我们介绍了一种分离和培养小鼠中肾管（WD）的方法。同时，我们还展示了使用荧光标记抗体对培养后或新鲜分离的中肾管进行整体免疫染色的详细操作步骤。这些技术相结合，可实现对中肾管发育、盘绕及分化过程的研究。
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摘要
摘要
输卵管形态发生是大多数哺乳动物器官发育的基本要求，包括雄性生殖系统。附睾作为雄性生殖道的重要组成部分，负责精子的储存、成熟和运输。成年附睾是一条高度盘绕的管道，起源于一种简单而笔直的胚胎前体结构，称为中肾管（Wolffian duct, WD）。附睾的正常盘绕对雄性生育能力至关重要，因为睾丸中的精子尚不具备使卵子受精的能力。然而，附睾发育与盘绕的机制仍不明确，部分原因在于缺乏完整的器官培养与成像方法。在本研究中，我们描述了一种体外（in vitro）培养系统及整体免疫荧光染色方案，可更清晰地观察中肾管盘绕与发育过程，该方法也可应用于其他管状器官的研究。
引言
雄性生殖系统主要由睾丸（生精细胞发育和分化的场所）以及一个复杂的导管系统组成，后者负责精子的成熟、运输和储存。附睾是一种连接睾丸与输精管的管状器官，主要参与睾丸后生精细胞的发育与成熟1。成年小鼠高度盘绕的附睾由一条简单而笔直的前体导管——中肾管（Wolffian duct, WD）发育而来1。附睾复杂的盘绕结构对于精子获得受精能力至关重要2。然而，目前对这一影响雄性生育能力的关键器官如何发育并形成其特定形态仍缺乏充分理解。已有研究表明，多种信号通路参与了中肾管的发育过程，例如Wnt信号通路3,4和雄激素信号通路5。我们近期的研究已证实，产前发育过程中中肾管盘绕依赖于Wnt信号的平衡 4。然而，仍需进一步研究以阐明出生后附睾盘绕的机制、附睾上皮细胞的分化过程，以及上皮细胞之间和上皮细胞与间质细胞之间的细胞间通讯。
转基因小鼠模型已被证实是识别和验证多种器官系统发育及疾病相关分子机制的有力工具 6尽管转基因小鼠模型被广泛使用，但其仍存在显著局限性，包括：靶向突变小鼠的表型与预期基因功能不符，某些模型中基因敲除突变体无表型，遗传和环境因素的影响，以及小鼠模型构建过程耗时耗力。因此，仅基于转基因小鼠模型所得结果的意义解读并不总是一目了然 6这些局限性可通过使用 体外 器官培养系统，可在受控的培养条件下实时灵活操控多种信号通路。该系统对于研究完整器官的生理学与病理学具有重要作用 7此外，对经荧光标记抗体染色的完整器官进行成像，可使我们能够在三维环境中可视化目标标志物，正如其真实存在状态所示 体内 从而更深入地理解器官的形态、结构和功能 8.
