脂肪来源的基质细胞可能适用于利用患者自体细胞构建新组织。本文介绍一种分离具有增强成骨潜能的人脂肪来源基质细胞（ASCs）亚群的实验方案，随后将这些细胞应用于 体内 颅骨愈合实验
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摘要
摘要
侵袭性癌症、严重创伤和感染可能导致骨缺损，其尺寸过大，无法利用患者自体现有的骨骼进行重建。体外生长骨组织的能力 从头合成 使用患者自身的细胞可利用充足的组织修复骨缺损，同时避免取用自体骨组织所带来的并发症。人们关注将脂肪来源的基质细胞（ASCs）作为组织工程的细胞来源，因为这些细胞可从患者自身的脂肪组织中大量获取。然而，ASCs 是一类异质性细胞群体，其中某些亚群在此类应用中可能比其他亚群更具效能。分离出成骨能力最强的 ASCs 亚群，有望提高骨组织工程过程的效率与效果。本方案中，ASCs 来源于人类供体的皮下脂肪组织。通过流式细胞术（FACS）分离出表达 BMPR-IB 标记物的 ASCs 亚群。随后将这些细胞应用于 体内 颅骨缺损修复实验显示，这些细胞与未分选细胞相比，具有增强的成骨再生潜能。
引言
由于创伤、感染或侵袭性癌症导致的大段骨缺损，对患者的康复和生活质量具有显著影响。现有技术可利用患者自体其他部位的健康骨骼来填充这些缺损，但这种移植方式本身会带来并发症风险和额外的病损负担1,2,3。此外，某些缺损过大或结构过于复杂，难以获得足够的供体骨进行填充。假体装置是填充骨缺损的另一种潜在选择，但其存在多种缺点，包括感染风险、假体材料失效以及异物反应等4。
基于这些原因，人们高度关注利用患者自体细胞构建生物性骨替代材料的可能性5。脂肪来源的基质细胞（ASCs）在这一应用中具有潜力，因为它们在患者自身的脂肪组织中来源丰富，并已被证明能够通过生成新的骨组织来修复骨缺损6,7。ASCs 是一类异质性的细胞群体，多项研究表明，筛选特定的细胞表面标志物可获得成骨活性增强的细胞群体8,9。选择成骨潜能最高的 ASCs 将提高接种了这些细胞的支架材料成功再生大段骨缺损的可能性。
骨形态发生蛋白（BMP）信号通路对于调控骨分化和骨形成至关重要10 且已知骨形态发生蛋白受体IB型（BMPR-IB）在ASCs的成骨分化过程中具有重要作用11最近，我们已证明BMPR-IB的表达可用于筛选具有增强成骨活性的ASCs12在此，我们展示了一种从人脂肪组织中分离表达BMPR-IB的脂肪源性干细胞（ASCs）的实验方案，随后通过一项成骨活性检测对其进行功能分析，该检测采用一种 体内 颅骨缺损模型
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方案
注意：样本取自已签署知情同意书的患者。所有实验方案均已通过斯坦福大学机构审查委员会的审查和批准。 处理人体组织和细胞时，必须始终遵守所在机构规定的生物安全二级（BSL2）防护措施。
1. 试剂的准备
- 配制FACS缓冲液：将10 mL胎牛血清（FBS）、5 mL泊洛沙姆188（Poloxamer 188）和5 mL青霉素-链霉素（Pen-Strep）加入500 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中。
- 配制消化液：将0.375 g C. hemolyticum II型胶原酶粉末和5 mL泊洛沙姆188（Poloxamer 188）加入500 mL无菌199/EBSS培养基中。
- 配制标准培养基：将50 mL胎牛血清（FBS）和5 mL青霉素-链霉素（Pen-Strep）加入500 mL杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium）中。
