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方法文章

简约的力量：海胆胚胎作为 体内 用于研究复杂细胞间信号网络相互作用的发育模型

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DOI：

10.3791/55113

⸱

2017年2月16日

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Mississippi State University

本文内容

摘要

本视频文章详细介绍了一种简单直接的体内方法，可用于系统且高效地表征多种无脊椎动物胚胎中复杂信号通路和调控网络的组分。

摘要

在胚胎发育过程中，仅需极少数的细胞间信号转导通路即可产生成体形态中丰富多样的细胞类型和组织。然而，每年都有越来越多的信号通路组分被发现，研究也表明，根据具体生物学背景，大多数通路之间存在显著的交叉对话。这种复杂性使得在任何体内发育模型系统中研究细胞间信号传导都成为一项艰巨的任务。此外，要对通过新一代差异筛选技术产生的大规模数据集中鉴定出的信号通路相关分子进行有效功能分析，也提出了更高的要求。本文介绍了一种简便高效的方法，用于快速鉴定海胆胚胎中调控细胞命运决定和体轴特化的信号转导通路组分。与海胆类似的胚胎在基因组和形态结构上均较为简单，是研究复杂信号相互作用的强大体内发育模型。本文所述的方法可作为通用模板，用于在其他多种生物中鉴定各个信号通路中的新信号转导分子，以及不同通路分子之间的相互作用。

引言

基因调控网络（GRNs）和信号转导通路在胚胎发育过程中建立了基因在时空上的表达模式，这些表达模式用于构建成年动物的身体结构。细胞间的信号转导通路是这些调控网络的重要组成部分，提供了细胞间通信的机制。这些细胞相互作用在胚胎发生过程中建立并精细调控各个区域中调控基因和分化基因的表达1,2。分泌型胞外调节因子（配体、拮抗剂）、受体以及共受体之间的相互作用控制着信号转导通路的活性。一系列胞内分子将这些信号进行转导，最终导致细胞的基因表达、分裂和/或形态发生变化。尽管目前已知主要信号通路在胞外和胞内水平所涉及的许多关键分子，但由于各条信号通路本身的复杂性，相关知识仍不完整。此外，不同的信号通路在胞外、胞内以及转录水平上常常以正向或负向的方式相互作用3,4,5,6。重要的是，信号转导通路的核心组分在所有后生动物物种中高度保守，尤其值得注意的是，当比较亲缘关系较近的门类生物时，大多数主要信号通路在多种物种中往往执行相似的发育功能7,8,9,10,11。

在任何生物体中研究发育过程中的信号传导都是一项艰巨的任务，而在大多数后口动物模型（脊椎动物、无脊椎脊索动物、半索动物和棘皮动物）中研究信号通路还面临若干重大挑战：1） 由于基因组复杂性，脊椎动物中可能存在大量配体与受体/共调节因子的相互作用、细胞内转导分子，以及不同信号通路之间的潜在相互作用12,13,14；2） 脊椎动物复杂的形态结构和形态发生运动常常使得信号转导通路内部及之间的功能相互作用更难解析；3） 除部分尾索动物物种外，大多数非棘皮动物的无脊椎后口动物模式物种的研究受限于短暂的繁殖期15,16。

海胆胚胎几乎不存在上述限制，并为深入分析信号转导通路提供了多种独特优势 体内包括以下内容： 1) 海胆基因组的相对简单性显著减少了配体、受体/共受体以及细胞内转导分子之间可能的相互作用数量17; 2) 控制生殖层及胚胎主要轴向特化与图式形成的基因调控网络（GRNs）在海胆胚胎中已得到充分确立，有助于理解接收信号的细胞/区域所处的调控环境18,19; 3) 在胚胎发育的早期卵裂至原肠胚阶段，胚胎由单层上皮构成，其形态更易于分析，因此许多信号转导通路可在这一时期进行研究； 4) 海胆信号通路中涉及的分子易于操控； 5) 许多海胆每年有10到11个月处于怀卵期（例如：Strongylocentrotus purpuratus 和 Lytechinus variegatus).

