我们已建立一种利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）系统纯化共调节相互作用蛋白的方法。
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方法文章
一种用于通过LC-MS/MS分析高通量鉴定与核辅因子相互作用蛋白的蛋白质制备方法
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本文内容
摘要
摘要
转录共调节因子对于核染色质结构的有效转录调控至关重要。共调节因子在调控转录过程中发挥多种作用，包括与转录因子直接相互作用、对组蛋白及其他蛋白质进行共价修饰，以及偶尔改变染色质构象。因此，建立相对快速的方法来鉴定在此调控网络中相互作用的蛋白质，对于深入理解其潜在的调控机制至关重要。基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的蛋白质结合伴侣鉴定是一种经过验证的用于分析蛋白质-蛋白质相互作用的技术。通过使用特异性抗体对已知的蛋白质复合物成员进行免疫沉淀（有时针对带标签的蛋白质使用相应抗体），即可利用质谱分析鉴定其未知的蛋白质相互作用伙伴。本文介绍了一种用于LC-MS/MS高通量鉴定核共调节因子及其结合伴侣之间蛋白质相互作用的样品制备方法。该方法有助于更深入地理解靶向核因子的转录调控机制。
引言
蛋白质-蛋白质相互作用在许多生物学功能中发挥着重要作用。因此，这些相互作用参与了信号转导、蛋白质跨细胞膜运输、细胞代谢以及多种细胞核过程，包括DNA复制、DNA损伤修复、重组和转录1,2,3,4。因此，鉴定参与这些相互作用的蛋白质对于深入理解这些细胞过程至关重要。
免疫沉淀（IP）是一种用于分析蛋白质-蛋白质相互作用的经过验证的技术。为了便于鉴定共免疫沉淀的蛋白质，通常会使用质谱分析5,6,7,8,9。通过使用抗体靶向蛋白质复合物中的已知成员，可以分离该蛋白质复合物，并随后通过质谱分析鉴定其未知组分。ARIP4（雄激素受体相互作用蛋白4）是一种转录共调节因子，能够以依赖于细胞环境的方式与核受体蛋白相互作用，从而激活或抑制其靶启动子9,10。为了更深入地理解调控这些核因子的转录调控机制，本文描述了一种利用LC-MS/MS系统纯化并鉴定ARIP4相互作用蛋白的综合性方法。
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方案
1. 转染
- 在100 mm培养皿中接种HEK293细胞（2 × 106 个细胞/皿）。使用添加10%胎牛血清、100 µg/ml 链霉素和100 单位/ml 青霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco's modified Eagle's medium）培养细胞。将细胞置于含5% CO2、37 °C的湿化培养箱中孵育。
- 次日，按照生产商说明书11，使用40 µl转染试剂将10 µg FLAG标签ARIP4质粒转染至细胞中。
2. 蛋白质提取
- 转染后约36小时，用预冷的PBS洗涤细胞，并用细胞刮收集细胞。将细胞转移至1.5 mL离心管中，在4 °C下以8,000 × g离心2分钟。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于体积为沉淀5倍的0.4 M KCl缓冲液中（高盐缓冲液：20 mM Tris-HCl (pH 8.0)、0.4 M KCl、5 mM MgCl2、10%甘油、0.1% NP-40、10 mM β-巯基乙醇、1×蛋白酶抑制剂混合物）。在4 °C下旋转孵育20分钟。
- 在4 °C下以17,700 × g离心10分钟。
- 将上清液（全细胞提取物）转移至新的2 mL离心管中，并加入初始体积3倍的0 M KCl缓冲液（稀释缓冲液：20 mM Tris-HCl (pH 8.0)、5 mM MgCl2、10%甘油、0.1% NP-40、10 mM β-巯基乙醇、1×蛋白酶抑制剂混合物）。
- 再次离心（17,700 × g，4 °C，10分钟），将上清液（全细胞提取物）转移至新的2 mL离心管中。
3. 免疫沉淀
- 在离心过程中（步骤2.4），用PBS、0.1 M甘氨酸-盐酸缓冲液和1 M Tris-盐酸缓冲液洗涤50 µl抗FLAG磁珠，随后用0.1 M KCl缓冲液（低盐缓冲液：20 mM Tris-HCl (pH 8.0)、0.1 M KCl、5 mM MgCl₂、10%甘油、0.1% NP-40、10 mM β-巯基乙醇、1×蛋白酶抑制剂混合物）洗涤两次。此洗涤过程的离心条件为4 °C下2,000 × g离心1分钟。
- 将50 µl FLAG磁珠与全细胞提取物混合，在2–4 °C下轻轻旋转孵育4小时（步骤2.4中获得的全细胞提取物应保留1%样品于-80 °C，以备后续作为输入样本使用）。