2. 获取与分离脂肪来源干细胞（ASCs）
注意：确保已获得使用人体组织和分离人体干细胞所需的充分机构批准。从接受择期吸脂手术的健康供体获取腹部、侧腹或大腿皮下脂肪。将脂肪保存在塑料吸脂罐中。
- 按1:1比例向原始塑料罐中的脂肪中加入无菌PBS。（若脂肪体积为500 mL，则加入500 mL PBS）。轻轻振荡混合30秒。静置使水相层沉降至底部（图1），然后使用连接负压装置的10 mL塑料移液管吸除并弃去水相层。
- 将脂肪倾入一个较大的塑料容器中，并按1:1比例加入消化液混合物。盖紧容器，用70%乙醇擦拭外表面，再用石蜡膜密封瓶盖。
- 将该容器置于37 °C、180 rpm的旋转摇床上振荡30分钟。
- 按1:1比例加入标准培养基以中和消化反应。（若脂肪混合物体积为1,000 mL，则加入1,000 mL标准培养基）。
- 将混合物等量分装至若干个250 mL塑料锥形离心管中（确保管数为偶数），在4 °C条件下以300 × g离心20分钟。
- 吸除上清液，注意保持沉淀完整。每根锥形管中的沉淀用5 mL标准培养基重悬。
- 将悬液通过100微米滤膜过滤至一个50 mL锥形离心管中，随后在4 °C条件下以300 × g离心15分钟。
- 吸除上清液，将沉淀用5 mL室温红细胞裂解缓冲液重悬。室温静置5分钟后，在室温（RT）条件下以300 × g离心15分钟。
- 吸除上清液，将沉淀用15 mL标准培养基重悬。再次通过100微米滤膜过滤至一个50 mL锥形离心管中。
- 在新的50 mL锥形管中加入15 mL用于密度梯度分离的多糖溶液（见试剂列表）。将管子倾斜45°角，小心地将细胞悬液沿管壁缓慢加入，使细胞悬液轻柔地覆盖在多糖溶液表面（图2）。
注意：必须将细胞加入溶液表面。切勿将多糖溶液加入细胞悬液中，否则会形成不可逆的混合物。同样，切勿将细胞直接加入多糖溶液中心。 - 在室温下以300 × g离心10分钟。此步骤使用低加速度（10档中的2–3档），并将离心机刹车功能设为零。
注意：此时可见三层：底部透明，中间浑浊，顶部呈鲑鱼色。目标细胞位于中间层。 - 使用10 mL移液管小心吸取中间层，并转移至新的50 mL锥形离心管中。
注意：宁可将中间层完全转移并带入部分上下层，也不应残留任何中间层。 - 使用血细胞计数板对细胞进行计数，并确定总活细胞数。
注意：通常将台盼蓝加入细胞混合物中，终浓度为0.8%，以辅助细胞计数。活细胞不会摄取蓝色染料，呈白色。
3. BMPR-IB 阳性细胞的流式细胞分选及含细胞支架的制备
- 在 4 °C 条件下，以 300 × g 离心细胞悬液 5 分钟。根据步骤 2.13 的细胞计数结果，将细胞重悬于 FACS 缓冲液中，浓度为每 100 µL 含 100 万个细胞。
- 转移至少1000万个细胞至已标记的塑料离心管中 "BMPR-IB" 分别将一百万个细胞转移至已标记的单独塑料离心管中，管中含100 µL FACS缓冲液 "未染色。" 加入1 mL FACS缓冲液至 "未染色" 离心管。在进行实验的FACS分选步骤时，将剩余细胞置于冰上并用FACS缓冲液保存。标记这些细胞 "未分类。" 在后续实验中将这些用作对照。
- 加入适量荧光标记的抗人BMPR-IB抗体 "BMPR-IB" 根据制造商说明书将混合物加入管中。轻轻吹打混匀，使抗体均匀分布。
注意：我们使用人BMPR-IB/ALK-6 APC标记抗体，稀释比例为1:10（详见试剂列表）。然而，不同生产商的抗体其推荐使用浓度可能有所不同。 - 用避光材料覆盖冰桶。将细胞与抗体混合物置于冰上避光孵育30分钟（或根据抗体生产商的说明进行操作）。