本文介绍了一种系统且高效地表征海胆胚胎中决定和模式化区域的信号通路组分的方法，以说明多种无脊椎动物模型系统在研究复杂分子机制方面所具有的优势。

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方案

1. 高通量 Morpholino 设计策略

  1. 确定感兴趣的基因例如 候选基因方法、顺式调控分析、RNA测序和/或蛋白质组差异筛选
  2. 利用频繁更新的网站上提供的基因组、转录组和基因表达数据（例如 SpBase http://www.echinobase.org​20 和 S. purpuratus 基因组搜索（http:///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index.html）以确定 时空表达模式与所研究的发育机制相重叠。 若无表达数据可用，则设计qPCR引物和/或反义链 原位 探针用于评估基因表达模式。
  3. 在确定时空表达模式后，从基因组网站获取DNA序列。
    1. 为生成翻译阻断型吗啉代寡核苷酸，可从 SpBase 或其他表达序列标签（EST）数据库中获取起始密码子正上游的 5' 非翻译区（5' UTR）序列 S. purpuratus 基因组搜索网站。如果目标基因的该信息不可用，则进行5' RACE。
    2. 使用 SpBase 中的 scaffold blastn 工具搜索包含外显子和内含子的基因组序列，以设计剪接阻断型吗啉代寡核苷酸。 S. purpuratus 基因组搜索工具
  4. 使用寡核苷酸设计网站 http://oligodesign.gene-tools.com 设计所需的25个碱基对的吗啉代序列。
    1. 对于翻译阻断型吗啉代寡核苷酸，应使用从5'到3'方向的mRNA序列作为翻译靶序列的来源。该序列需包含5'非翻译区（5' UTR）序列（转录起始位点上游约70个核苷酸）以及编码区的25个碱基（位于起始位点下游），起始密码子用括号标注（ATG）。
    2. 对于剪接阻断型吗啉代寡核苷酸，应选择内含子-外显子或外显子-内含子边界序列，并包含边界区域两侧各50个碱基（即外显子序列25个碱基和内含子序列25个碱基）。使用该吗啉代序列对基因组进行扫描，以确认该序列具有唯一性。

2. 形态学寡核苷酸的显微注射

  1. 通过将 100 µL 无核酸酶水加入 300 nmol 的吗啉代寡核苷酸小瓶中，制备 3 mM 的吗啉代寡核苷酸储备液。
    注意：请勿使用经 DEPC 处理的水进行重悬，因为焦碳酸二乙酯可能损伤吗啉代寡核苷酸。
  2. 首次重悬时，将含有储备寡核苷酸溶液的小瓶在最大转速（14,000 - 16,000 ×g）下离心 30 秒，短暂涡旋混匀，于 65 °C 加热 5 至 10 分钟，再次短暂涡旋，然后将吗啉代储备液在室温下静置至少 1 小时。吗啉代储备液可保存在 -20 °C 至 +4 °C 条件下。
  3. 制备含有目标浓度吗啉代寡核苷酸的注射溶液。该溶液通常包含 20% 甘油或 125 mM KCl 作为载体，并含有 15% FITC-葡聚糖（异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖，分子量 10,000，储备液浓度为 2.5 mg/μL）。FITC-葡聚糖及其他荧光标记葡聚糖偶联物通常用于通过落射荧光显微镜识别已注射的胚胎。注射溶液应储存在 -20 °C。
  4. 将吗啉代溶液置于金属浴或水浴中，在 65 °C 加热至少 2 至 5 分钟。
  5. 将吗啉代溶液在最大转速（14,000 - 16,000 ×g）下短暂离心 30 秒，涡旋 1 分钟，再于最大转速（14,000 - 16,000 ×g）离心至少 10 分钟。
  6. 用吗啉代溶液填充注射针。有关详细的显微注射方案，请参见 Stepicheva 和 Song，201421 以及 Cheers 和 Ettensohn，200422。