本文描述了小鼠胚胎性腺隆起的分离方法， 体外 培养 以及对输尿管芽进行整体免疫荧光成像，可用于回答有关输尿管芽等管状器官形态发生过程中的多种问题。在本方案中，我们从交配后15.5天（dpc）的孕鼠中分离出胚胎期泌尿生殖嵴，并进行为期3天的培养 随后进行免疫染色，检测上皮细胞标志物（细胞角蛋白8，CK8）、细胞增殖标志物（磷酸化组蛋白3，PH3）以及活化型β-catenin。
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方案
动物护理和实验操作均遵循纽卡斯尔大学动物护理与伦理委员会的指南，并符合新南威尔士州动物研究法、新南威尔士州动物研究条例以及《澳大利亚科学用途动物护理与使用规范》。所有在小鼠上进行的操作均经纽卡斯尔大学动物护理与伦理委员会批准。
1. 定时交配
- 在光照周期即将结束前，将6至8周龄的雄性和雌性小鼠进行配对。
- 每天清晨（上午8:00或更早）检查雌鼠是否有阴道栓存在。发现阴道栓的当天记为0.5 dpc（days post coitum）。
- 将带有阴道栓的雌鼠转移至新笼子（不带雄鼠），并标记发现阴道栓的日期。
2. 小鼠胚胎性腺嵴的分离
- 按照文献9所述方法并稍作修改，从15.5 dpc 妊娠雌鼠中分离小鼠胚胎性腺嵴。
- 应在中午之前完成解剖，因为妊娠雌鼠在下午即被视为进入妊娠的下一天 。
- 采用颈椎脱臼法（或根据机构动物伦理委员会批准的方案）处死15.5 dpc 妊娠雌鼠。
- 将小鼠仰卧置于吸水性纸巾上，并用70%乙醇喷洒腹部腹侧。
- 用镊子提起下腹部皮肤（腹侧），使用手术剪沿侧向切开，从泌尿生殖孔延伸至肋骨末端。将皮肤向动物头部方向拉开，以暴露腹部。
- 用手术剪剪开腹肌以暴露腹膜腔。用镊子夹住子宫颈上方的妊娠子宫并剪开。然后握住膀胱提起子宫，剪断子宫阔韧带，再在子宫输卵管交界处进行剪切，使子宫脱离腹膜附着。
- 将子宫转移至含有冰上预冷的HBSS（Hank's平衡盐溶液）的50 mL离心管中。用冰上预冷的HBSS轻轻冲洗妊娠子宫，以去除多余血液。
- 将子宫置于含有冰上预冷HBSS的培养皿中并保持在冰上。切开子宫壁，取出胚胎，并将胚胎置于另一盛有HBSS并置于冰上的新鲜培养皿中。
- 取一张洁净无菌的纸巾，铺在新的培养皿中，并喷洒70%乙醇。将胚胎侧向放置于该纸巾上，使用无菌刀片沿图1中虚线所示方向从下腹部切开。
- 用针固定脊柱，将胚胎固定在无菌海绵基座上。
- 将其置于解剖体视显微镜下，沿腹侧中线小心剪开。移除肝脏和肠道。此时应可见小鼠泌尿生殖系统（肾脏、输尿管、睾丸、Wolffian管及输精管）。
- 切除睾丸和Wolffian管，并将其置于盛有HBSS并置于冰上的新鲜培养皿中。取出Wolffian管和睾丸时，需在输精管与尿道连接处附近剪断，并剪断Wolffian管下部与引带之间的连接。
- 将同组胚胎的睾丸和Wolffian管合并收集（具体分组可根据实验设计而定）。
3. 胚胎性腺嵴的培养（图2）
- 通过在DMEM/F12培养基中添加10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素和1% L-谷氨酰胺，配制用于培养胚胎性腺嵴的培养基。将培养基在水浴中预热至37 °C。
- 向24孔细胞培养板的每孔中加入300 µL培养基。
- 取一个新的培养皿，在其中滴加少量无菌HBSS。将一张聚碳酸酯核孔膜（0.8 µm）置于HBSS液滴上，使其 光亮面朝向HBSS。
- 使用洁净的镊子将两根WDs和性腺放置在膜的粗糙面（朝上），并用无菌擦拭纸或吸水纸尽可能吸除多余的HBSS。切勿用吸水纸接触组织，否则会损伤组织。
- 确保WDs与性腺之间互不接触，否则在后续孵育过程中它们会粘连在一起。
- 将带有组织的膜转移至含有300 µL培养基的24孔板孔中，在气液界面进行培养。膜上培养基过多会导致WDs出现囊状生长。
- 将培养板置于37 °C、含5% CO2的培养箱中孵育。