注意：如果抗BMPR-IB抗体为需二抗的未标记一抗，则根据生产商说明书，在冰上进行单独的二抗染色步骤。 - 将两个离心管在 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟。小心吸去上清液，避免吸到沉淀。用 1 mL FACS 缓冲液重悬沉淀的细胞。再次在 300 × g 下离心 5 分钟。小心吸去上清液，并将细胞重悬于 FACS 缓冲液中，调整细胞浓度至每 1 mL 含 100 万个细胞。
- 过滤 "BMPR-IB" "未染色，" 和 "未分类" 通过40微米细胞滤网将细胞过滤至新标记的玻璃FACS管中。用500 μL FACS缓冲液冲洗滤网，确保无细胞残留在滤网中。另取两支分别标记的塑料离心管，各加入2 mL标准培养基 "BMPR-IB阳性" 和 "BMPR-IB 阴性" 使用这两个选项在FACS仪器中收集分选后的细胞。
- 在流式细胞仪上，使用未染色的细胞设定荧光标记的阴性门。
- 使用100微米喷嘴，将BMPR-IB阳性与阴性细胞分选至分别装有标准培养基的离心管中。若流式细胞分选仪具备此功能，分选过程中应将离心管保持在4 °C低温环境中。
注意：请参阅 JOVE 文章13 由 Sharon 等 有关FACS分选的优秀实验方案。 - 使用血细胞计数板对每根试管中的细胞进行计数。离心 "BMPR-IB阳性，" "BMPR-IB阴性，" 和 "未分类" 在4 °C、300 × g条件下离心5分钟，小心吸去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。随后将细胞重悬于标准培养基中，调整浓度至每250 µL含100万个细胞。
- 获取预先切割的4 mm聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）支架，该支架经羟基磷灰石涂层处理。将每个支架放入24孔板的一个孔中，并用50 µL细胞悬液覆盖每个支架（i即每组200,000个细胞：未分选组、BMPR-IB阳性组和BMPR-IB阴性组（图3).
注意：请参阅 JOVE 文章14 由 Lo 等 有关PLGA支架构建的详细信息。 - 将周围空置的孔部分填充标准培养基（以防止支架干燥），盖上培养板盖，于37°C细胞培养箱中孵育30分钟。
4. 颅骨缺损的制备及含 ACS 支架材料的应用
注意：确保已获得机构批准，允许在活体小鼠中创建颅骨缺损。本方案已获得斯坦福大学动物护理与使用委员会的批准。
- 使用吸入式异氟烷气体或注射长效麻醉混合剂对 CD-1 裸鼠进行麻醉。
- 仅使用气体麻醉时，将小鼠放入麻醉舱内，以2–3 L/min的流速输送含2%异氟烷的氧气。待小鼠完全失去意识后，将其腹侧向下置于循环温水加热毯上 用吸水垫包裹，并将其口鼻部放入含有相同浓度氧气和异氟烷的麻醉鼻罩中。密切监测呼吸频率，并根据需要调整异氟烷浓度。
- 使用注射型长效麻醉混合物时，按照上述方法将小鼠置于麻醉舱内进行麻醉，随后注射麻醉混合物。将小鼠从麻醉舱中取出，并观察其行为表现。
注意：小鼠可能会短暂地从麻醉状态中苏醒，但在数分钟内应再次因注射的麻醉剂作用而完全进入麻醉状态。将小鼠转移至循环温水加热垫上 用吸水垫覆盖。
注意： 推荐使用含有氯胺酮（10 mg/mL）和赛拉嗪（1 mg/mL）的生理盐水混合液作为麻醉剂鸡尾酒，通过腹腔注射给药。该混合液的标准剂量为每30 g小鼠注射300 µL，相当于氯胺酮100 mg/kg和赛拉嗪10 mg/kg。有关注射用麻醉剂的更多细节，请参见讨论部分。 - 使用脚趾捏压法评估麻醉深度。麻醉充分的小鼠在被术者轻轻捏压脚趾时不会回缩足部。
- 涂抹眼膏以防止角膜干燥。
- 皮下注射1 mg/kg缓释布托啡诺。
注意：手术前给予镇痛药物可获得更佳的镇痛效果。 - 在整个操作过程中，监测小鼠的呼吸频率。