3. 固定与 原位 受精后24小时（hpf）的实验方案 S. purpuratus 胚胎

注意：本方案修改自 Arenas-Mena 等，200023 以及 Sethi 等，201424。

  1. 固定
    1. 向含有胚胎的孔中加入数滴固定剂（见下文），用移液器轻轻吹打混匀，静置使其沉降。移除固定剂溶液，再用两份额外的180 µL固定剂洗涤并混匀胚胎。
      注意：在洗涤过程中，必须通过轻柔地上下吹打数次，充分混匀胚胎。 未能这样做可能会降低信噪比。
    2. 将胚胎置于第二轮固定液中，在室温（RT）下固定50分钟至1小时，固定液成分为4%电子显微镜级多聚甲醛，包含10 mM MOPS（pH 7.0）、0.1% Tween-20及人工海水（ASW）。为获得最佳效果，每次均需新鲜配制该溶液。此外，为操作简便和实用起见，胚胎可在96孔板中进行固定。
      1. 对于20 mL固定液，使用5 mL 16%多聚甲醛、15 mL人工海水（ASW）、200 µL 1 M MOPS（pH 7.0）和20 µL Tween-20。
    3. 在室温下用 180 µL MOPS 洗涤缓冲液（含 0.1 M MOPS pH 7.0、0.5 M NaCl 和 0.1% Tween-20）洗涤 5 次，每次至少 5 分钟，或直至胚胎沉降至孔底。每次洗涤时，务必通过轻柔吹打数次，将胚胎充分混匀于洗涤缓冲液中。MOPS 洗涤缓冲液若置于 4 ℃ 保存，可使用 2 天。 °C
      1. 40 mL MOPS 洗涤缓冲液使用 4 mL 1 M MOPS pH 7.0、4 mL 5 M NaCl、32 mL dH₂O2O 和 40 µL Tween-20。
      2. 固定后的胚胎可在4℃保存 o2天
        注意：若需长期储存固定后的胚胎，可在MOPS洗涤缓冲液中添加0.2%叠氮化钠，以防止细菌生长。
  2. 预杂交
    1. 吸去 MOPS 洗涤缓冲液，加入 180 μL MOPS 洗涤缓冲液与杂交缓冲液按 2:1 比例配制的混合液，轻轻吹打数次使胚胎混入溶液中，于室温孵育至少 20 分钟。杂交缓冲液成分为 70% 甲酰胺、0.1 M MOPS（pH 7.0）、0.5 M NaCl、1 mg/mL BSA 和 0.1% Tween-20。
      1. 对于40 mL杂交缓冲液，使用4 mL 1 M MOPS pH 7.0、4 mL 5 M NaCl、4 mL dH₂O2O、0.04 g BSA 和 40 µL Tween-20。涡旋充分混匀，加入 28 mL 甲酰胺，再次涡旋。
    2. 移除MOPS洗涤缓冲液与杂交缓冲液的2:1混合液，加入180 µL MOPS洗涤缓冲液与杂交缓冲液按1:2比例配制的混合液，将胚胎混入该溶液中，在室温下孵育至少20分钟。
    3. 在探针杂交前，将胚胎轻轻混入100–150 µL杂交缓冲液中。50 °C孵育胚胎至少1小时。
      注意：胚胎过夜孵育是可接受的。孵育前，使用粘性封板膜密封孔板，以防止蒸发。
  3. 杂交
    1. 在另一管中，向杂交缓冲液中加入 0.1–0.3 ng/µL 探针和 500 µg/mL 酵母 tRNA，轻轻涡旋混匀，制成探针溶液。添加酵母 tRNA 的目的是减少反义探针的非特异性结合。将该溶液预热至 50 °C，随后吸除杂交缓冲液。
    2. 将预杂交的胚胎加入100 µL探针溶液中，用粘性封膜密封，在50 °C下杂交2至7天（根据探针而定） foxq2 探针可孵育2天.
      注意：孵育时间根据探针的不同而有所变化。某些低水平表达的基因需要长达7天的孵育时间。若密封膜未能有效密封，可将96孔板置于湿盒中，以防止蒸发。
    3. 在50 °C下用180 μL新配制的MOPS洗涤缓冲液洗涤5次，共计3小时。随后在室温下用180 μL MOPS洗涤缓冲液洗涤3次，每次15分钟。每次洗涤时需通过轻柔吹打数次，将胚胎充分混入洗涤缓冲液中。
  4. 抗体孵育
    1. 吸去 MOPS 洗涤缓冲液，将胚胎重悬于 180 µL 封闭缓冲液中，封闭缓冲液组成为含 10% 正常羊血清和 5 mg/mL BSA 的 MOPS 洗涤缓冲液，室温孵育至少 45 分钟，或 4 °C 过夜。
    2. 移除封闭缓冲液，然后将胚胎加入含有碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体的封闭缓冲液中，抗体稀释比例为1:1,500。在密封的培养板中室温孵育过夜，以避免蒸发。注意：抗体孵育时间不得超过过夜。
    3. 在室温下用 MOPS 洗涤缓冲液洗涤胚胎 6 次（每次 5 分钟或直至胚胎沉降）。胚胎可在 4 °C 下保存过夜。
  5. 原位发育
    1. 在室温下用新鲜配制的pH 9.5缓冲液（含0.1 M Tris pH 9.5、100 mM NaCl、50 mM MgCl）洗涤胚胎3次，每次10分钟2，1 mM 左旋咪唑，以及 0.1% 吐温-20。
      1. 配制 20 mL pH 9.5 缓冲液，使用 2 mL 1 M Tris pH 9.5、400 µL 5 M NaCl 和 1 mL 1 M MgCl₂2，20 µL Tween-20，16.6 mL dH₂O2O，以及0.0048 g 左旋咪唑。
    2. 在避光条件下，将胚胎置于37 °C的染色缓冲液中孵育。染色缓冲液的成分为：10% 二甲基甲酰胺、4.5 µL/mL 4-硝基蓝四氮唑氯化物（NBT）和3.5 µL/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐（BCIP），溶于新配制的pH 9.5缓冲液中。
      1. 每1 mL染色缓冲液使用100 µL二甲基甲酰胺、4.5 µL NBT和3.5 µL BCIP。
    3. 通过在 MOPS 洗涤缓冲液中清洗 3 至 5 次，终止碱性磷酸酶反应。该反应与 foxq2 探针孵育通常需要30分钟至1小时。某些探针可能需要在室温或4 °C下过夜孵育。
    4. 将胚胎混入70% MOPS洗涤液和30%甘油的溶液中。甘油可提供显微镜观察所需的折射率。胚胎可在该溶液中保存数周。用塑料石蜡密封培养板，防止蒸发。
  6. 载玻片制备与图像采集
    1. 在载玻片上用三小条双面胶带排列成三角形，胶带之间留有小间隙，制备成载玻片样品。
    2. 将胚胎转移至三角区域中央的70% MOPS洗涤液和30%甘油溶液中，并加盖盖玻片。
    3. 用指甲油在盖玻片边缘涂一圈以封固盖玻片。
    4. 使用配备20倍物镜和连接相机的复式光学显微镜拍摄图像。

