支持信息。

披露

所有作者均为葛兰素史克制药公司的带薪雇员，并持有该公司股票。

致谢

JH希望感谢导师、朋友兼前任主管Valerie Berry，是她首次向我们传授了该模型；同时感谢Gary Woodnutt，是他为我们奠定了抗菌药物药代动力学/药效学（PK/PD）领域的基础，并激励我们投身于这一研究领域。所有作者均感谢David Payne对我们科学研究的支持与认可。我们谨向我们的前任 体内 微生物学领域的同事们，他们为使用这些方法生成的数据做出了贡献，特别是Pete DeMarsh、Rob Straub、Roni Page和Nerissa Simon。最后，我们感谢我们的 体外 感谢微生物学领域的同行们提供的帮助，特别是为我们提供了所需的所有 MIC 数据（Lynn McCloskey、Josh West 和 Sharon Min）；同时感谢我们的临床微生物学团队所提供的专业建议与支持（Linda Miller、Nicole Scangarella-Oman 和 Deborah Butler）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
TSA II 胰蛋白酶大豆琼脂，含 5% 羊血贝克顿·迪金森公司4321261
巧克力II琼脂贝克顿·迪金森公司4321267
BBL 脑心浸液肉汤改良版Becton Dickinson and Company299070
含20%甘油的BBL胰蛋白酶大豆肉汤贝克顿·迪金森公司297808冻存菌种保存液
接种环Nunc251586
0.9% 氯化钠，USPBaxter Healthcare CorporationNDC 0338-0048-04
Difco 营养琼脂Becton Dickinson and Company213000
30 mL 离心管（带盖）EverGreen Scientific222-3530-G80
50 mL 聚丙烯锥形管 30 x 115 mmFalcon，康宁品牌352070
14 mL 聚丙烯圆底管 17 x 100 mmFalcon，康宁品牌352059
引导工具Intek Services LtdGT01大鼠专用定制金属套管
90' Portex 导管SAIPOR-080-100大鼠用塑料套管
1 mL TB 注射器滑动接头Becton Dickinson and Company309659
PrecisionGlide 针头 25 G x 5/8贝克顿·迪金森公司305122
动物喂食针 - 直型 20 x 3" 2-1/4Popper and Sons, Inc7903用于制作小鼠金属套管
Intramedic 聚乙烯导管Clay Adams 品牌 - Becton Dickinson 公司427401小鼠用塑料套管 
75 TN 5.0 µL 注射器 26s/2"/2Hamilton87930高效液相色谱玻璃注射器
Pyrex 试管，25x150 培养管，带螺帽及橡胶衬垫康宁9825-25对金属套管进行高压灭菌/储存
70% 异丙醇Vi-Jon（Swan）NDC 0869-0810-43
异氟烷，USPPiramal HealthcareNDC 66794-013-10
拍击式均质器 SewardStomacher80
Stomacher 80 classic 均质袋SewardBA6040
96孔圆底检测板Costar，康宁公司3795可选，用于系列稀释
血液 Omni 板哈代#A127可选的矩形血琼脂平板

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