- 将样品转移至微型离心柱（重力滴落型），收集穿流液至1.5 ml离心管中，用液氮速冻后于-80 °C保存（通过Western blot分析检测输入样本和穿流液中的蛋白水平）。
- 加入1 ml 0.1 M KCl缓冲液（低盐缓冲液）洗涤FLAG磁珠（重力滴落型）。
- 重复步骤3.4至少四次（共完成五次洗涤）。
4. 洗脱
- 将柱放入1.5 ml离心管中，在2,000 × g条件下离心1分钟；珠子将变干。
- 封闭柱的底部。
- 加入50 µl（与FLAG珠体积相等）的0.1 M甘氨酸-盐酸（pH 2.5）。
- 室温下轻轻振荡混合10分钟。
- 将柱放入新的1.5 ml离心管中，在2,000 × g条件下离心1分钟。
- 用10 µl的1 M Tris-盐酸（pH 8.0）中和洗脱液；通过移液或涡旋振荡充分混匀。
5. 烷基化与胰蛋白酶消化
- 向混合物中加入 50 µl 100 mM NH4HCO3、10 µl CH3CN 和 2 µl 二硫苏糖醇（总体积为 112 µl）。
- 将样品在 56 °C 下孵育 30 分钟。
- 将样品置于室温下 10 分钟。
- 向样品中加入 10 µl 333 mM 碘乙酰胺，并在 37 °C 下避光孵育 30 分钟。
- 向混合物中加入 10 µl 胰蛋白酶（33 ng/µl），并在 37 °C 下孵育过夜。
6. 液相色谱-串联质谱分析
- 经过过夜胰蛋白酶消化后，将最终产物运送至液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测机构或第三方质谱实验室进行分析12。
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结果
我们鉴定出一个约160 KDa的强ARIP4信号，以及模拟样品对照和多个其他未知蛋白的信号（图1）。液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析鉴定了FLAG磁珠洗脱组分中的ARIP4复合物肽段及其潜在的肽类辅因子（表1）。已知的ARIP4辅因子p62（Sequestosome1）也在分析中被检出11（表1），这证实了该系统的有效性11。我们还鉴定出许多先前报道过的与ARIP4相互作用的蛋白。例如，通过LC-MS/MS分析检测到了Sumo210和DryK13。LC-MS/MS分析也鉴定出了ARIP4肽段，表明免疫沉淀（IP）具有高质量。总体而言，LC-MS/MS技术是一种强大的工具，可用于鉴定与蛋白质-蛋白质相互作用相关的未知核内事件。完整的质谱结果可应要求提供。
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讨论
高效的转染对于本实验方案获得成功结果至关重要。因此，我们建议使用蛋白质印迹（Western blot）分析来检测免疫沉淀的 FLAG 标签蛋白的表达水平。此步骤可使用户验证目标蛋白是否得到正确过表达，并进一步确认免疫沉淀（IP）实验是否成功完成。在进行质谱分析之前，也应检测 FLAG 标签蛋白的表达水平。
应使用模拟样品作为阴性对照，以避免获得假阳性结果，并区分背景信号与真实的相互作用。此外，在研究人类蛋白质时，实验应在相对洁净的环境中进行例如， 洁净室）以避免污染。尽管有时可使用高盐浓度（0.3–0.4 M）的蛋白提取缓冲液来提取核蛋白，但免疫沉淀（IP）实验中最常推荐使用盐浓度为0.1–0.15 M的IP缓冲液，以维持蛋白-蛋白相互作用的完整性。为进一步降低背景信号，可采用磁珠进行纯化。此外，优化细胞裂解条件对于减少假阳性结果也至关重要。
本研究所述方法相较于其他技术（例如基于凝胶消化的单一蛋白质鉴定）5,
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由代谢紊乱研究阿斯特拉斯基金会（HT）、武田科学基金会（HT）以及日本促进科学会青年科学家研究资助（B）项目（HT）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Lipofectamine 2000 转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物（无EDTA）（100倍浓缩液） | nacalai tesque | 03969-21 | |
| ANTI-FLAG M2 亲和凝胶 | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| 微型 Bio-Spin 层析柱 | BIO-RAD | 732-6204 |
参考文献
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重印与许可
