小鼠中肾管的器官培养与整体免疫荧光染色

摘要

我们介绍了一种分离和培养小鼠中肾管（WD）的方法。同时，我们还展示了使用荧光标记抗体对培养后或新鲜分离的中肾管进行整体免疫染色的详细操作步骤。这些技术相结合，可实现对中肾管发育、盘绕及分化过程的研究。

摘要

输卵管形态发生是大多数哺乳动物器官发育的基本要求，包括雄性生殖系统。附睾作为雄性生殖道的重要组成部分，负责精子的储存、成熟和运输。成年附睾是一条高度盘绕的管道，起源于一种简单而笔直的胚胎前体结构，称为中肾管（Wolffian duct, WD）。附睾的正常盘绕对雄性生育能力至关重要，因为睾丸中的精子尚不具备使卵子受精的能力。然而，附睾发育与盘绕的机制仍不明确，部分原因在于缺乏完整的器官培养与成像方法。在本研究中，我们描述了一种体外（in vitro）培养系统及整体免疫荧光染色方案，可更清晰地观察中肾管盘绕与发育过程，该方法也可应用于其他管状器官的研究。

引言

雄性生殖系统主要由睾丸（生精细胞发育和分化的场所）以及一个复杂的导管系统组成，后者负责精子的成熟、运输和储存。附睾是一种连接睾丸与输精管的管状器官，主要参与睾丸后生精细胞的发育与成熟¹。成年小鼠高度盘绕的附睾由一条简单而笔直的前体导管——中肾管（Wolffian duct, WD）发育而来¹。附睾复杂的盘绕结构对于精子获得受精能力至关重要²。然而，目前对这一影响雄性生育能力的关键器官如何发育并形成其特定形态仍缺乏充分理解。已有研究表明，多种信号通路参与了中肾管的发育过程，例如Wnt信号通路^3,4和雄激素信号通路⁵。我们近期的研究已证实，产前发育过程中中肾管盘绕依赖于Wnt信号的平衡 ⁴。然而，仍需进一步研究以阐明出生后附睾盘绕的机制、附睾上皮细胞的分化过程，以及上皮细胞之间和上皮细胞与间质细胞之间的细胞间通讯。

转基因小鼠模型已被证实是识别和验证多种器官系统发育及疾病相关分子机制的有力工具 ⁶尽管转基因小鼠模型被广泛使用，但其仍存在显著局限性，包括：靶向突变小鼠的表型与预期基因功能不符，某些模型中基因敲除突变体无表型，遗传和环境因素的影响，以及小鼠模型构建过程耗时耗力。因此，仅基于转基因小鼠模型所得结果的意义解读并不总是一目了然 ⁶这些局限性可通过使用 体外 器官培养系统，可....

方案

动物护理和实验操作均遵循纽卡斯尔大学动物护理与伦理委员会的指南，并符合新南威尔士州动物研究法、新南威尔士州动物研究条例以及《澳大利亚科学用途动物护理与使用规范》。所有在小鼠上进行的操作均经纽卡斯尔大学动物护理与伦理委员会批准。

1. 定时交配

1. 在光照周期即将结束前，将6至8周龄的雄性和雌性小鼠进行配对。
2. 每天清晨（上午8:00或更早）检查雌鼠是否有阴道栓存在。发现阴道栓的当天记为0.5 dpc（days post coitum）。
3. 将带有阴道栓的雌鼠转移至新笼子（不带雄鼠），并标记发现阴道栓的日期。

2. 小鼠胚胎性腺嵴的分离

1. 按照文献⁹所述方法并稍作修改，从15.5 dpc 妊娠雌鼠中分离小鼠胚胎性腺嵴。
2. 应在中午之前完成解剖，因为妊娠雌鼠在下午即被视为进入妊娠的下一天 。
3. 采用颈椎脱臼法（或根据机构动物伦理委员会批准的方案）处死15.5 dpc 妊娠雌鼠。
4. 将小鼠仰卧置于吸水性纸巾上，并用70%乙醇喷洒腹部腹侧。
5. 用镊子提起下腹部皮肤（腹侧），使用手术剪沿侧向切开，从泌尿生殖孔延伸至肋骨末端。将皮肤向动物头部方向拉开，以暴露腹部。
6. 用手术剪剪开腹肌以暴露腹膜腔。用镊子....

