通过DNA含量测定进行哺乳动物全基因组复制时间的确定

摘要

本文介绍一种相对快速且简便的方法，用于绘制哺乳动物全基因组复制时间图谱，涵盖从细胞分离到测序结果基础分析的全过程。按照本方案操作后，将获得一份代表性复制程序的基因组图谱。

摘要

基因组的复制发生在细胞周期的S期，这是一个受到高度调控的过程，以确保DNA复制的保真度。每个基因组区域在S期通过多个复制起点的同时激活而于特定时间进行复制。复制时间（ToR）与许多基因组和表观遗传特征相关联，并与突变率及癌症的发生有关。全面理解健康与疾病状态下基因组复制程序的完整图景，是未来的重要目标和挑战。

本文详细描述了"通过S期与G1期拷贝数比率绘制基因组复制时间图谱"的方法（以下简称：CNR-ToR），这是一种用于绘制哺乳动物细胞全基因组复制时间（ToR）图谱的简便方法。该方法基于S期细胞与G1期细胞之间的DNA拷贝数差异。CNR-ToR方法共分为6个步骤：1. 细胞准备并用碘化丙啶（PI）染色；2. 利用荧光激活细胞分选技术（FACS）分选G1期和S期细胞；3. DNA纯化；4. 超声破碎；5. 文库构建与测序；以及6. 生物信息学分析。CNR-ToR方法操作快速简便，可获得高分辨率的DNA复制图谱。

引言

哺乳动物的DNA复制受到严格调控，以确保在细胞周期中每条染色体精确地复制一次。复制按照高度有序的时序进行——多个较大的基因组区域（约兆碱基级别）在S期早期开始复制（称为早期复制区），而其他基因组区域则在S期中晚期复制（称为中期和晚期复制区）¹。大部分基因组在所有组织中的复制时间相同（称为组成型复制时序区），而约30%至50%的基因组区域在不同组织之间²、细胞分化过程中^3,4，以及在较小程度上的癌症转化过程中⁵，其复制时序会发生改变。此外，某些基因组区域表现为异步复制^6,7,8，即两个等位基因之间的复制时序存在差异。

ToR 与多种基因组和表观基因组特征相关，包括转录水平、GC 含量、染色质状态、基因密度 等等。^1,9ToR 还与突变率和突变类型相关¹⁰<....

方案

注意：ToR 只能在生长中的非同步细胞上进行测量。实验应从至少 1 - 2 × 10⁶ 个快速生长的细胞开始，通常可获得约 1 × 10⁵ 个处于 S 期的细胞（这是限速步骤）。建议每个实验设置两到三个重复。CNR-ToR 的整个流程可在一周内完成——前两天用于完成文库构建前的所有步骤，一到两天用于测序，另需一天进行初步数据分析。

1. 从培养物中收集细胞

注意：本实验方案适用于在10 cm培养皿中培养的细胞（细胞数量约为2 - 5 × 10⁶个），但可轻松调整用于其他培养平台。

1. 对于悬浮培养的细胞，直接进行固定（第2节）。
2. 对于贴壁细胞，吸除液体，并用 3 mL 不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 PBS 洗涤培养板。
3. 弃去 PBS，加入 1 mL 商品化胰蛋白酶-EDTA 溶液，37 °C 孵育 5 分钟，直至细胞脱落。
   注意：胰蛋白酶处理时间应根据细胞类型进行调整。
4. 加入 3 mL 培养基以中和胰蛋白酶，将细胞收集至 15 mL 圆锥形离心管或 5 mL 聚苯乙烯管中，置于冰上保存。

2. 固定

....

结果

典型的ToR图谱如图所示 图3 用于小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）。该图展示了分析过程，因为它同时显示了点状图（代表各个窗口的标准化S/G1比值，步骤8.3）和经三次平滑与插值处理后得到的曲线（步骤8.5）。

这类图谱可揭示复制程序的组织方式，该程序由两种类型的复制时间（ToR）区域拼接而成：i）大规模区域（数量级为兆碱基），在S期的早期、中期或晚期同时进行复制（CTR = 复制时间恒定区域）；以及 ii）复制时间转换区域（TTR），在这些区域中复制时间逐渐变化。CTR通过TTR相互连接，这两类复制组织共同覆盖整个基因组。

尽管ToR定位所用的测序覆盖度相对较低（每300 bp一个读段），所获得的定位图仍相当稳健。图4展示了MEF细胞三组重复样本之间的ToR图谱与小.......

讨论

原则上，任何可通过流式细胞术（FACS）分离出S期和G1期的增殖性真核细胞群体均可进行CNR-ToR分析（Rhind N. 和 Gilbert DM²⁰综述）。本文所述方法已针对基因组大小约为3 Gb的哺乳动物细胞（如人和小鼠细胞）进行了优化。若需将其应用于其他真核生物，则需对CNR-ToR实验方案进行少量调整（如细胞制备和测序深度）。必须注意收集足够数量的S期细胞，因为这是限速步骤。因此，应先进行初步的细胞周期FACS分析，以确认实验的可行性，并验证S期细胞的数量。对于细胞周期不规则的细胞，建议预先用BrdU对细胞进行染色以标记分裂细胞，并按照抗BrdU试剂盒生产商的说明书操作至FACS步骤。通常情况下，细胞用10–20 µM BrdU染色30分钟。

建议每个实验设置生物学重复三次，以检测可能由细胞生长差异和分选过程不同引起的不一致结果。这对于识别不同细胞类型和条件下 ToR 图谱中的微小变化尤为重要。对于快速生长的细胞，每次重复建议使用一个 10 cm 的组织培养皿或培养瓶（含有约 2–5 × 10⁶ 个细胞.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PBS	BI (Biological Industries)	02-023-1A
胰蛋白酶-EDTA	BI (Biological Industries)	03-052-1B
15 mL 圆锥形离心管	Corning	430790
5 mL 聚苯乙烯圆底试管，带细胞筛网帽	BD-Falcon	352235
乙醇	Gadot	64-17-5
RNase-A 10 mg/mL	Sigma	R4875
碘化丙啶 1 mg/mL	Sigma	P4170
Parafilm 封口膜	Parafilm	PM-996
1.5 mL DNA LoBind Eppendorf 管	Eppendorf	22431021
BSA	Sigma	A7906
1.7 mL MaxyClear 管	Axygen	MCT-175-C
磁珠 - Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63881
超声破碎仪	Covaris	M系列  -530092
50 µL microTUBE AFA 纤维螺口管 6 x 16 mm	Covaris	520096
Qubit 荧光计	Invitrogen
Qubit dsDNA 高灵敏度（HS）检测试剂盒	Invitrogen	Q32854
电泳 2200 TapeStation 系统	Agilent	D1000 ScreenTape
测序 - Illumina NextSeq 系统	Illumina	SY-415-1001
DNeasy DNA 纯化试剂盒	Qiagen	69504
PureProteom 磁力架	Millipore	LSKMAGS08
抗 BrdU/FITC 抗体	DAKO	F7210
FACS 分选仪	BD	FACSARIA III
FACS 软件	BD	FACSDiva v 8.0.1