- 每天更换培养基。使用移液器更换培养基时，先将孔中的旧培养基吸出，再加入300 µL预热的新鲜培养基。
注意：若需研究不同信号通路对WD形态发生的影响，可将相应浓度的化学激活剂和/或抑制剂加入培养基中。 - 培养组织3天。来自15.5 dpc 胚胎的未盘绕WDs在3天内可转变为高度盘曲的管状结构（图3B）。加入Wnt抑制剂IWR1 后，WDs的盘绕过程受到抑制（图3C）。
- 收获组织时，准备一个盛有冰冻PBS的培养皿。将培养后的性腺和WD连同膜一起转移至该培养皿中。膜会漂浮在PBS表面，轻压使其沉入PBS，然后取出性腺和WD。
- 用4%多聚甲醛（PFA）在4 °C过夜或在室温下固定1小时。如需，可在固定前拍摄WDs的明场图像。
4. 全胚胎免疫荧光染色
- 在室温下，用 PBS-T（PBS + 1% Triton X-100）轻轻振荡洗涤固定组织，每次 10 分钟，共洗涤 3 次。
- 在 4 °C 条件下，用梯度乙醇（25%、50%、75% 和 100%）对组织进行脱水处理，每步 10 分钟，同时轻轻振荡（约 30 rpm）。此步骤中，组织可在 75% 乙醇中于 4 °C 保存。
- 更换乙醇时，静置组织 2 分钟使其沉降，尽可能吸除上清液，然后加入下一浓度更高的乙醇。为避免损伤组织，移液器吸头在任何阶段均不得接触组织。
- 脱水完成后，在 4 °C 条件下，用梯度乙醇（100%、75%、50% 和 25%）对组织进行复水处理，每步 10 分钟，同时轻轻振荡。
- 用 PBS-T（PBS + 0.1% Triton X-100）在室温下轻轻振荡洗涤组织 4 次，每次 20 分钟（约 30 rpm）。
- 用封闭缓冲液（PBS + 1% BSA + 0.2% 脱脂奶粉 + 0.3% Triton X-100）在室温下封闭组织 1 小时。
- 封闭后，将组织转移至一抗溶液（用封闭缓冲液稀释）中，于 4 °C 轻轻振荡孵育过夜 （约 30 rpm）。所用一抗的稀释比例详见材料表。
- 次日，用 PBS-MT（PBS + 2% 脱脂奶粉 + 0.5% Tween-20）在室温下轻轻振荡洗涤组织 4 次，每次 30 分钟（约 30 rpm）。
- 完成上述洗涤步骤后，将二抗按 1:250 的比例（此步骤需根据具体抗体进行优化）溶于封闭缓冲液中，加入组织并室温孵育 1 小时，同时轻轻振荡。
- 从此时起，需用铝箔覆盖组织以避光，因为二抗标记的荧光染料对光敏感。
- 用 PBS-T（PBS + 0.1% Tween-20）轻轻振荡洗涤组织 3 次，每次 30 分钟 。
- 准备载玻片以封片染色后的组织。
- 为此，使用金刚石笔将盖玻片切割成细条，并用指甲油将两条细条叠加粘附于载玻片上，形成两个边界，将组织置于两边界之间。
- 加入含 DAPI 的封片剂，盖上盖玻片，并在盖玻片四角涂抹指甲油以固定。
注意：组织现已准备好用于成像。将这些载玻片于 -20 °C 保存。
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结果
在发育过程中，输尿管芽（WD）经历显著变化，从一个简单且笔直的管道转变为高度复杂且盘绕的导管结构。利用上述方法，在体外培养条件下，WD也经历了类似的变化。本文展示了输尿管芽在培养3天后的结果（图3为了研究参与WD形态发生的分子机制，可在培养基中添加针对不同信号通路的抑制剂和激活剂。 图3C 在含有Wnt信号通路特异性抑制剂IWR1的条件下培养3天后，显示WD未盘绕 10。箭头标记卷曲（图3B）和未缠绕的WDs（图3A 和 C) 表明Wnt信号通路的抑制会导致WD盘绕受阻（图3C因此，该培养系统可用于解析WDs（或其他器官）发育过程中涉及的分子机制。
为了标记不同类型的细胞，我们对WDs进行了整体免疫染色图4)。本文展示了验证该方案用于标记细胞骨架、细胞质和细胞核蛋白的数据。 图 4A 显示了培养三天的WDs（箭头标记）细胞角蛋白8...