注意：在异氟烷麻醉下，小鼠的正常呼吸频率应为50 - 100次/分钟。呼吸频率升高提示麻醉过浅，而呼吸频率降低则可能提示麻醉过深。
- 用聚维酮碘溶液对颅骨背侧皮肤进行三次消毒，每次随后使用70%乙醇。用无菌手术巾覆盖周围区域，仅暴露手术部位。
注意：操作过程中需佩戴无菌外科手套，并保持无菌操作技术。仅接触无菌表面和无菌物品，例如无菌手术单和经高压灭菌的器械。由助手调节照明、打开缝合线包装， 等等。 - 使用15号手术刀，在背侧颅骨大部分区域做矢状正中切口。用有齿镊将切口右侧的皮肤向侧方牵开，以暴露右侧顶骨。
- 使用已灭菌的4 mm金刚石涂层环钻钻头安装在钻机上，在顶骨上钻出骨缺损。注意勿穿透骨层进入硬脑膜。图4)
- 将支架植入缺损处，然后用连续尼龙缝线缝合皮肤切口。
- 监测小鼠，并根据机构指南提供标准的术后护理。
- 将小鼠置于干净的纸巾上，并放入清洁的笼子中使其恢复。笼子的一半应放置在循环温水加热垫上。 小鼠最初应被放置在此侧。
- 在小鼠恢复到能够自主行走的意识水平之前，不得使其无人看管。接受手术的小鼠在完全恢复之前，不得放回与其他小鼠共用的笼具中。
- 对每种待测试的支架材料，均需使用新的小鼠重复上述步骤。每次手术之间，使用高温珠灭菌器或其他合适方法对手术器械进行灭菌。
- 手术后立即进行，随后在第2、4、6和8周，采用微型CT扫描分析颅骨缺损闭合速率。
注意：参见 Levi 的文章 等6 有关颅骨缺损的显微CT扫描描述。 - 实验结束后，将小鼠放入洁净的安乐死舱内，以每分钟2 L的流速通入二氧化碳气体进行安乐死。待呼吸完全停止（约10分钟后），行颈椎脱位以确认死亡。
- 实验结束后，可选择通过切片和组织学染色来评估缺损区域内的骨形成情况。
注意：参见 McArdle 的文章 等12 有关制备组织学用骨标本的详细步骤，请参见组织学技术手册，例如 外科病理学手册15.
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结果
手术当天进行的微型CT扫描将清晰显示颅骨缺损。此时，在4 mm的缺损区域内尚无组织长入。随后在不同时间点获取扫描图像，用于定量分析缺损随时间变化的大小，并与基线水平进行比较。接种BMPR-IB+细胞的缺损区域应表现出比BMPR-IB-细胞和未分选细胞更快的缺损闭合（图5）。此外，含有缺损的颅骨部分可经脱钙处理，并采用标准方法制备组织学切片12。经Movat五色染色的切片将显示，与其它细胞群体相比，接受BMPR-IB细胞治疗的缺损区域骨再生程度更高（图6）。
图1：PBS洗涤后的脂肪抽吸物...
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讨论
方案中的关键步骤
在收获ASCs时，关键步骤是使用胶原酶对脂肪进行充分消化。消化不充分将导致ASCs的得率降低。在对BMPR-IB+细胞进行FACS分选时，准确定义阳性门控范围至关重要。门控范围设置过宽可能导致分选出的细胞群体纯度不足。在制作颅骨缺损模型时，关键是要将缺损部位钻透颅骨骨质，但不得深入至硬脑膜。否则将引起大量出血并暴露脑组织，从而需要对动物实施安乐死。
修改与故障排除
关于颅骨缺损手术的麻醉，我们实验室倾向于使用吸入式异氟烷，但另一种选择是腹腔注射含有终浓度为10 mg/mL氯胺酮和1 mg/mL赛拉嗪的生理盐水混合物。该混合物的标准剂量为每30 g小鼠300 µL。此方法可提供约30分钟可靠的麻醉效果，且手术过程中无需将小鼠置于异氟烷鼻罩中。使用注射麻醉的缺点在于，一旦完成注射便无法再调整剂量。相比之下，吸入式异氟烷可在术中实时灵活调节剂量高低。
将细胞悬液加入支架时，研究人员可能会发现液体体积过小，在30分钟孵...