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结果

在海胆胚胎中，我们已证明3种不同的Wnt信号通路分支（Wnt/β-catenin、Wnt/JNK和Wnt/PKC）4,25 相互作用，形成调控胚胎前后轴（AP）模式形成的Wnt信号网络。这些信号事件最重要的结果之一是：最初广泛表达的前部神经外胚层（ANE）基因调控网络（GRN）在原肠作用开始时（在 S. purpuratus 中为24 hpf）被限制于前极周围的一个小区域。这些结果表明，Wnt/β-catenin信号通路在32细胞期即可阻止ANE基因在胚胎后半部的激活。随后，该通路将信号传递给非经典Wnt/JNK信号通路，从而在60细胞期至原肠作用早期之间逐步下调胚胎前半部的ANE GRN。最后，第三条非经典Wnt通路Wnt/PKC拮抗Wnt/JNK信号通路，防止其消除前极周围的ANE特化（图1A）4。

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讨论

本文所述方法是一个范例，展示了利用基因组和形态复杂性低于脊椎动物的胚胎来研究调控基本发育机制的信号转导通路和基因调控网络（GRNs）的强大优势。许多实验室在海胆早期发育过程中采用类似的实验方法，以解析参与其他细胞命运决定事件的信号通路（例如 Notch、Hedgehog、TGF-β 和 FGF 信号通路）27,28,29,30,31。这些海胆研究揭示了许多有趣且新颖的信号机制，而这些调控海胆早期发育的信号机制在后口动物中似乎具有保守性9,27,30,31<...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 Robert Angerer 博士对本文稿的仔细审阅和编辑。本项目得到了美国国立卫生研究院（NIH R15HD088272-01）以及密西西比州立大学研究与发展办公室和生物科学系对 RCR 的资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
翻译阻断型吗啉代寡核苷酸和/或剪接阻断型吗啉代寡核苷酸Gene Tools LLC定制更多信息请访问 www.gene-tools.com
甘油Invitrogen15514-011
荧光素异硫氰酸酯（FITC，荧光素标记的葡聚糖）Invitrogen, Life TechnologiesD1821配制 25 mg/mL 储存液
16% 电镜级多聚甲醛溶液Electron Microscopy Sciences15710
MOPSSigma AldrichM1254-250G
吐温-20Sigma Aldrich23336-0010
甲酰胺Sigma Aldrich47671-1L-F
酵母tRNAInvitrogen15401-029
正常山羊血清Sigma AldrichG9023-10mL
碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体Roche11 093 274 910
盐酸四咪唑（左旋咪唑）Sigma AldrichL9756-5G
超纯Tris碱Research Products Internationall Corp56-40-6
氯化钠Fisher ScientificBP358-10
氯化镁Sigma Aldrich7786-30-3
BCIP（5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐）Roche11 383 221 001
4-硝基蓝四氮唑氯化物（NBT）Roche11 383 213 001
二甲基甲酰胺Sigma AldrichD4551-500mL
氯化钾Sigma AldrichP9541-5KG
碳酸氢钠Sigma AldrichS5761-500G
硫酸镁Sigma AldrichM7506-2KG
氯化钙Sigma AldrichC1016-500G

参考文献

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