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讨论
器官培养系统相较于传统细胞培养系统具有诸多优势。该系统可保留不同类型细胞之间原有的结构关系和相互作用，能够模拟 体内 相较于缺乏微环境因素的细胞培养研究，类器官培养系统能提供更准确的信息，甚至比使用整体动物还具优势。这些优势包括使用整体动物的成本较高，而类器官培养系统则易于护理和维护。 等等。 此外，可在离体或培养的器官上测试多种药理学试剂或药物，从而研究器官本身的直接反应，而非整个机体的反应。
要成功培养胚胎期肾单位（WDs），需考虑若干关键步骤。组织采集时必须小心操作，避免破坏其完整性，因为受损的组织生长不良且易形成囊肿。滤膜表面培养基过多也会导致肾单位出现囊性生长。我们在组织培养超净台外进行组织分离和培养，未发生任何污染。培养基的配制及添加至24孔板的操作在组织培养超净台内完成。因此，只要采用适当技术、操作迅速并采取必要预防措施，在超净台外采集的肾单位仍可无污染地进行培养。收获培养后的组织时应格外小心，因其极为脆弱，不可直接用镊子夹取。应使用镊子两臂之间形成的薄层PBS液体将组织轻轻拾起。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢妇科肿瘤学组成员对本文稿的审阅。本工作部分得到了澳大利亚国家卫生与医学研究委员会、澳大利亚研究理事会以及新南威尔士州癌症研究所（P.S.T）的资助。M.K. 获得了纽卡斯尔大学研究生研究奖学金。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 24孔板 | Corning, USA | 3524 | 可从其他供应商购买 |
| Hank’s平衡盐溶液（HBSS） | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30031.02 | 可从其他供应商购买 |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基：营养混合物F-12（DMEM/F12） | Sigma, USA | D8437 | 使用前在37 °C水浴中预热 |
| 胎牛血清（FBS） | Interpath, 澳大利亚 | SH30034.02 | 培养基中使用10% FBS |
| L-谷氨酰胺 | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30034.01 | 使用浓度为1% |
| 青霉素/链霉素 | Gibco, USA | 15070-063 | 使用浓度为1% |
| Whatman Nuclepore 聚碳酸酯径迹蚀刻膜 | Whatman, USA | 110409 | 膜（0.8 µm） |
| IWR1 | Sigma, USA | 10161-5mg | 使用浓度为100 µM |
| 多聚甲醛（PFA） | Electron Microscopy Sciences, USA | 15710 | 储备液为16%，使用时配制成PBS中4%。有毒——需戴手套操作，且 不可排入水槽 |
| 乙醇 | Thermo Scientific Fisher, USA | 214-20L PL | 纯乙醇，用超纯水配制25%、50%和75%溶液 |
| Tween-20 | Thermo Scientific Fisher, USA | 2509-500ml | 黏度高，分装时需小心 |
| 曲拉通X-100 | Sigma, USA | T8787-50ml | 黏度高，分装时需小心 |
| 磷酸氢二钠 | Thermo Scientific Fisher, USA | 621-500mg | 可从其他供应商购买 |
| 磷酸二氢钠 | Ajax Finechem, USA | 4745-500g | 可从其他供应商购买 |
| 氯化钠 | Thermo Scientific Fisher, USA | 465-500g | 可从其他供应商购买 |
| 细胞角蛋白8/Troma I | 发育研究杂交瘤库，美国（DHSB） | TROMA-I | 封闭液中稀释1:250 |
| 活化 β连环蛋白 | Cell Signalling Technology, USA | D13A1 | 封闭液中稀释1:200 |
| 磷酸化组蛋白3 | Millipore, MA, USA | 06-570 | 封闭液中稀释1:200 |
| Alexa488 山羊抗兔IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, USA | 111-545-047 | 封闭液中稀释1:250 |
| Alexa594 山羊抗大鼠IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, USA | 112-585-072 | 封闭液中稀释1:250 |
| 甘油 | Thermo Fisher Scientific, USA | 242-500ml | 可从其他供应商购买 |
| 正丙基没食子酸酯 | Sigma, USA | 2370 | - |
| 2-(4-脒基苯基)-1H-吲哚-6-甲脒（DAPI） | Sigma, USA | D9564-10mg | 用于核酸（DNA）染色 |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Thermo Fisher Scientific, USA | 2225-500ml | 溶剂 |
| 盖玻片（24 × 50 mm） | Lomb Scientific | CS24501GP | - |
参考文献
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