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披露
作者无任何披露事项。
致谢
C.D.M. 获得了美国外科医师学会（ACS）住院医师研究奖学金的支持。M.S.H. 获得了加州再生医学研究所（CIRM）临床研究员培训基金 TG2-01159 的支持。M.S.H.、H.P.L. 和 M.T.L. 获得了美国颌面外科医师学会（ASMS）/颌面外科医师基金会（MSF）研究资助奖的支持。H.P.L. 获得了美国国立卫生研究院（NIH）基金 R01 GM087609 以及 Ingrid Lai 和 Bill Shu 为纪念 Anthony Shu 捐赠的资助。H.P.L. 和 M.T.L. 获得了 Hagey 儿科再生医学实验室和Oak基金会的支持。M.T.L. 获得了美国国立卫生研究院（NIH）基金 U01 HL099776、R01 DE021683-01 和 RC2 DE020771 的支持。D.C.W. 获得了美国国立卫生研究院（NIH）基金 1K08DE024269、Hagey 儿科再生医学实验室以及斯坦福大学儿童健康研究所教师学者奖的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100 微米细胞筛 | Falcon | 352360 | |
| 15 号手术刀片 | Miltex | 4-515 | |
| 24 孔板 | Corning | 3524 | |
| 40 微米细胞筛 | Falcon | 352340 | |
| 50 mL 圆锥形离心管 | Falcon | 352098 | |
| 6-0 Ethilon 尼龙缝线，18"，P-3 针头 | Ethicon | 1698G | |
| 抗 BMPR-IB 一抗 | R&D systems | FAB5051A | |
| BioGel PI 外科手套 | Mölnlycke Health Care | ALA42675Z | |
| 缓释型布托啡诺 | ZooPharm | ||
| Castro-Viejo 缝合针持 | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| CD1 裸鼠 | Charles River | 086 | |
| II 型胶原酶粉末 | Gibco | 17101-015 | |
| DMEM 培养基 | Gibco | 10564-011 | |
| 钻头：4.0 mm 环形刀 | Xemax Surgical | CK40 | |
| 钻头：Z500 无刷微型电机 | NSK | NSKZ500 | |
| FBS | Gibco | 10437-077 | |
| Fisherbrand 吸水垫，20" × 24" | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Fisherbrand 无菌棉纱布垫，4" × 4" | Fisher Scientific | 22-415-469 | |
| 加热垫 | Kent Scientific | DCT-20 | |
| Hyclone 199/EBSS 培养基 | GE Life Sciences | SH30253.01 | |
| Isothesia 异氟烷 | Henry Schein | 050033 | |
| 带齿微型镊 | Roboz | RS-5150 | |
| 带齿微型镊 | Roboz | RS-5150 | |
| 石蜡膜（Parafilm） | Bemis | PM996 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| 青链霉素双抗（Pen-Strep） | Gibco | 15140-122 | |
| PLGA 支架 | 专有配方 | ||
| 泊洛沙姆 188，10% | Sigma | P5556-100ML | |
| 带衬里无菌手术单，18" × 24" | Busse Hospital Disposables | 696 | 裁剪出适当尺寸的矩形开口 |
| 多聚蔗糖溶液：Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | |
| 聚维酮碘消毒液 | Medline | MDS093944H | |
| Puralube 石蜡油眼膏，1/8 盎司管装 | Dechra Veterinary Products | ||
| 红细胞裂解缓冲液 | Sigma | 11814389001 | |
| Webcol 酒精消毒棉片 | Covidien | 6818 |
参考文献
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