结果

在发育过程中，输尿管芽（WD）经历显著变化，从一个简单且笔直的管道转变为高度复杂且盘绕的导管结构。利用上述方法，在体外培养条件下，WD也经历了类似的变化。本文展示了输尿管芽在培养3天后的结果（图3为了研究参与WD形态发生的分子机制，可在培养基中添加针对不同信号通路的抑制剂和激活剂。 图3C 在含有Wnt信号通路特异性抑制剂IWR1的条件下培养3天后，显示WD未盘绕 ¹⁰。箭头标记卷曲（图3B）和未缠绕的WDs（图3A 和 C) 表明Wnt信号通路的抑制会导致WD盘绕受阻（图3C因此，该培养系统可用于解析WDs（或其他器官）发育过程中涉及的分子机制。

为了标记不同类型的细胞，我们对WDs进行了整体免疫染色图4)。本文展示了验证该方案用于标记细胞骨架、细胞质和细胞核蛋白的数据。 图 4A 显示了培养三天的WDs（箭头标记）细胞角蛋白8.......

讨论

器官培养系统相较于传统细胞培养系统具有诸多优势。该系统可保留不同类型细胞之间原有的结构关系和相互作用，能够模拟 体内 相较于缺乏微环境因素的细胞培养研究，类器官培养系统能提供更准确的信息，甚至比使用整体动物还具优势。这些优势包括使用整体动物的成本较高，而类器官培养系统则易于护理和维护。 等等。 此外，可在离体或培养的器官上测试多种药理学试剂或药物，从而研究器官本身的直接反应，而非整个机体的反应。

要成功培养胚胎期肾单位（WDs），需考虑若干关键步骤。组织采集时必须小心操作，避免破坏其完整性，因为受损的组织生长不良且易形成囊肿。滤膜表面培养基过多也会导致肾单位出现囊性生长。我们在组织培养超净台外进行组织分离和培养，未发生任何污染。培养基的配制及添加至24孔板的操作在组织培养超净台内完成。因此，只要采用适当技术、操作迅速并采取必要预防措施，在超净台外采集的肾单位仍可无污染地进行培养。收获培养后的组织时应格外小心，因其极为脆弱，不可直接用镊子夹取。应使用镊子两臂之间形成的薄层PBS液体将组织轻轻拾起。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24孔板	Corning, USA	3524	可从其他供应商购买
Hank’s平衡盐溶液（HBSS）	GE Healthcare Life Sciences, USA	SH30031.02	可从其他供应商购买
杜尔贝科改良伊格尔培养基：营养混合物F-12（DMEM/F12）	Sigma, USA	D8437	使用前在37 °C水浴中预热
胎牛血清（FBS）	Interpath,  澳大利亚	SH30034.02	培养基中使用10% FBS
L-谷氨酰胺	GE Healthcare Life Sciences, USA	SH30034.01	使用浓度为1%
青霉素/链霉素	Gibco, USA	15070-063	使用浓度为1%
Whatman Nuclepore 聚碳酸酯径迹蚀刻膜	Whatman, USA	110409	膜（0.8 µm）
IWR1	Sigma, USA	10161-5mg	使用浓度为100 µM
多聚甲醛（PFA）	Electron Microscopy Sciences, USA	15710	储备液为16%，使用时配制成PBS中4%。有毒——需戴手套操作，且 不可排入水槽
乙醇	Thermo Scientific Fisher, USA	214-20L PL	纯乙醇，用超纯水配制25%、50%和75%溶液
Tween-20	Thermo Scientific Fisher, USA	2509-500ml	黏度高，分装时需小心
曲拉通X-100	Sigma, USA	T8787-50ml	黏度高，分装时需小心
磷酸氢二钠	Thermo Scientific Fisher, USA	621-500mg	可从其他供应商购买
磷酸二氢钠	Ajax Finechem, USA	4745-500g	可从其他供应商购买
氯化钠	Thermo Scientific Fisher, USA	465-500g	可从其他供应商购买
细胞角蛋白8/Troma I	发育研究杂交瘤库，美国（DHSB）	TROMA-I	封闭液中稀释1:250
活化 β连环蛋白	Cell Signalling Technology,  USA	D13A1	封闭液中稀释1:200
磷酸化组蛋白3	Millipore, MA, USA	06-570	封闭液中稀释1:200
Alexa488 山羊抗兔IgG	Jackson ImmunoResearchLabs,  USA	111-545-047	封闭液中稀释1:250
Alexa594 山羊抗大鼠IgG	Jackson ImmunoResearchLabs,  USA	112-585-072	封闭液中稀释1:250
甘油	Thermo Fisher Scientific, USA	242-500ml	可从其他供应商购买
正丙基没食子酸酯	Sigma, USA	2370	-
2-(4-脒基苯基)-1H-吲哚-6-甲脒（DAPI）	Sigma, USA	D9564-10mg	用于核酸（DNA）染色
二甲基亚砜（DMSO）	Thermo Fisher Scientific, USA	2225-500ml	溶剂
盖玻片（24 × 50 mm）	Lomb Scientific	CS24501GP	-